Name: טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: חקור מבנים חריגים של קרישי פיברין בחולי סוכרת ואנמיה חרמשית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל בזמן אמת. השיטה מאפשרת הערכת שיעורי פיברינוליזה והבנת השפעת מחלות על מורפולוגיית הקרישים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות למעבדת לאם בג'ורג'יה טק על דיונים מועילים רבים בפיתוח מבחני הניסוי. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר K01HL115486 ועל ידי מענק חדשן חדש 1DP2OD007433-01 ממשרד מנהל המכונים הלאומיים לבריאות. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הערה: הפרוטוקול הבא פועל לפי ההנחיות שנקבעו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) בג'ורג'יה טק. איסוף דם 1. והליך בידוד תאי דם אדום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 40-120 מיליליטר של דם מתורמים ב 10 מיליליטר צינורות Vacutainer heparinized. התחל PBMC בידוד (תאי דם היקפיים mononucleated) בתוך 4 שעות של אוסף. במהלך תקופה זו, לשמור על דם בRT. הערה: O / אחסון N של דם בRT או ב 4 ° C אינה מומלץ כזה יגרום לתשואת PBMC נמוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל דם כל 1: 1 בPBS סטרילי קר כקרח (4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 מיליליטר של פוליסכריד הידרופילי קר כקרח לתוך צינור ריק, סטרילי 50 מיליליטר חרוטי. בעדינות להעביר כל דם מדולל על גבי פוליסכריד הידרופילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 25 מיליליטר בהגדרה איטית ודם טפטפת לאורך הצד של הצינור באיטיות רבה. ודא שהדם אינו מעורבב עם saccharide לפני centrifugation כי פוליסכריד הידרופילי הוא רעיל לתאים ואחרת, תשואת PBMC תהיה נמוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות דם צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 400 XG ב 4 מעלות צלזיוס. אם זמין, להפחית את מהירות הבלם של צנטריפוגות למחצית המרבית להפרדה טובה יותר לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חלק פלזמה / טסיות דם של דגימת דם centrifuged. בזהירות לשאוב את שכבת פוליסכריד הידרופילי ישירות מעל שכבת RBC ארוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 8-10 מיליליטר של תאי דם אדומים ארוזים ולדלל 1: 1 עם 0.9% מלוחים NaCl לא סטרילי. </li></ol> 2. מבני קריש Confocal מיקרוסקופית הערכת Glycated (קרישי סוכרתיים סימולציה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר פיברינוגן האדם והמצומד פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescently על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הבאה ל0.5 מיליליטר סיים צינור microcentrifuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישי פיברינוגן הבריאים, נורמלים, לערבב פיברינוגן אדם עם 10% פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescentlyהמצומד בחיץ 50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl בריכוז של 5 מ"ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפיברינוגן Glycated באופן מלאכותי (כדי לדמות קרישים סוכרתיים), דגירה פיברינוגן אדם ו -10% המצומד פיברינוגן fluorescently שכותרתו בפתרון 5 מ"מ של גלוקוז מומס ב-50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl לריכוז של 6.8 מ"ג / מיליליטר וכתוצאה מכך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את צינורות מיקרו צנטריפוגות באמצעות חומר אטום כדי להימנע מחשיפה לאור. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך תא בשקופית מיקרוסקופ זכוכית על ידי ההדבקה בדבק דק על 2 צדדים של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 48 שעות, להכין חומרים כימיים להיווצרות הפיברין ידי הפשרת FXIIIa ותרומבין אלפא האנושי בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל FXIIIa 80 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרומבין 4 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים רגילים, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 2.5 מ 'g / ml, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים Glycated, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 3.4 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד פיפטה 30 μl של פתרון הפיברין לתוך התא שהוקם על ידי הדבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 22 מ"מ כיסוי הזכוכית להחליק x 22 מ"מ עם עובי של 0.15 מ"מ על גבי 2 שכבות של דבק. חותם את הצדדים הפתוחים עם דבק ברור כדי למנוע קריש הפיברין מהתייבשות. ודא שהדבק אינו אינטראקציה עם קריש הפיברין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לקרישי פיברין לפלמר ב21-23 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לפני ההדמיה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשת השמן M27 40X / 1.30 עם לייזר ארגון 488 ננומטר. </li></ol> 3. Confocal מיקרוסקופית הערכת קרישי פיברין מכילים RBCs מחולי אנמיה חרמשית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר פיברינוגן האדם והמצומד פיברינוגן אדם שכותרתו fluorescently על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הבאה ל0.5 מיליליטר סיים צינור microcentrifuge. