Name: השרשה של הפיברין גל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: למד שתלת ג'ל פיברין על ריאות עכבר לחקירת אנגיוגנזה ספציפית לריאה ותהליכי התחדשות אלוולרית. שיטה זו מאפשרת ניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי של רשתות כלי דם חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאיגוד לב אמריקאי (בבוקר), משרד הגנה האמריקאי (BC074986), ובית החולים הפקולטה פיתוח הקריירה המלגה לילדים בבוסטון (TM, בבוקר). המחברים מודים אמנדה ג&#39;יאנג ואליזבת ג&#39;יאנג לקבלת סיוע טכני.

הערה: in vivo המחקר בבעלי החיים בוצע בהתאם קפדן עם ההמלצות במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות. הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בבית החולים לילדים בבוסטון (במדבר פרוטוקול: 13-10-2526R, 14-02-2568R). כל התרופות המשמשות בפרוטוקול זה הן תרופות כיתה ותרופות אלה ערוכות בתנאים סטריליים. 1. הפיברין ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל הפיברין המכיל VEGF וbFGF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות הפשרת מניות של פיברינוגן ותרומבין המאוחסנים ב -80 ° C לטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תרומבין (ריכוז סופי: 2.5 U / ml), CaCl 2 (ריכוז סופי: 45 מ&quot;מ), VEGF (ריכוז סופי: 0-100 ng / ml) וbFGF (ריכוז סופי: 0-100 ng / ml) לפיברינוגן פתרון (ריכוז סופי: 12.5 מ&quot;ג / מיליליטר בsodiu 0.9%מ &#39;פתרון כלוריד 43-45) בצינור 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה 200 μl של התערובת על צלחת פלסטיק סטרילי בצורה טיפה חכמה באמצעות קצה פיפטה p200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הטיפות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות, עד שהם לחזק. הערה: ג&#39;ל הקרושה יכול להיות כל הזמן בצלחת הפלסטיק האטום בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) במשך כמה שעות לפני ההשתלה (איור 1 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את הג&#39;ל הפיברין לקוביות מ&quot;מ כ 3 x 3 x 3 באמצעות מספריים כירורגיות קטנים לפני ההשתלה. </li></ol> 2. עכבר הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר בוגר (8-12 שבועות) על ידי הזרקת intraperitoneal (IP) של קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם) ולאשר כי העכבר הוא מורדם כראוי על ידי צביטת הבוהן של העכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במשחת וטרינר בעיניים של העכבר כדי למנוע יובש במהלך הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פו גילוחr על הצד השמאלי של בית החזה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אינטובציה endotracheal של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על אינטובציה לעמוד בזווית ב 70 מעלות ומחזיקים את העכבר במקום ידי משדלת החותכות העליונות שלה מעל גומייה קטנה הממוקמת בחלק העליון של הדוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לחזור בו מהלשון לצד אחד באמצעות מלקחיים בוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את הגרון בעזרת פנס מיקרוסקופ מתכווננת סיבים אופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קטטר endotracheal אלסטי (21 G) לקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא נושם באופן ספונטני בצורה חלקה (100-150 נשימות / דקה רגילה, אין נשימה פרדוכסלית או רדודה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר במצב שכיבה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכאני לאוורר את העכבר באמצעות מכונת נשמה מכרסם (150 נשימות / דקה ו -7 מיליליטר / קילוגרם נפח של גאות ושפל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן צלעות לאתר שטח צלע בין 4 th ו -5 ריב ה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת שדה סטרילי מעל האזור בy נגב ביסודיות עם אלכוהול וPovidone-יוד. לכסות את שדה הניתוח כראוי עם לעטוף כירורגית סטרילית. </li></ol> 3. ניתוח עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזרקה מקומית של bupivacaine 0.25% (200 μl) בעור, לעשות חתך בעור רוחבי (כ אורך 1 סנטימטר) על מרחב הצלע באמצעות מספריים לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה של bupivacaine 0.25% (200 μl) לתוך שריר הצלע, לעשות חתך שריר בין צלעות 4 th ו-5 באמצעות מספריים קטנים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מפשק לנתח בין הצלעות כדי להמחיש את הריאה השמאלית באופן מלא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד שטח קטן (ריבוע 1 x 1 מ&quot;מ) של הצדר הקרביים של מרכז הריאה השמאלית באמצעות מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל לחץ עדין על האזור באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי עד דליפות דימום והאוויר נשלטות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים כמות קטנה של תערובת טריות של פיברינוגן / תרומבין (דבק הפיברין) (שלב 1.1.2. &amp; # 20181; יב) על האזור באמצעות קצה פיפטה p200. