Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את השינויים בשיעורי פירוק החלבון בצורה שיטתית על ידי צימודם לקינטיקה של גידול שמרים בתרבית נוזלית. זה מושג על ידי תאים גדלים ראשונים המבטאים חלבון מדווח המורכב מאות פירוק המחובר לסמן מטבולי בן לילה לשלב נייח בתווך סלקטיבי מתאים. לאחר מכן, נמדדת הצפיפות האופטית של התאים כדי לקבוע את קינטיקת הצמיחה של התאים, ולאחר מכן מחושב זמן ההכפלה המינימלי של התאים במהלך שלב הלוג מקינטיקה של הגידול באמצעות תוכנה ייעודית.

בסופו של דבר, ניתן להשתמש בזמן ההכפלה המינימלי המחושב כדי להגדיר וריאציות בקינטיקה של פירוק החלבון. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ציקלמט או מבחני השפלה של מרדף דופק הוסיפו שהטכניקה שלנו פשוטה להגדרה. רכישת הנתונים וניתוחם הם פשוטים, ועיצוב החיבור הוא מודולרי ביותר.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום פירוק הסיר, כגון אילו אלמנטים נדרשים לזיהוי סיר לא מקופל על ידי מערכת סיר היוביקוויטין. הרעיון לשיטה הזו עלה לי לראשונה כשרציתי לעשות סקר כדי לזהות את החלבונים הכוללים הסרת יוביקוויטין מתת-הקבוצה שלהם. אז יצרתי דרך פשוטה להשוות מספר דגימות כדי להכין את התאים לניתוח.

התחל בהפיכת תאי השמרים האטרופים המתאימים כגון TRY 4 67 עם פלסמיד המכיל היתוך U three Deron וסמן מטבולי נוסף לבחירה ותחזוקה של פלסמיד. לבחירת פלסמיד ותחזוקה, יש לגדל את התאים על צלחות אגר תחת מדיום מוגדר סינתטי מתאים, חסר סמני בחירת חומצות אמינו, להעביר מושבות ששרדו לטלאים, להעביר תאים מטלאים למדיה נוזלית ולדגור למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס עד להגעה לשלב נייח. לאחר מכן עבור 15 דגימות או פחות, יש לדלל 50 מיקרוליטר של התאים מתרבית הלילה עם 150 מיקרוליטר של מדיום מוגדר סינתטי לכל באר.

בצלחת תחתונה שקופה של 96 בארות, השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי לקבוע את ערכי OD 600 של הדגימות. לאחר מכן, לאחר חישוב הנפח המדויק הדרוש להשגת תאי שמרים בכמות השווה ל-OD 600 של 0.25, סובב את התאים למשך דקה אחת ב-12,000 פעמים G וטמפרטורת החדר השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של המדיום הסלקטיבי המתאים כדי להשיג OD 600 של 0.25 ולהעביר 200 מיקרוליטר מהזן המדולל לבאר אחת של צלחת חדשה של 96 בארות כאשר היא גדולה מ-15 יש לבדוק דגימות. העבירו 10 מיקרוליטר מהתאים הנייחים שגדלו בן לילה לבאר אחת של צלחת חדשה של 96 בארות המכילה 190 מיקרוליטר של המדיה הסלקטיבית המתאימה כדי למדוד את קינטיקה הצמיחה של תאי השמרים שעברו טרנספורמציה בתנאים סלקטיביים.

לאחר מכן, הגדר קורא מיקרו-פלטות רב-מצבי לטמפרטורת דגירה של 30 מעלות צלזיוס OD 600 מרווחי מדידה של 15 דקות ומחזורי טלטול מסלולי וליניאריים של דקה אחת כל שבע דקות. לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בקורא המיקרופלייט למשך 12 עד 24 שעות. כאשר התאים הגיעו לשלב הנייח, ייצא את הנתונים הגולמיים לקובץ גיליון אלקטרוני כדי לקבוע את קינטיקה של גידול השמרים באמצעות MDT Calc.