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקריש הפיברין הבריא, נורמלי, לערבב פיברינוגן אדם עם 10% המצומד פיברינוגן האדם שכותרתו fluorescently בחיץ mM NaCl 50 מ"מ טריס / 100 בריכוז של 5 מ"ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים המכילים SCD RBCs, לערבב פיברינוגן אדם ו -10% המצומד פיברינוגן האדם שכותרתו fluorescently ב-50 מ"מ טריס / 100 מ"מ NaCl כך שהריכוז של פיברינוגן וכתוצאה מכך הוא 10 מ"ג / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית RBCs המבודד (הן נורמליות ואלה מחולי אנמיה חרמשית שהתקבלו מפרוטוקול בידוד RBC) באמצעות פתרון תא תיוג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות תאים בצפיפות של 1 x 10 6 לכל מיליליטר בכל מדיום תרבות סרום ללא בחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl / מיליליטר של ההשעיה התא לפתרון תא תיוג. מערבבים היטב על ידי pipetting העדין בעדינות. </li><li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות השעיה שכותרתו ב 1500 סל"ד במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ועדינות מחדש להשעות את התאים 37 ° C בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך השטיפה (3.3.4 ו3.3.5) עוד פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל FXIIIa 80 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרומבין 4 U / ml ב 5 מ"מ CaCl חיץ 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים רגילים, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 2.5 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים המכילים SCD RBCs, להבטיח כי הריכוזים הסופיים של פיברינוגן, FXIIIa, ותרומבין הם 5 מ"ג / מיליליטר, 20 U / ml, ו1 U / ml, בהתאמה בהיקף של 50 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של RBCs שכותרתו לפתרון הפיברין. פיפטה 30 μl של הפיברין עם RBCs על משטח הזכוכית מיקרוסקופ (ראה להחליק הכנה לGLקרישי ycated). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר ליפין לפלמר ב21-23 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לפני ההדמיה confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות confocal של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal, ולנצל לייזרי עירור עם אורכי גל של 488 ננומטר 633 ננומטר ולהלהיב את הפיברין שכותרתו fluorescently וRBCs. </li></ol> 4. Confocal מיקרוסקופית הערכת הפירוק פיברין המחירים במבני קריש Glycated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פרוטוקול מיקרוסקופיה confocal של קרישי Glycated (פרוטוקול שלב 2) להערכת שיעור הפירוק פיברין בקרישי Glycated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לא לאטום את הקצוות של החדר עם דבק ברור. לאפשר לקרישי פיברין לפלמר עבור 1.5 שעות ב21-23 מעלות צלזיוס במארז אטום המכיל 250 מיליליטר של מים על מנת למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פילמור, להשיג תמונות של קרישים באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמין פיפטה לקצה הפתוח של החדר ולפזר את פלסמין דרך הקריש באמצעות פעולת נימים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסויי פירוק פיברין נורמלים וGlycated עם ריכוזים נורמלים, פיפטה 25 μl ב 200 מיקרוגרם / מיליליטר של פלסמין לתוך הפתח של החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרישים Glycated עם ריכוזים מופחתים, פיפטה 25 μl ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר לתוך הפתח של החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתכונת זמן הסדרה (ראה איור 1) בתוכנת מיקרוסקופ confocal ללכוד צילומי וידאו של פלסמין lysing הקריש בזמן אמת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ מצב רכישה ולאחר מכן בחר "סדרות עתיות." בחר את מספר המחזורים ואת מרווח זמן הקלטה. </li></ol></li></ol> 5. חישוב המחירים הפירוק פיברין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את שיעור תמוגה ידי הגדרת אזור (2,500 מיקרומטר 2) וחישוב הזמן שחלף נדרש לפזר אזור קבוע של הקריש. לחשב את שיעור תמוגה באמצעות המשוואה הבאה (איור 2): <img alt="משוואת 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq1.jpg" ftp_upload></li></ol> 6. ניתוח סטטיסטי של המחירים הפירוק פיברין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני תמוגה באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית. לבצע ניתוח שונה חד-כיווני ופוסט הוק מבחן Tukey-Kramer 44,45. </li></ol>