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות ג&#39;ל הפיברין אחד (שלב 1.2) באמצעות מלקחיים קטנים מעל האזור (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שג&#39;ל קבוע גם באזור במהלך תנועות נשימה של הריאות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאין לא דולף אוויר מאסיבי ולא דימום מהריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתכים סגורים (שכבות שרירים ועור) עם תפר נספג, שאינו צריכים להסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חלל בית החזה באמצעות מחט 27 G ומזרק 1 מיליליטר כדי למנוע pneumothorax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים אוורור מכאני. </li></ol> שחזור עכבר 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שהעכבר הוא נושם באופן ספונטני בצורה חלקה (100-150 נשימות / דקה רגילה, אין נשימה פרדוכסלית או רדודה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IP להזריק 1 מיליליטר של טרום חימם 0.9% NaCl על מנת למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר עכבר כדי להתאושש על כרית מים החמה במחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את endotracheצינור אל לאחר אישור שיש לו את העכבר נשימה יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק Meloxicam (5 מ&quot;ג / קילוגרם, הזרקה תת עורית (SC), במשך 3 ימים כמשכך כאבים שלאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על התנועות של העכבר בזהירות במינימום של 15 דקות במרווחים עד שהוא sternal (הצליח לגלגל על ​​הבטן שלה ולהישאר זקוף) ומודע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאוששות, להחזיר את העכבר לכלוב חדש מבודד מעכברים ללא ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על האתר כירורגית לסימני זיהום (אדמומיות, נפיחות, הפרשות), פונקציות הביולוגיות הבסיסיות של בעלי החיים (צריכת מזון ומים, הטלת שתן, עשיית הצרכים, עלייה במשקל גוף), כמו גם סימנים קליניים של מצוקה (piloerection, תנועה מופחתת) יומי הבאים הליך כירורגי. </li></ol> 5. קציר הריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7-30 ימים לאחר ההשתלה, להרדים את העכבר באמצעות CO 2 דרך המקור של גז דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בין הקצה של תהליך xyphoid וsternalחריץ (sternotomy חציון) וכל ריאות קציר עם ג&#39;ל המושתל לניתוח היסטולוגית וביוכימיים על ידי חיתוך קנה הנשימה ולנתח את כל החיבורים ללב, הריאות, ואת קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן ג&#39;ל המושתל עם ריאות עם 4% פתרון paraformaldehyde הלילה ב 4 מעלות צלזיוס, להטביע במתחם אוקטובר, ולקחת את חלקי צעד סידוריים של 30 מיקרומטר עובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע היסטולוגית (hematoxylin והכתים eosin) וניתוחי immunohistochemical (סמן אנדותל: CD31, סמן אפיתל: aquaporin (AQP) 5 ופעיל שטח חלבון (-B) SP) באמצעות מיקרוסקופ confocal 22,37,40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל ערימות של חלקים אופטיים (30 מיקרומטר עבים) כדי ליצור תמונות תלת-ממדיות של אנדותל ריאות ותאי האפיתל באמצעות תוכנת ניתוח תמונת 3D 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת אזורים צפויים של כלי דם חדש שנוצרו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה 46. </li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מאמר זה מציג שיטה חדשה להשתלה בביו-חומרים על פני השטח הריאות של חיים עכבר בוגר. עם מערכת זו, אנגיוגנזה נגזרת-ריאה המארח סכמה בהצלחה בתוך החומר. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לחקור crosstalk בין תאי אנדותל, תאים אחרים (לדוגמא, תאי אפיתל, תאי mesenchymal, תאי מערכת חיסון) ורכיבי ECM שונים הנדרשים לאנגיוגנזה המקומית 50-53 והתחדשות alveolar 24,54. למרות שההשתלה תת עורית הידרוג&#39;ל הקונבנציונלית in vivo כבר בשימוש נרחב למחקר אנגיוגנזה 37-39,</su...