Name: Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למדו לכמת קצבי פירוק חלבונים בצורה שיטתית באמצעות שימוש בתאי שמרים ובדיקת צמיחה בתרבית נוזלית. שיטה זו מספקת ניתוח פשוט ומודולרי של דרגות הפירוק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד"ר יובל רייס ולד"ר ויליאם ברויאר על הביקורת על כתב היד ולעומרי אלפסי על עזרתו בפיתוח מבחן המסך Ura3-GFP. אנו מודים גם לד"ר מ. הוכסטרסר ולד"ר ר. קולקה על פלסמידים וזנים. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה הישראלית למדעים (מענק 786/08) ועל ידי הקרן המדעית הדו-לאומית ארה"ב-ישראל (מענק 2011253).

תרבות 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את התאים המתאימים auxotrophic שמרים, כגון Try467 (טבלה 2), עם פלסמיד המכיל (א) URA3 -degron היתוך ו- (ב) סמן חילוף חומרים נוסף לבחירת פלסמיד ותחזוקה. הערה: דוגמא של פלסמיד המתאים היא YDpK-MET25p-Deg1-הדגל-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV) זה פלסמיד אינטגרטיבי שמרים המכיל חלבון היתוך הכולל Deg1 - degron נגזר משמרי השעתוק. גורם Mat2 17, epitope FLAG - לגילוי על ידי immunoblotting, Vma12 - חלבון ER יציב, וURA3 15,18 (איור 3 א). (ראה טבלה 3 לפלסמידים ששמשו במחקר זה ולדוגמאות נוספות של פלסמידים מתאימים.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחירת פלסמיד ותחזוקה, לשמור על תאים בצלחות אגר תחת סינטטי מתאים המוגדרות בינוני (SD) חסר סמני בחירת אמינו חומצה <sעד&gt; 19 (לדוגמא, Deg1 -UV נבחר וקיומם תחת מדיה סלקטיבית SD-LYS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי O / N ב 30 מעלות צלזיוס במדיום SD סלקטיבית מתאים לתחזוקת פלסמיד עד שיגיע לשלב נייח. לגדול תאים במבחנות או בצלחת 96-היטב, בהתאם למספר הדגימות שנבדק (סעיף 2). </li></ol> תא הכנה 2. לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מספר קטן של דגימות (N≤15) יש assayed, לדלל את התאים ולהחליף את המדיום באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 μl של תאים מO ​​/ תרבות N עם 150 μl של מדיום SD לכל גם ב96-גם צלחת (תחתון ברור). שים לב, לדוגמא הראשונה היא יועדה ריק מכילה בינוני בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע 600 OD הערכים של הדגימות בצלחת 96-היטב באמצעות קורא microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את OD בפועל 600 בכל טוב על ידי הכפלת קריאת OD 600 על ידי הגורם לדילול (x4), שמ&quot;שIch הערך של הקריאה ריקה מופחת. לנרמל את הערכים וכתוצאה מכך על ידי החלוקה ב -0.55 כדי להשיג נתיב באורך מחושב של 1 סנטימטר על פי חוק באר-למברט. שים לב, ערך זה הוא קבוע בעת מדידת OD 600 של 200 μl של תאים בצלחת 96-היטב סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח המדויק הנדרש להשגת תאי שמרים בסכום שווה ערך ל OD 600 של 0.25 ולהעביר אותו לצינור Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים במהירות גבוהה (12,000 XG) 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו resuspend התאים ב 1 מיליליטר של המדיום סלקטיבית המתאים (ראה סעיף 3.1) כדי לקבל OD 600 של 0.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 200 μl של הזנים מדוללים לבאר חדשה בצלחת 96-היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מספר גדול של דגימות (N&gt; 15) הוא להיבדק, לדלל את התאים ולהחליף את המדיום ללא מדידה OD 600 לפני, כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 10 μl של תאים נייחיםO הבוגר / N בצלחת 96-היטב לתוך צלחת 96-היטב חדשה המכילה 190 μl (דילול 1:20) של התקשורת סלקטיבית המתאימה (ראה סעיף 3.1). </li></ol></li></ol> 3. קינטיקה צמיחה בנוזל תרבות תחת תנאי סלקטיבי (GiLS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי התקשורת הבא למדידות