<ol><li>Averett, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modular+Fibrinogen+Model+that+Captures+the+Stress-Strain+Behavior+of+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers.</a> Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).</li>
<li>Carlisle, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+individual%2C+electrospun+fibrinogen+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers.</a> Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).</li>
<li>Guthold, M., Cho, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+Unfolding+Mechanisms+Are+Not+Too+Much+of+a+Stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch.</a> Structure. 19, 1536-1538 (2011).</li>
<li>Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots+II%3A+Linear+viscoelastic+behavior+in+shear+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep.</a> Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).</li>
<li>Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+v.+shear+modulus%2C+creep%2C+and+creep+recovery+of+fine+unligated+clots%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots.</a> Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).</li>
<li>Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+fibrin+clots.+I.%3A+Dynamic+viscoelastic+properties+and+fluid+permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation.</a> Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).</li>
<li>Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+assembly.+Lateral+aggregation+and+the+role+of+the+two+pairs+of+fibrinopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides.</a> Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+properties+of+fibrin+for+basic+scientists+and+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians.</a> Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).</li>
<li>Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation+and+fibrin+clot+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation and fibrin clot structure.</a> Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).</li>
<li>Wolberg, A. S., Campbell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+generation%2C+fibrin+clot+formation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis.</a> Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).</li>
<li>Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructure+of+the+Fibrin+Clot%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanostructure of the Fibrin Clot.</a> Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).</li>
<li>Dunn, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin+clot+structure+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Herz%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes.</a> Herz. 29, 470-479 (2004).</li>
<li>Gladwin, M. T., Sachdev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+abnormalities+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Fibrin+Architecture+Is+Associated+With+Hypofibrinolysis+and+Premature+Coronary+Atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Carr, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+mellitus%3A+a+hypercoagulable+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">Diabetes mellitus: a hypercoagulable state.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).</li>
<li>Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+disease+and+heritability+of+the+prothrombotic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state.</a> Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).</li>
<li>Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+physiology+and+pathology+of+fibrin+structure%2Ffunction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function.</a> Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).</li>
<li>American Diabetes Association. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.diabetes.org/">http://www.diabetes.org/</a> (2014).</li>
<li>Alzahrani, S., Ajjan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+article%3A+Coagulation+and+fibrinolysis+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Vascular+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes.</a> Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).</li>
<li>Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , 
 Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.sicklecelldisease.org/">http://www.sicklecelldisease.org/</a> (2014).</li>
<li>Stuart, M. J., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle-cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sickle-cell disease.</a> The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).</li>
<li>Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+type+2+diabetes+on+fibrin+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function.</a> Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).</li>
<li>Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+the+resistance+of+fibrin+to+clot+lysis+by+plasmin+in+subjects+with+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).</li>
<li>Famodu, A., Reid, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+fibrinogen+levels+in+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+geographical+medicine%22%5BJournal%5D)">Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease.</a> Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).</li>
<li>Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Changes+in+Coagulation+and+Viscosity+during+Sickle-Cell+Crisis%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+haematology%22%5BJournal%5D)">Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis.</a> British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).</li>
<li>Ataga, K. I., Orringer, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercoagulability+in+sickle+cell+disease%3A+a+curious+paradox%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox.</a> The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).</li>
<li>Collet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+fibrin+architecture+is+associated+with+hypofibrinolysis+and+premature+coronary+atherothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).</li>
<li>Barazzoni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Fibrinogen+Production+in+Type+2+Diabetic+Patients+without+Detectable+Vascular+Complications%3A+Correlation+with+Plasma+Glucagon+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations.</a> The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).</li>
<li>Ceriello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+activation+in+diabetes+mellitus%3A+the+role+of+hyperglycaemia+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects.</a> Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).</li>
<li>Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+adhesiveness%2C+plasma+fibrinogen+and+factor+VIII+levels+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus.</a> Diabetologia. 6, 436-440 (1970).</li>
<li>Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+protein+chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibrin.</a> Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).</li>
<li>Collet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Fibrin+Network+Conformation+and+Fibrin+Fiber+Diameter+on+Fibrinolysis+Speed+Dynamic+and+Structural+Approaches+by+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).</li>
<li>Jörneskog, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+properties+of+the+fibrin+gel+structure+in+patients+with+IDDM%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM.</a> Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).</li>
<li>Svensson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+and+glycation+of+fibrinogen+in+vitro+occur+at+specific+lysine+residues+in+a+concentration+dependent+manner%3A+A+mass+spectrometric+and+isotope+labeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).</li>
<li>Pieters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycation+of+fibrinogen+in+uncontrolled+diabetic+patients+and+the+effects+of+glycaemic+control+on+fibrinogen+glycation%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation.</a> Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).</li>
<li>Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+fibrin+clot+networks+from+stereoscopic+intermediate+voltage+electron+microscope+images+and+analysis+of+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching.</a> Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).</li>
<li>Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+extravascular+and+intravascular+cells+to+fibrin+network+formation%2C+structure%2C+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability.</a> Blood. 114, 4886-4896 (2009).</li>
<li>Curtis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+microstructural+templating+in+fibrin-thrombin+gel+networks+by+spectral+and+viscoelastic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis.</a> Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+fibrin+network+structure+and+mechanical+properties%3A+an+experimental+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis.</a> Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).</li>
<li>Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+cell+disease+activates+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+induce+cathepsins+k+and+v+activity+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anemia%22%5BJournal%5D)">Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells.</a> Anemia. 2012, 201781(2012).</li>
<li>Allison, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+sickle-cell+haemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Properties of sickle-cell haemoglobin.</a> Biochemical Journal. 65, 212(1957).</li>
<li>Kuehl, R. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuehl%2C+RO+%22Design+of+experiments+%3A+statistical+principles+of+research+design+and+analysis%22">Design of experiments : statistical principles of research design and analysis</a>. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).</li>
<li>Lindman, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindman%2C+HR+%22Analysis+of+variance+in+experimental+designs%22">Analysis of variance in experimental designs</a>. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).</li>
<li>Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Mesoscopic+Clusters+in+Solutions+of+Sickle-Cell+Hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin.</a> Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).</li>
<li>Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+the+dissolution+of+mural+fibrin+clots+by+tissue-type+plasminogen+activator%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator.</a> Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).</li>
<li>Sazonova, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((127+Mathematic+model+of+fibrin+clot+lysis+by+plasmin%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrinolysis+and+Proteolysis%22%5BJournal%5D)">127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin.</a> Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כדי לקבל נתונים משמעותיים על המבנה של מנגנוני קרישה במצבי מחלה, חשוב לבודד את הגורמים מעורבים בקרישה כדי לקבוע את ההשפעות של החלבונים ותאים בתנאים אלה. פרוטוקול זה פותח לצורך חקירת המבנה של קריש הפיברין במדינות סוכרת וSCD במבחנה. זה הכרחי כדי להבין את המנגנונים מעורבים בהיווצרות הפיברין ופירוק פיברין במצבי מחלה שכן תנאים השתנו לגרום hypercoagulation, atherothrombosis, וCVD. מתמונות confocal שהתקבלו בניסו...