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להציג את השיטה להשתיל ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר, המאפשר לחוקרים לאפיין את המנגנונים המולקולריים של כלי דם ריאה ופיתוח alveolar, ולמנף את הידע הזה כדי לפתח חומרי biomimetic מסוגל של כלי דם ריאה משחזר פיסיולוגיים והיווצרות מכתשי לטיפול במחלות ריאה שונות. יותר מ -35 מיליון אמריקאים סובלים ממחלות ריאה כרוניות, כוללים מחלת ריאות חסימתית כרונית ופיברוזיס ריאתי. חולים אלה סימפטומים לטווח ארוך כרוניים בדרכי הנשימה כגון קוצר נשימה, לחץ בחזה, שיעול טורדני, ועייפות, שפוגעים בחיי היום היום שלהם 1-3 באופן משמעותי. למרות כמות גדולה של מאמץ לפתח טיפולים יעילים למחלות ריאה אלה, כיום אין תרופה; לכן, איכות חיים של חולים אלה היא עניה וכלכלי ועלויות אנושיות הייGH 4-7. נכון לעכשיו, השתלת ריאות היא הדרך היחידה להציל את החולים עם מחלות ריאה כרונית סופנית. עם זאת, בגלל המחסור בתורמים להשתלה, עלות גבוהה, סיבוכים חמורים, ושיעור הישרדות נמוך 8-11, השתלה היא לא גישה אופטימלית. התקדמות מהירה בטכניקות האחרונות הנדסת רקמות אפשרה לחוקרים bioengineer ריאות מושתלים על ידי אכלוס מחדש כל ריאות decellularized עם סוגים שונים של תאים או תאי גזע pluripotent מושרה (iPS) 12,13. עם זאת, ריאות bioengineered אלה הן פונקציונליות בבעלי החיים מארח רק לכמה שעות לאחר 12,14,15 השתלה. גם ניצול ביו-חומרים להתחדש מבנים ופונקציות המורכבים של ריאות היה די מוצלח. זה יכול להיות בגלל תהליכים ביולוגיים מרכזיים ששולטים בהתחדשות ריאות מבוגרים לא נחקרו היטב. בריאות, היווצרות של מערכת כלי הדם היא אחד מהאירועים המוקדמים והחשובים ביותר duriפיתוח ng והתחדשות 16-21. שהוקם זה עתה בvasculatures הריאות לא גם לספק רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להיווצרות איברים, אלא לספק אותות רגולציה מאלפות לתאים המקיפים 22-25. לפיכך, אנגיוגנזה משחקת תפקידי מפתח בalveolarization משובי בריאות מבוגרים 24,26,27. בנוסף, אנגיוגנזה deregulated תורמת למחלות ריאה כרוניות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) 28, דיספלזיה bronchopulmonary (BPD) 21-23, ופיברוזיס ריאתי 29. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להנדסת ריאות או טיפול במחלות ריאה כרוניות, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות. כל איבר מציג תכונות מכאניות וכימיות ייחודיות, אשר עשוי להיות שונה בין תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים 30-33. microenviron איבר ספציפי אלהמפעלים לווסת התנהגויות תא האנדותל ולתזמר יצירת רשת כלי דם באופן ספציפי לאיבר 24,34-36. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להתחדשות ריאות, המנגנון שבבסיס אנגיוגנזה ריאות ספציפיות צריך להיות מובן. בעוד מבחני אנגיוגנזה קונבנציונליים in vivo כגון השתלה תת עורית הידרוג&#39;ל נעשו שימוש נרחב למחקר אנגיוגנזה 37-39, שיטות אלה לא לשחזר אנגיוגנזה איבר ספציפי. לאחרונה, שיטה חדשנית להשתלת Matrigel בעובש אלסטי על ריאות העכבר פותחה והוצגה בהצלחה לגייס כלי דם ותאי האפיתל ריאות לג&#39;לים 22. גישה ייחודית זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנון של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, כמו גם יחסי גומלין בין כלי דם ותאי ריאה שאינם כלי דם בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. מאז 1) Matrigel אינו מתאים ליישום קליני; 2) הדוארעובש lastic משמש כדי להפיל את ג&#39;ל עשוי להשפיע על יחסי גומלין בין הידרוג ורקמת ריאה מארח ו -3) עובש אלסטי על הריאות שעלול להיות גורם פגיעה בתפקוד ריאות וכאב בזמן הנשימה, כגישה רלוונטית יותר מבחינה קלינית, מטריצת הפיברין 3D המכיל גורמי angiogenic (פקטור גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF) / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)) כבר מושתל על ריאות העכבר ללא יציקה בתבנית הגמישה, וסכם אנגיוגנזה המופקת ריאות מארח בהצלחה. ג&#39;ל ליפין, סיבי פולימר שנוצרו מפיברינוגן-ביקע תרומבין, ידוע למלכודת מגוון גורמי angiogenic כגון bFGF וVEGF להאיץ אנגיוגנזה in vivo 40,41. בשל יכולת ההתחדשות שלו והטבע מתכלה 42, ג&#39;ל הפיברין נעשה שימוש נרחב בתחום הנדסת רקמות. מאמר זה מציג רומן וגישה ייחודית להשתלת ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של adul חייםעכבר ולא מוכיח כי אנגיוגנזה המופקת ריאות המארח סכמה בתוך ג&#39;לי in vivo. שיטה זו, המאפשרת לחוקרים ללמוד אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, צפויה להוביל לפיתוח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה ולקדם באופן משמעותי את המאמצים לחדש ריאות מבוגרים בהצלחה.

