טכניקות ניסיוניות והדמיה לבחינת מבני פיברין קריש בבריאה והחולה הברית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את ההבדלים המורפולוגיים במבני קרישים חריגים המתרחשים בסוכרת ואנמיה חרמשית, מצבי מחלה לקרישי סוכרת מדומים. זה מושג על ידי הדמיית מבני קרישים מסוכררים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לדגימות דם מחולי תאי חרמש. קרישי פיברין המכילים תאי דם אדומים מצולמים בזמן אמת.

לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח מיקרוסקופיה כדי להעריך את שיעורי הפיברינוליזה על מבני הקריש הרגילים והמסוכררים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוח זה בזמן אמת כדי להעריך את ההבדלים המורפולוגיים המתרחשים במבני קרישים חריגים בתגובה למצבי המחלה בהם הם מתעוררים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפקקת והמוסטזיס, כגון כיצד שונים מבני קרישי פיברין בחולים עם סוכרת או מחלת תאי חרמש.

כדי להעריך קרישי סוכרת מדומים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, תחילה יש להפשיר פיברינוגן אנושי, ו-10% פיברינוגן אנושי המסומן פלואורסצנטי מצומד ב-37 מעלות צלזיוס כאשר התמיסות של התחממות מעורבבות לפיברינוגן אנושי והפיברינוגן מצומדים בתמיסת נתרן כלורי של גלוקוז טריקס ודוגרים על התמיסה המוגנת מפני אור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לקראת סוף הדגירה, השתמש בדבק שאינו על בסיס נוזלי כדי להדביק דבק דק משני צידי שקופית מיקרוסקופ זכוכית ליצירת תא, ולאחר מכן ערבב תמיסת פיברינוגן עם מקדם טמפרטורת החדר 13 ותרומבין לנפח סופי של 50 מיקרוליטר, והעביר מיד 30 מיקרוליטר מתמיסת הפיברין לתא השקופיות של המיקרוסקופ. כעת הניחו תלוש כיסוי זכוכית בגודל 22 על 22 מילימטר בעובי נקודה של 15 מילימטר על גבי הדבק ואטמו את הצדדים הפתוחים של החדר בדבק שקוף, תוך הקפדה שהדבק לא יתקשר עם הקריש.

אפשר לקרישי הפיברין להתפלמר בטמפרטורה של 21 עד 23 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן רכוש תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של הקרישים באמצעות אובייקט של פי 40 ולייזר ארגון של 488 ננומטר כדי להעריך קרישים מחולי תאי חרמש. ראשית יש לדלל את דגימת תאי הדם האדומים במיליון תאים למיליליטר במדיום תרבית תאים חופשיים בסרום, ולערבב את התאים עם חמישה מיקרוליטרים של תמיסת תיוג התאים המתאימה על ידי פיפטינג עדין.

לאחר 20 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, שטפו את התאים שלוש פעמים במדיום של 37 מעלות צלזיוס בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה מערבבים תמיסת פיברינוגן טרייה שהוכנה פקטור 13 ותרומבין כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן העבירו 10 מיקרוליטר מתאי הדם האדומים המסומנים לתמיסת הפיברין והוציאו מיד 30 מיקרוליטר מתמיסת התאים לתא דבק. בשקופית מיקרוסקופ זכוכית, אפשר לפיברין להתפלמר ב-21 עד 23 מעלות צלזיוס לאחר שעתיים, רכוש תמונות קונפוקליות של הקרישים באמצעות לייזרי עירור באורכי גל של 488 ננומטר ו-633 ננומטר כדי לעורר את הפיברין ותאי הדם האדומים המסומנים פלואורסצנטי בהתאמה.

כדי להעריך את שיעורי הפיברינוליזה ואת מבני הקרישים המסוכררים, הכינו תחילה קרישים מסוכררים, כפי שהודגם הפעם. עם זאת, לאחר הוצאת תמיסת קריש הפיברין לתא הדבק, אל תאטום את קצות החדר. במקום זאת, אפשר לקרישים להתפלמר בטמפרטורה של 21 עד 23 מעלות צלזיוס במתחם אטום המכיל 250 מיליליטר מים כדי למנוע התייבשות.

לאחר שעה וחצי, רכשו תמונות של הקרישים במיקרוסקופיה קונפוקלית כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן פיפטה 25 מיקרוליטר פלסמין לקצה הפתוח של החדר ואפשר לפלסמין להתפזר ברחבי הקריש על ידי פעולה נימית. לבסוף, פתח את תכונות סדרות הזמן של תוכנת המיקרוסקופ הקונפוקלי, לחץ על מצב רכישה ובחר סדרות זמן.

לאחר מכן בחר את מספר המחזורים ואת מרווח זמן ההקלטה כדי לצלם קטעי וידאו בזמן אמת של ניתוח ליזיס קרישי המושרה על ידי פלסמין של קרישים רגילים ומסוכררים מגלה שקרישים מסוכררים צפופים יותר עם נקבוביות קטנות יותר מקרישים רגילים, הן עם והן בלי תוספת של פקטור 13 במהלך פילמור קרישים. ואכן, בקרישים המסוכררים של האו"ם יש ריכוז פיברין נמוך יותר, מה שיוצר מבנה פחות צפוף מזה שנצפה בקרישים המסוכררים, המכילים ריכוז פיברין גבוה יותר. קרישי פיברין מחולי תאי חרמש מכילים תאי דם אדומים ומציגים מבנים צפופים יותר מאלה של קרישי פיברין בריאים עקב ריכוז פיברינוגן מוגבר אצל אנשים אלה.

יתר על כן, הנטייה הטבעית של תאי דם אדומים מחולי תאי חרמש ליצור אגרגטים ומגדרים, גושים של תאי דם אדומים השזורים ברשת הפיברין, וכתוצאה מכך נוצרים מבני קרישים חריגים השונים באופן ניכר במורפולוגיה מאלה שנצפו בחולים רגילים. לבסוף, ניתוח שיעורי הפיברינוליזה של קרישים רגילים לעומת מסוכררים מדגים פגיעה משמעותית ביכולת של קרישי הסוכרת המדומים לפיברין בהיעדר פלסמין מספיק. מחקר זה יסייע לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הפקקת וההמוסטזיס, במיוחד עבור חולים המפתחים פתולוגיות נלוות כתוצאה ממחלת תאי חרמש וסוכרת.