פגיעה ברירית האנדותל של כלי דם לתיקון דרך התגובה לעצרת הדם, או היווצרות של קריש דם. כאשר דם מחלחל לתוך מטריצת החוץ תאית, גורמי רקמה להפעיל טסיות דם בזרם הדם המאפשרים חניכה של מפל הקרישה. המרכיב המכני המפתח של תהליך ריפוי זה הוא מטריצת הפיברין, מורכבת מסיבי הפיברין שאלסטיות גבוהה, ויכול לקיים כוחות גדולים 1-4. חוקרים רבים חקרו את מבנה המערך, ותפקוד של הפיברין בהרחבה בעשורים האחרונים 5-13. יש חולים במחלות כגון סוכרת וחרמשית סיכון מוגבר לפתח סיבוכים טרומבוטיים כגון אוטם שריר לב, מחלת לב איסכמית, ומלטף 14-19. מעל 2 מיליון אנשים שאובחנו לאחרונה עם סוכרת בכל שנה בארצות הברית. ישנם שני סוגים של סוכרת: הסוג I, שבוגוף לא מצליח לייצר כמות מספקת של אינסולין, וסוג השני, שבו הגוף הופך עמיד לאינסולין. בקרב חולי סוכרת, מחלות לב וכלי דם (CVD) היא הסיבה ל- 80% מהתחלואה והתמותה הקשורים במחלה 20,21. מחלה מגל תא (SCD) היא הפרעה גנטית המשפיעה על דם יותר מ -100,000 אנשים בארצות הברית 22. SCD הוא מחלה נקודה-מוטציה שגורמת לתאי דם אדומים להפוך בצורה חצי סהר, מה שהקשה על התאים לעבור בכלי דם הדם 23. שתי מדינות מחלה אלה מגבירים את הסיכוי לפתח תנאי atherothrombotic בגוף. אחת הסיבות לכך היא תוצאה של מבנה הפיברין שינה ותפקוד במצבים חולים 14,24-26. בשתי הסוכרת ומחלות חרמשית, יש hypercoagulation ופעילות hypofibrinolysis שגורמת atherothrombosis ומחלות לב וכלי דם (CVD), בהשוואה למטופלים בריאים 17,27,28. זה ידוע שhypofibrinolysis מקדם התקדמות טרשת עורקים ומולידה אירועים איסכמיים חוזרים בחולים עם מחלת לב כלילית מוקדמת 29. בכתב היד הנוכחית, החוקרים בחנו את התפקיד של תכונות פיזיות הפיברין בהגדרה המסוימת הזה. מבני קריש הפיברין בחולים שאינם חולים מורכבים מסיבים דקים, נקבוביות גדול, ו14,24 בדרך כלל פחות צפופים. הנקבוביות המוגברת וקרישי פיברין פחות צפופים בנבדקים בריאים נמצאו כדי להקל על פירוק פיברין 16. בתנאי hyperthrombotic כגון מחלת סוכרת תא ומגל, יש עלייה בייצור פיברינוגן, גורמת לריכוז פיברינוגן להגדיל מהרמות נורמליות של 2.5 מ&quot;ג / מיליליטר בחולים בריאים 30-33. קרישי פיברין נוצרו בחולי סוכרת נמצאו להיות פחות נקבובי, נוקשה יותר, יש יותר נקודות סניף, וצפוף יותר בהשוואה למי שאינו dia הבריא,חולי betic 14,24,33-35. מבנה הפיברין שינה הוא תוצאה של מנגנוני glycation המתרחשים בחלבונים מעורבים בהיווצרות קריש דם. glycation Nonenzymatic (בלתי הפיך) מתרחש כאשר מולקולות גלוקוז להיקשר לשאריות ליזין על מולקולת פיברינוגן, אשר מעכבת XIIIa האנושי גורם (FXIIIa) משאריות גלוטמין וליזין cross-linking כראוי 33,36,37. הניתוח המבני של רשתות הפיברין נחקר בהרחבה לאחרונה. בפרט, חוקרים נצלו את מיקרוסקופ אלקטרונים ושחזור 3D של רשתות הפיברין 38, חקרו כיצד תאים שני תאי intravascular (אנדותל) וextravascular (fibroblasts ושריר חלק) משפיעים על מבנה הפיברין 39, viscoelastic מנוצלת וניתוח ספקטרלי לנתח מבני הפיברין 40, ו מתאמים מפותחים בין מבנה ליפין ותכונות מכאניות באמצעות ניסוי וחישובי גישות 41 </sup&gt;. המוקד של המחקר הנוכחי היה לגבש מבני קריש בתנאים פקקת תא סוכרת ומגל מדומים ולהשתמש במיקרוסקופ confocal לבחינת המבנה ותפקוד של קרישים במדינות נגועות. קרישי פיברין נוצרו