<table><tbody><tr><td>פיברינוגן משליה אנושית</td><td>סיגמא</td><td>F4883</td><td>לייצור ג'ל פיברין</td></tr><tr><td>תרומבין מפלזמת בקר</td><td>סיגמא</td><td>T9549</td><td>לייצור ג'ל פיברין</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי VEGF 164</td><td>R& D</td><td>493-MV</td><td>לתוסף ג'ל פיברין</td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי bFGF</td><td>R& D</td><td>3139-FB</td><td>לתוספת לפיברין ג'ל</td></tr><tr><td>מעמד אינטובציה מכרסמים</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>לאינטובציה</td></tr><tr><td>מקור אור סיבים אופטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-565-35</td><td>לאינטובציה</td></tr><tr><td>21 גרם קטטר אלסטי</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>לאינטובציה</td></tr><tr><td>MiniVent מאוורר</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>CGS-8009</td><td>עבור אוורור</td></tr><tr><td>Stemi DV4 סטרומיקרוסקופ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-070-515</td><td>לניתוחים</td></tr><tr><td>תפר Absobable</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td> נוגדן <td>תפר כירורגי</td></tr><tr><td>נגד CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>נוגדן אימונוהיסטוכימיה</td></tr><tr><td>נגד AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>נוגדן אימונוהיסטוכימיה</td></tr><tr><td>נגד SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>אימונוהיסטוכימיה</td></tr></tbody></table>