ודא שקובץ הגיליון האלקטרוני המכיל את נתוני הגידול נשמר וסגור. לאחר מכן פתח את תוכנית היישום MDT Calc תחת נתיב קובץ. לחץ על המלבן כדי לאתר את קובץ הגיליון האלקטרוני תחת שם הגיליון.

הזן את שם הגיליון האלקטרוני שבו נמצאים הנתונים הגולמיים תחת עמדת התחלה. הזן את קואורדינטות הזמן של הגיליון האלקטרוני, אפס של הדגימה הראשונה תחת עמודת הזמן. הזן את האות המגדירה את המיקום של עמודת נקודת הזמן בשניות תחת עמודה ריקה, הזן את האות המגדירה את מיקום העמודה הריקה.

לדוגמה, הבאר A אחת של צלחת 96 הבאר. הבא. תחת ערך OD, בחר את ערך ה- OD 600 המינימלי הנדרש לאתחול חישוב MDT. בדרך כלל 0.15 עד 0.25 כדי להבטיח שה-MDT מחושב רק עבור הדגימות שמגיעות לערך המוגדר D 600 ומעלה.

לאחר הזנת הערך האחרון, לחץ על כפתור החישוב ואשר כי סרגל ההתקדמות בצד ימין משתנה בהדרגה לירוק. לבסוף, ייצא את שתי ערכות הנתונים המופיעות אוטומטית על המסך עם השלמת חישוב ה-MDT לגיליון אלקטרוני חדש. אשר שהנתונים כוללים את ערך ה-MDT עבור כל באר שעוברת את מבחן ערך ה-OD המינימלי ואת זמן ההתחלה של המרווח שממנו חושב ה-MDT בניסוי מייצג זה.

ההבדלים היחסיים בקינטיקה של פירוק החלבון בין הסוג הפראי לזנים מוטנטיים שונים הושוו בתחילה מסוג בר U BBC 6, דלתא UBC 7 דלתא, או DOA 10 תאי דלתא המבטאים D אחד VMAU שלושה גודלו על מדיום שלם מוגדר סינתטי. לאחר מכן, כדי למדוד את הזימים, התאים נשטפו והודגרו במדיה מוגדרת סינתטית. מינוס עקומות גדילה דומות ו-MDT מחושב נצפו עבור כל הזנים שגדלו במדיום שלם מוגדר סינתטי, למעט האפשרות שמחיקת כל אחד מהגנים שנבדקו תשפיע על צמיחת התאים.

לעומת זאת, דגירה במדיה מוגדרת סינתטית מינוס אורציל הביאה לצמיחה לקויה של תאים מסוג בר, בעוד שרק פגם גדילה קל נצפה בזנים המוטנטיים. UBC 7 נדרש לחלוטין עבור DEG אחד VMAU שלוש פירוק המאפשר הערכה מדויקת אפילו של ההשפעות החלקיות של מוטציות E two שונות. בהתאם לכך, קינטיקה של צמיחה מהירה נצפתה בתאים המבטאים UBC 7 עם מוטציות האתר הפעיל, C 89 s ו-N 81 A.In בנוסף, שתי מוטציות שנחזו לעכב בעקיפין DEG אחד VMA ETH שלוש פירוק V 20 5G ו-H 90 4K נמצאו גם כמשפרים את צמיחת התאים בהשוואה ל-UBC מסוג בר שבע, אם כי במידה פחותה מהמוטציות באתר הפעיל.

לפיכך, ניתן להשתמש בשיטת הזימים למדידה מדויקת של התרומה היחסית של גורמי פירוק שונים ליציבות של מצע מדווח. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהפרוטוקול רגיש להבדלים קטנים בשיעורי פירוק החלבון. זהו יתרון, אך זה גם אומר שיש לנקוט בזהירות בתכנון ואימות של הדרון לשימוש בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה כדי לענות על שאלות נוספות כגון מהי נטיית הצבירה של חלבונים מדווחים. מסיבה זו, מומלץ לכלול גם תג GFP בכתב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את השינויים בקצב פירוק החלבון בצורה שיטתית על ידי שימוש בקורא MICROPLATE ובתוכנה הייעודית שלנו.