מפיברינוגן האנושי, תרומבין האנושי, וFXIIIa. קרישים היו lysed באמצעות פלסמין. כדי לדמות תנאים סוכרתיים, ריכוז מוגבר של פיברינוגן הודגרה בפתרון גלוקוז כדי לגרום במבחנת glycation פיברינוגן. כדי לדמות תנאי קרישת מחלה חרמשית, ריכוזי פיברינוגן מוגברים היו מעורבים עם המטוקריט חרמשית שנאסף מחולים כפי שנעשה בעבר על ידי הקבוצה שלנו 42. שיטות אלה שמשו לבדיקת המבנה והפונקציות מעורבות בהיווצרות קריש הפיברין ופירוק פיברין בתנאים חולים, כמו גם את המנגנונים שגורמים לCVD. בהתבסס על מידע נוכחי על מחלות אלו, מבני קריש הפיברין Glycated היו צפופים יותר עם פחותnd נקבוביות קטן יותר. קרישי פיברין עם תאי דם אדומים של חולי אנמיה חרמשית (RBCs) היו גם צפופים ומוצגים אגרגציה של תאי הדם האדומים ואשכולות הפיברין מגובבים. זוהי תופעה מבוססת היטב כי כבר נקבעה בעבר 43. כמו כן, החוקרים שיערו כי שיעור הפירוק פיברין יהיה נמוך באופן משמעותי בקרישי פיברין Glycated עם ובלי פלסמין המופחת בהשוואה ליפין בריא, נורמלי. התוצאות הראו כי לקרישי פיברין Glycated, תוצאות שיעור תמוגה שונות באופן משמעותי נצפו רק בתנאים של ריכוז פלסמין מופחת. טכניקה ניסויית זו של שימוש במיקרוסקופ confocal מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות הדמיה אחרות, כי התאים והחלבונים להישאר במדינה האם שלהם, המאפשרת הלכידה וידאו של פעילות הקרישה בזמן אמת. שיטה זו של קרישה סינטטי התרמה היא גם זולה יותר ויעילה יותר זמן מאשר קבלת דגימות מטופל וסינון בודדחלבונים ואנזימים. יתר על כן, על ידי שימוש בחלבונים ואנזימים מופרדים לסנתז קרישים, קרישים היו סטנדרטיים, כך שלא היה שונות בין דגימות כתוצאה מחלבונים אחרים בפלזמה.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque (פוליסכריד הידרופילי)</td><td>GE Healthcare</td><td>45-001-749</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל שפופרות ואקום הפריניות</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות מחקר אנזימי</td><td>פיברינוגן אנושיים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr>Alexa Fluor 488 <td>בדיקות מולקולריות</td> <td>מצומדות פיברינוגן אנושיות</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>0.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה מדורג</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>אבקת גלוקוז</td><td>Life Technologies</td><td>15023-02</td><td></td></tr><tr><td>FXIIIa</td><td>מעבדות מחקר אנזימים</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VIS מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss LSM 510</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"מ Tris</td><td>Lonza</td><td>S50-642</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD פתרון תיוג תאים</td><td>Life Technologies</td><td>L7781</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות מחקר אנזימי</td><td>פלסמין</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (5 M NaCl)</td> <td>Life Technologies</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מידול סטטיסטי</td><td>IBM</td><td>SPSS סטטיסטיקה 22</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