השרשה של הפיברין ג&#39;ל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

התקדמות משמעותית האחרונה בטכניקות מחקר בתאי גזע וביו-הנדסה עשו התקדמות גדולה בניצול ביו-חומרים להתחדש ולתקן את הנזק ברקמות פשוטות בתחומי האורתופדים וחניכיים. עם זאת, הניסיונות לחדש את המבנה ותפקוד של איברים מורכבים יותר תלת ממדי (3D) כגון ריאות לא היה מוצלח מאוד בגלל התהליכים הביולוגיים של התחדשות איבר לא נחקרו היטב. זה הופך להיות ברור שאנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים, ממלאת תפקידי מפתח בהתחדשות איבר. שהוקם זה עתה vasculatures לספק לא רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להתחדשות איבר אלא גם לספק אותות מאלפות לרקמות המקומיות ההתחדשות. לכן, כדי להתחדש בהצלחה ריאות במבוגרים, יש צורך לשחזר את microenvironments הריאות ספציפיות שבי אנגיוגנזה התחדשות של רקמות ריאה כוננים מקומיות. למרות שיתוףnventional in vivo מבחני אנגיוגנזה, כגון השתלה תת-עורית של מטריצה ​​תאית (ECM) -rich הידרוג (למשל, ג&#39;לים הפיברין או קולגן או Matrigel - תערובת חלבוני ECM מופרש על ידי תאי סרקומה עכבר Engelbreth-הולם-נחיל), באופן נרחב מנוצל כדי לחקור את מנגנונים כלליים של אנגיוגנזה, אנגיוגנזה ריאות ספציפיות לא מאופיין היטב כי שיטות להשתלת orthotopic של ביו-חומרים בריאות לא היו מבוססות היטב. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את שיטה ייחודית להשתלת ג&#39;ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר חיים, המאפשרת לסיכום המוצלח של אנגיוגנזה-נגזר ריאות המארח בתוך הג&#39;ל. גישה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את המנגנונים שבאמצעותם מייקרו-סביבת הריאות ספציפיות שולט אנגיוגנזה והתחדשות alveolar בשני תנאים נורמלים ופתולוגיים. מאז שחרור ביו-חומרים מושתלים ולספק אותות פיסיקליים וכימיים לl הסמוךרקמות ung, השתלה של ביו-חומרים אלה על ריאות חולות עלולה לנרמל את הרקמות חולות הסמוכות, המאפשרות לחוקרים לפתח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה.

כדי לבחון האם היווצרות כלי דם המופק מריאת המארח סכמה בתוך ביו-החומרים מושתלים על הריאות, ג'לים הפיברין בתוספת VEGF הגדול angiogenic גורמים וbFGF (0, 10 ו -100 ng / ml כל אחד) היו מושתלים על פני השטח של ריאות עכבר חיים כ דיווח על שימוש ב-22 Matrigel. ג'לים הפיברין 47 המכילים גורמי גדילת angiogenic אלה היו מפוברקים כפי שמוצגים באיור 1 א. לאחר פתיחת בית החזה, באזור קטן של פני השטח הריאה השמאלי גרד באמצעות מלקחיים וג'ל הפיברין המפוברק הושתל על הר...

סיכום של המיקרו-סביבה הספציפית לאיבר, המגרה אנגיוגנזה מקומית, הוא הכרחי להתחדשות מוצלחת של רקמות פגועות. דוח זה מדגים שיטה חדשה להשתלת ג'ל פיברין על פני הריאה של עכבר חי על מנת לחקור כיצד המיקרו-סביבה הספציפית לריאה מווסתת אנגיוגנזה והתחדשות המכתשית בעכבר בוגר.

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא להשתמש בהשתלת ג'ל פיברין כדי לחקור התחדשות כלי דם ומכתשית בריאה של העכבר. זה מושג על ידי הכנה ראשונה של טיפות ג'ל פיברין, בתוספת גורמים אנגיוגניים. בשלב השני, חיית הניסוי מאווררת מכנית והחזה נפתח.לאחר מכן, ג'ל פיברין מחובר בזהירות לריאת העכבר בעזרת דבק פיברין. ואז בשלב האחרון, הריאה והג'ל המושתל נקצרים שבעה עד 30 יום לאחר מכן לניתוח היסטולוגי. בסופו של דבר, ניתן להעריך את כלי הדם והיווצרות המכתשית בתוך שתל הג'ל על ידי ניתוח אימונוהיסטוכימי.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של כלי הדם, כגון כיצד האיברים מסכנים מיקרו-סביבה, שליטה באנגיוגנזה ומורפוגנזה של איברים המדגימים את ההליך יהיה מודל עמית מהמעבדה שלנו להכנת ג'ל פיברין המכילים גם VEGF וגם BFGF התחל בהתחממות של מינוס 80 מעלות צלזיוס, מלאי של פיברינוגן ותרומבין לטמפרטורת החדר. כאשר המלאי מופשר במלואו, הוסף תרומבין סידן כלורי VEGF ו- BFGF לתמיסת הפיברינוגן בצינור של 1.5 מיליליטר. ואז מערבבים את התמיסה על ידי פיפטינג.לאחר מכן, פיפטה בעדינות 200 מיקרוליטר מהתערובת, טיפה אחר טיפה על צלחת פלסטיק סטרילית. דגרו את הטיפות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות עד שהן מתמצקות. לאחר מכן השתמש במספריים כירורגיים קטנים כדי לחתוך את הג'לים לקוביות של שלושה על שלושה על שלושה מילימטרים.לאחר אישור טשטוש מלא בעכבר בן שמונה עד 12 שבועות על ידי צביטת הבוהן, כסו את עיני החיה במשחה וטרינרית כדי למנוע יובש, ולאחר מכן גלחו את הפרווה על הצד השמאלי של כלוב הצלעות. לאינטובציה אנדוטרכיאלית, הנח את העכבר על מעמד אינטובציה בזווית של 70 מעלות וחבר את החותכות העליונות על גומייה קטנה הממוקמת בחלק העליון של המעמד כדי להחזיק את החיה במקומה. השתמש במלקחיים קהים כדי למשוך בעדינות את הלשון לצד אחד, ולאחר מכן דמיין את הגרון בעזרת מאיר מיקרוסקופ צוואר אווז סיבים אופטיים.לאחר מכן, הכנס קטטר אלסטי אנדוטרכאלי בגודל 21 לקנה הנשימה. ודא שהעכבר נושם באופן ספונטני בצורה חלקה, ולאחר מכן הנח את החיה במצב שכיבה מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה. השתמש במאוורר מכרסמים כדי לאוורר מכנית את החיה ב-150 נשימות לדקה ושבעה מיליליטר לק"ג נפח גאות ושפל.ואז לספור צלעות כדי לאתר את החלל הבין-צלעי בין הצלע הרביעית לחמישית. לאחר מכן נגב היטב את האזור עם אלכוהול ויוד פובידון כדי ליצור שדה סטרילי ולכסות את אזור הניתוח בטרמה סטרילית כדי להניח את הג'ל על הריאה. לאחר מכן, בצע חתך עור רוחבי של סנטימטר אחד מעל החלל הבין-צלעי.ואז לבצע חתך שריר בין הצלע הרביעית לחמישית. הכנס מפסק מנתח בין הצלעות כדי לדמיין את הריאה השמאלית במלואה, ולאחר מכן השתמש במלקחיים עדינים כדי לגרד ריבוע של מילימטר אחד של הצדר הקרביים ממרכז הריאה השמאלית באמצעות צמר גפן סטרילי. לאחר מכן, הפעל לחץ עדין על האזור עד לשליטה מלאה על הדימום ודליפות האוויר, ולאחר מכן הוציא כמות קטנה של דבק תרומבין פיברינוגן מוצק על האזור.