פיברין הוא חלבון מטריצה חוץ-תאי האחראי על שמירה על השלמות המבנית של קרישי הדם. מחקרים רבים נעשו על פיברין בשנים האחרונות כדי לכלול חקירה של סינתזה, מבנה-תפקוד וליזיס של קרישי דם. עם זאת, עדיין יש הרבה לא ידוע על המאפיינים המורפולוגיים והמבניים של קרישי דם הנובעים מחולים עם מחלה. במחקר זה מוצגות טכניקות ניסיוניות המאפשרות לבחון הבדלים מורפולוגיים של מבני קרישים חריגים עקב מצבים חולניים כגון סוכרת ואנמיה חרמשית. המחקר שלנו מתמקד בהכנה והערכה של קרישי פיברין על מנת להעריך הבדלים מורפולוגיים באמצעות מבחנים ניסיוניים שונים ומיקרוסקופיה קונפוקלית. בנוסף, מתוארת גם שיטה המאפשרת חישוב רציף בזמן אמת של שיעורי הליזיס בקרישי פיברין. הטכניקות המתוארות כאן חשובות לחוקרים ולרופאים המבקשים להבהיר פתולוגיות פקקתיות נלוות כגון אוטם שריר הלב, מחלת לב איסכמית ושבץ מוחי בחולים עם סוכרת או מחלת תאי חרמש.