לאחר מכן, הניחו בעדינות ג'ל פיברין אחד על הדבק והתבוננו בתנועות הנשימה של הריאה כדי לקבוע שהג'ל מקובע היטב. ואז סגור את החתכים בתפר נספג. שאפו את חלל בית החזה עם מזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 27 למניעת פנאומוטורקס, ולאחר מכן סיימו את האוורור המכני.לאחר אישור שהעכבר נושם בצורה חלקה, הזריק מיליליטר אחד של 0.9% נתרן כלורי תוך-צפקי לפני המלחמה כדי למנוע התייבשות, ואפשר לעכבר להתאושש על כרית מים חמים במחזור הדם. לאחר שהחיה מפגינה נשימה יציבה, הסר את הצינור האנדוטרכיאלי והזריק משכך כאבים לאחר הניתוח. כאשר בעל החיים מתאושש לחלוטין, החזירו אותו לכלוב חדש שבודד מעכברים ללא ניתוח, תוך מעקב יומיומי אחר סימני זיהום או סיבוכים.שבעה עד 30 יום לאחר ההשתלה, המתת חסד של העכבר לפי פרוטוקול ובצע חתך בין קצה תהליך ה-xiphoid לחריץ החזה. ואז לחתוך את קנה הנשימה תוך ניתוח כל החיבורים מהריאה ללב ולקנה הנשימה, לקצור את כל הריאה ואת הג'ל המושתל, ואז לקבע את הג'ל ורקמת הריאה בתוך תמיסת אלדהיד פרפורמית של 4% למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס למחרת, להטמיע את רקמת הריאה בתרכובת OCT ואז לאסוף קטעי צעדים סדרתיים של הריאה והג'ל בעובי של 30 מיקרומטר. צבעו את החלקים בהמטין ואואין ונוגדנים כנגד סמני העניין המתאימים.ואז לאחר צילום תמונות זאק של החלקים, הרכיבו ערימות של החלקים האופטיים ליצירת תמונות תלת מימדיות של תאי האנדותל והאפיתל של הריאות. שימוש בתוכנה לניתוח תמונות תלת מימד. לבסוף כמת את האזורים המוקרנים של כלי הדם החדשים שנוצרו באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה.שבעה ימים לאחר ההשתלה, ג'ל הפיברין משולב בשחזור תלת מימד של הריאות המארחות של תמונות פלואורסצנטיות קונפוקליות הראה שתאי אנדותל חיוביים CD 31 שמקורם במארח יוצרים רשתות כלי דם בתוך הג'לים שבעה ימים לאחר ההשתלה בדרך תלוית מינון A-V-E-G-F-F-B-F-G-F, אקוופורין מסוג 1 5 חיובי וסוג 2 חלבון פעילי שטח B תאי אפיתל ריאה חיוביים מגויסים גם לאורך כלי הדם החדשים שנוצרו בתוך הג'לים המשלימים עם ריכוזים גבוהים יותר של VGF ו-B, FGFH ו-d. צביעה של חתכים היסטולוגיים מגלה כי סוגים אחרים של תאים מארחים נודדים גם הם לתוך הג'ל שבעה ימים לאחר ההשתלה. ממצאים אלה יחד מצביעים על כך שרשתות כלי דם רגנרטיביות שמקורן בריאות המארח והיווצרות המכתשית נבנות בהצלחה בתוך ג'ל הפיברין לאחר תוספת עם גורמים אנגיוגניים והשתלה על פני ריאת העכבר הבוגר לאחר התפתחותה.טכניקה זו סללה את הדרך לפחות חוקרים בתחום הביולוגיה של הריאות והרפואה הראשונית לחקור את המנגנון של אנגיוגנזה נורמלית וכיצד היא פועלת במצב מחלה בריאות עכברים.

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

ריאות perfused על ידי שני עורקי סימפונות המערכתיים ועורקי ריאה. ברוב מחל ריאה, היא מערכת כלי הדם המערכתית הקטנה המציגה neovascularization החזק. הפסקה של זרימת דם ריאתי מקדמת אנגיוגנזה סימפונות נמרצות. אנו מספקים פרטים ניתוחיים של גרימת איסכמיה עורק ריאה השמאלית שמקדמת neovascularization סימפונות.

באנגיוגנזה ריאות עכברוש איסכמי

שכבת פני שטח glycocalyx / אנדותל האנדותל היא למד באופן אידיאלי באמצעות מיקרוסקופ intravital. מיקרוסקופיה Intravital טכני מאתגרת באיבר מרגש כגון ריאות. אנחנו מדגימים איך brightfield סימולטני ומיקרוסקופיה ניאון ניתן להשתמש כדי להעריך את עובי שכבת פני שטח האנדותל שבנע...

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להמחיש כלי דם היווצרות ויוו ואת בזמן אמת ב- 3D פיגומים על ידי מיקרוסקופ multiphoton. אנגיוגנזה פיגומים מהונדסים נחקרה מודל פגם מאתר calvarial עצם קריטי. עוד כלי דם חדשים התגלו בקבוצה טיפול יותר שולטת.

אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

אנו מתארים הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של המודל פיברוזיס הריאות העכבר המושרה על ידי החדרה intratracheal כפול של bleomycin יחידנית או פולשני משולבת.

יחידנית או משולבת הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של ריאות הנגרמת Bleomycin פיברוזיס בעכברים

אנו מתארים שיטה כדי לשפר באופן משמעותי את engraftment orthotopic של סרטן ריאות תאים לריאות מאתר על ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה עם פציעה. גישה זו ויכול להיות מיושם גם ללמוד אינטראקציות סטרומה בתוך הריאות microenvironment, הפצתו גרורתי, morbidities משותף של סרטן ריאות, לייצר ביעילות רבה יותר החולה נגזר xenografts.

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

כאן אנו מציגים שיטה יעילה כדי לחקור את הפעילות האנטיפיברוטית של תאים בעלי מזון מסטרומה האנושית מתוך הגוף הפנימי שהתקבלו מן החבל הטבור כולו בעקבות אינדוקציה של פגיעה בריאה על ידי הזרקה אנדוקנה של ליאומיצין ב C57BL /6 עכברים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב בקלות לבדיקה טרום קלינית של therapeutics אחרים.

אינדוקציה של פגיעה בריאות העכבר על ידי הזרקת אנדוקנה של ליאומיצין

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת חלון אופטי השוכנות לצמיתות עבור בית החזה מורין, המאפשר הדמיה תוך-ויאלית ברזולוציה גבוהה של הריאה. קביעות החלון הופכת אותו מתאים היטב לחקר תהליכים תאיים דינמיים בריאה, במיוחד אלה המתפתחים לאט, כגון התקדמות גרורתית של תאים סרטניים מופצים.

חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה

כתב היד מתאר מתודולוגיה להקמה וכן ניטור גדילה אורכי של גרורות ריאה ספונטניות מגידולי שד בהזרקה אורתוטופית, הניתנת להתערבות בכל שלבי המפל הגרורתי.

ב Vivo הדמיה למדידת גרורות ריאה ספונטניות של תאי גידול שד בהזרקה אורתוטופית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

מאמר זה מתאר כיצד ליצור ריאות עכבר מהונדסות ביולוגית באמצעות שיטות דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה. הוא גם מפרט השתלת ריאות אורתוטופית לאחר מכן.

השתלת ריאות מהונדסות ביולוגית באמצעות ריאות עכבר נטולות תאים ותאי אנדותל אנושיים ראשוניים

טיפול תאי מציע התערבות מבטיחה לפיברוזיס ריאתי על ידי שימוש בתאי אב לתיקון רקמות פגועות ושיפור תפקוד הריאות. מכיוון שהדמיה ממלאת תפקיד מרכזי במעקב אחר אינטגרציה של תאים, כאן, אנו מתארים הדמיה מונחית חלקיקים מגנטיים מעקב in vivo של טיפול תאי בפיברוזיס ריאתי במודל עכבר.

מעקב In Vivo מונחה תמונה של תאי אב אפיתל ריאה דיסטליים מושתלים לפיברוזיס ריאתי באמצעות הדמיית חלקיקים מגנטית

למד שתלת ג'ל פיברין על ריאות עכבר לחקירת אנגיוגנזה ספציפית לריאה ותהליכי התחדשות אלוולרית. שיטה זו מאפשרת ניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי של רשתות כלי דם חדשות.

השרשה של הפיברין ג'ל על עכבר ריאות לחקר אנגיוגנזה ריאות ספציפית

גלה סרטונים נוספים