Confocal ניתוח מיקרוסקופית של מבני קריש פיברין Glycated תמונות מיקרוסקופיה confocal של קרישים נורמלים וGlycated מוצגות באיור 3. ניתוח מיקרוסקופיה Confocal של קרישים נורמלים וGlycated מגלה כי קרישי Glycated הם צפופים עם נקבוביות קטנות יותר מהקרישים נורמלים עם או בלי התוספת של FXIIIa במהלך פילמור קריש. באיור 3 א ו3B, יש ריכוז נמוך הפיברין שיצר מבנה פחות צפוף מאשר קרישי Glycated עם ...

בכתב יד זה מוצגות טכניקות ניסיוניות, כולל הכנת דם, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח קצב ליזה, לבחינת ההבדלים המורפולוגיים בין מבני קרישים נורמליים וחריגים עקב מצבים חולים.

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההבדלים המורפולוגיים במבני קרישים חריגים המתרחשים בסוכרת ואנמיה חרמשית, מצבי מחלה לקרישי סוכרת מדומים. זה מושג על ידי הדמיית מבני קרישים מסוכררים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לדגימות דם מחולי תאי חרמש. קרישי פיברין המכילים תאי דם אדומים מצולמים בזמן אמת.לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח מיקרוסקופיה כדי להעריך את שיעורי הפיברינוליזה על מבני הקריש הרגילים והמסוכררים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוח זה בזמן אמת כדי להעריך את ההבדלים המורפולוגיים המתרחשים במבני קרישים חריגים בתגובה למצבי המחלה בהם הם מתעוררים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפקקת והמוסטזיס, כגון כיצד שונים מבני קרישי פיברין בחולים עם סוכרת או מחלת תאי חרמש.כדי להעריך קרישי סוכרת מדומים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, תחילה יש להפשיר פיברינוגן אנושי, ו-10% פיברינוגן אנושי המסומן פלואורסצנטי מצומד ב-37 מעלות צלזיוס כאשר התמיסות של התחממות מעורבבות לפיברינוגן אנושי והפיברינוגן מצומדים בתמיסת נתרן כלורי של גלוקוז טריקס ודוגרים על התמיסה המוגנת מפני אור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לקראת סוף הדגירה, השתמש בדבק שאינו על בסיס נוזלי כדי להדביק דבק דק משני צידי שקופית מיקרוסקופ זכוכית ליצירת תא, ולאחר מכן ערבב תמיסת פיברינוגן עם מקדם טמפרטורת החדר 13 ותרומבין לנפח סופי של 50 מיקרוליטר, והעביר מיד 30 מיקרוליטר מתמיסת הפיברין לתא השקופיות של המיקרוסקופ. כעת הניחו תלוש כיסוי זכוכית בגודל 22 על 22 מילימטר בעובי נקודה של 15 מילימטר על גבי הדבק ואטמו את הצדדים הפתוחים של החדר בדבק שקוף, תוך הקפדה שהדבק לא יתקשר עם הקריש.אפשר לקרישי הפיברין להתפלמר בטמפרטורה של 21 עד 23 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן רכוש תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של הקרישים באמצעות אובייקט של פי 40 ולייזר ארגון של 488 ננומטר כדי להעריך קרישים מחולי תאי חרמש. ראשית יש לדלל את דגימת תאי הדם האדומים במיליון תאים למיליליטר במדיום תרבית תאים חופשיים בסרום, ולערבב את התאים עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסת תיוג התאים המתאימה על ידי פיפטינג עדין.לאחר 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, שטפו את התאים שלוש פעמים במדיום של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה מערבבים תמיסת פיברינוגן טרייה שהוכנה פקטור 13 ותרומבין כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר מתאי הדם האדומים המסומנים לתמיסת הפיברין והוציאו מיד 30 מיקרוליטר מתמיסת התאים לתא דבק. בשקופית מיקרוסקופ זכוכית, אפשר לפיברין להתפלמר ב-21 עד 23 מעלות צלזיוס לאחר שעתיים, רכוש תמונות קונפוקליות של הקרישים באמצעות לייזרי עירור באורכי גל של 488 ננומטר ו-633 ננומטר כדי לעורר את הפיברין ותאי הדם האדומים המסומנים פלואורסצנטי בהתאמה.כדי להעריך את שיעורי הפיברינוליזה ואת מבני הקרישים המסוכררים, הכינו תחילה קרישים מסוכררים, כפי שהודגם הפעם. עם זאת, לאחר הוצאת תמיסת קריש הפיברין לתא הדבק, אל תאטום את קצות החדר. במקום זאת, אפשר לקרישים להתפלמר בטמפרטורה של 21 עד 23 מעלות צלזיוס במתחם אטום המכיל 250 מיליליטר מים כדי למנוע התייבשות.לאחר שעה וחצי, רכשו תמונות של הקרישים במיקרוסקופיה קונפוקלית כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן פיפטה 25 מיקרוליטר פלסמין לקצה הפתוח של החדר ואפשר לפלסמין להתפזר ברחבי הקריש על ידי פעולה נימית. לבסוף, פתח את תכונות סדרות הזמן של תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי, לחץ על מצב רכישה ובחר סדרות זמן.לאחר מכן בחר את מספר המחזורים ואת מרווח זמן ההקלטה כדי לצלם קטעי וידאו בזמן אמת של ניתוח ליזיס קרישי המושרה על ידי פלסמין של קרישים רגילים ומסוכררים מגלה שקרישים מסוכררים צפופים יותר עם נקבוביות קטנות יותר מקרישים רגילים, הן עם והן בלי תוספת של פקטור 13 במהלך פילמור קרישים. ואכן, בקרישים המסוכררים של האו"ם יש ריכוז פיברין נמוך יותר, מה שיוצר מבנה פחות צפוף מזה שנצפה בקרישים המסוכררים, המכילים ריכוז פיברין גבוה יותר. קרישי פיברין מחולי תאי חרמש מכילים תאי דם אדומים ומציגים מבנים צפופים יותר מאלה של קרישי פיברין בריאים עקב ריכוז פיברינוגן מוגבר אצל אנשים אלה.יתר על כן, הנטייה הטבעית של תאי דם אדומים מחולי תאי חרמש ליצור אגרגטים ומגדרים, גושים של תאי דם אדומים השזורים ברשת הפיברין, וכתוצאה מכך נוצרים מבני קרישים חריגים השונים באופן ניכר במורפולוגיה מאלה שנצפו בחולים רגילים. לבסוף, ניתוח שיעורי הפיברינוליזה של קרישים רגילים לעומת מסוכררים מדגים פגיעה משמעותית ביכולת של קרישי הסוכרת המדומים לפיברין בהיעדר פלסמין מספיק. מחקר זה יסייע לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הפקקת וההמוסטזיס, במיוחד עבור חולים המפתחים פתולוגיות נלוות כתוצאה ממחלת תאי חרמש וסוכרת.

experimental-imaging-techniques-for-examining-fibrin-clot-structures

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: Kim, D., et. al. הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להדמיה ישירה של טרומבואמבולי מוחי. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיה של פקקת מוחית בעכברים באמצעות הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT). מודל של עכבר פקקת מוח מוזרק עם ננו-חלקיקי זהב ממוקדי פיברין הפועלים כחומר מנוגד. העכבר מונח על מצע של מכונת מיקרו-CT, והתמונות מתקבלות מזוויות מרובות. באמצעות תוכנה מתאימה, התמונות משוחזרות ומעובדות.

הדמיה של פקקת מוחית בעכבר באמצעות הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת

מיקרוסקופיה וטכניקות לעיבוד תמונה שימשו להתבוננות וניתוח של דחיסת ג'ל בתיווך פיברובלסט וארגון מחדש של סיבי פיברין בביוריאקטור מבוקר לסביבה על פני תקופה של 48 שעות.

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

פרוטוקול זה מתאר את היישום של ניאון בשילוב האינפרה-אדום הקרוב (NIRF) הדמיה וטומוגרפיה-מחושב מיקרו (microCT) המאפשר הדמיה thromboemboli מוחין. טכניקה זו מאפשרת כימות של נטל פקיק ואבולוציה. טכניקת דימות NIRF מדמיינת שכותרתו fluorescently פקיק במוח הניכר, ואילו טכניקת microCT מדמיינת פקיק בתוך חיות בעלות באמצעות-חלקיקי זהב.

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

עבודה זו מתארת ​​שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטי לחקר הדבקה טסיות, התפשטות, והפרשה תחת זרימה. פלטפורמה רב-תכליתית זו מאפשרת חקירת תפקוד טסיות למחקר מכניסטי על פקקת והמוסטאזיס.

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

פיברין אחראי על היווצרות קריש במהלך המוסטאזיס ופקקת. אסמים סוערים וhromboelastograhy (TEG) יכול להיות מנוצל ככלים סינרגטיים המספקים הערכה משלימה של קריש דם. שתי טכניקות אלה יחד יכולות לתת תובנה נוספת כיצד תנאי קרישה משפיעים על היווצרות קריש פיברין.

מינוף טורבידיות וטרומבולסטוגרפיה לאפיון קרישי דם משלימים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד להשתמש בפציעה בתיווך FeCl3 כדי לגרום לפקקת עורקים, וכיצד לאסוף ולהכין דגימות פגיעה עורקית בשלבים שונים של פקקת לצורך ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים.

פקקת עורקים המושרה על ידי ברזל כלוריד ואיסוף דגימות לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים תלת ממדי

מחקר זה מתאר שיטה מהירה ויעילה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים באמצעות המסת קרישי דם, צביעת תאים ובדיקת דם שגרתית.

גישה מקיפה לניתוח מרכיבי התא של קרישי דם מוחיים

בדיקות טרומבוליזה חוץ-גופית נאבקו לעתים קרובות לשכפל תנאי in-vivo בין אם בפקקת המודל המעוכלת או בסביבה שבה מתרחשת פקקת. במאמר זה, אנו חוקרים כיצד צימוד לולאת צ'נדלר ובדיקת פיברינוליזה פלואורומטרית זורמת בזמן אמת (RT-FluFF) משמש לניטור ליזה של קרישי דם באיכות גבוהה, ex-vivo.

מעקב אחר פיברינוליזה של קרישי דם שלמים שנוצרו בלולאה של צ'נדלר תחת זרימת גזירה במודל פקקת חוץ גופית

עבודה זו מתארת בדיקה מיקרופלואידית המשתמשת במאמץ גזירה כדי להפעיל יצירת קרישי דם בדם ומאפיינת את הקריק באמצעות ממדים מרובים של קריאה. הבדיקה יכולה למדוד את הנטייה הפרותרומבוטית של דגימות דם, ולכן היא שימושית באבחון מחלות, גילוי תרופות, וכן במחקרים מכניים בסיסיים הקשורים לטרומבוזיס.

מבחן פרופיל תרומבוס: פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה לאפיון מקיף של תרומבוגנזה ביומכנית

חקור מבנים חריגים של קרישי פיברין בחולי סוכרת ואנמיה חרמשית באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל בזמן אמת. השיטה מאפשרת הערכת שיעורי פיברינוליזה והבנת השפעת מחלות על מורפולוגיית הקרישים.

טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית

גלה סרטונים נוספים