צמיחה באמצעות כתב URA3-degron: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת חיובית של צמיחת שמרים בתנאים שאינם מגבילים, SD תקשורת סלקטיבית פלסמיד השימוש (ראה סעיף 1.2). אם לא נדרשת בחירת פלסמיד, למשל, בעת השימוש בפלסמיד אינטגרטיבי כגון Deg1 -UV, בינוני SD המכיל את כל החומצות האמיניות הדרושות (SD מלא) ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות ניסוי מדידת צמיחה בתנאים מגבילים, להשתמש בינוני SD-URA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר קורא microplate multimode ל:. טמפרטורת דגירה של 30 מעלות צלזיוס, OD 600 מרווחי מדידה של 15 דקות, ומחזורים מסלולית וליניארי רועד של 1 דקות כל שבע דקות &lt;br /&gt; הערה: המצב הכפול הזה יזעזע את האמות היה מותאם כדי להשיג חלוקה הומוגנית של תאים; עם זאת, מצבים רועדים אחרים או אפילו לא רעד יכולים לעבוד גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס בmicroplate קורא O / N או עד תאים הגיעו השלב הנייח (HR 12-24). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הנתונים הגולמיים לקובץ גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע קינטיקה צמיחת שמרים באמצעות MDTcalc, תוכנה מותאמת אישית, שמחשבה את הזמן המינימלי (בשעות) לתאים להכפיל את גודל האוכלוסייה שלהם (זמן הכפלה מינימאלי (MDT); לפרטים ראו סעיף 4). </li></ol> 4. חישוב זמן הכפלה המינימלי (MDT): עקרונות של אלגוריתם MDTcalc הערה: עקרונות של אלגוריתם MDTcalc, באמצעות מדגם מייצג של תאי Try467 שמרים (טבלה 2) גדלו בתקשורת מלאה SD, באות לידי ביטוי בטבלה 1 ואיור 1, מראה מגרשי גיליון אלקטרוני נתונים וצמיחה, respecבקנייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסר OD 600 ערכים ריקים, שהושג בבאר בהתאמה, מכל אחת מהקריאות המתקבלות גם במדגם. מחלקים את ההפרשים נובעים ב -0.55 (ל96-גם צלחות) כדי לתקן את אורך נתיב אור. העלילה הערכים הסופיים (טבלת 1, Trans.) נגד זמן כדי לייצר את עקומת צמיחת שמרים בפועל (OD 600 / hr) (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב יומן 2 (OD 600) לכל אחד מהערכים הפכו להמיר את שלב צמיחת לוגריתמים לעקומה ליניארית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את השיפוע של מרווח 10 נקודות זמן (N = 10) מתחיל בשעה 0 ומרגש נקודת זמן אחת בכל פעם, עד N &lt;10 (טבלה 1, מדרון; איור 1 ג &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הערך ההופכי של כל מדרון כדי לקבל את הזמן הדרוש לאוכלוסיית התאים להכפיל (טבלת 1, 1 / מדרון; איור 1 ג &#39;). לחשב המינימלי1 / ערך מדרון כדי לקבוע את MDT (טבלת 1, המלבן שחור; איור 1 ג &#39;). חלץ את MDT שחושב לתאים במדגם (טבלה 1, 1 / סלופ, מלבן שחור) מהמרווח שנבחר הזמן (טבלת 1, שתואר על ידי מלבן אדום, איורים 1B, 1D). הערה: שיעור צמיחת תאים במדיום SD-URA הוא ביחס הפוך לMDT. </li></ol> 5. שימוש MDTcalc <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את קבצי תכנית בתוספת לתיקייה ייעודית במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שקובץ הגיליון האלקטרוני המכיל נתוני הצמיחה נשמר ונסגר. פתח את תכנית יישום MDTcalc לראות את תחילת הופעת מסך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המידע הנדרש, כפי שהודגם באיור 2: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;נתיב קובץ&#39;, לחץ על המלבן בצד הימין כדי לאתר את קובץ הגיליון האלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;שם גיליון&#39;, לכתוב את שם הגיליון האלקטרוני שבו לאהוא מידע גולמי נמצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;החל העמדה, להכניס את הגיליון האלקטרוני לתאם זמן 0 מהמדגם הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;עמודת זמן&#39;, להכניס את המכתב המגדיר את המיקום של עמודת נקודת הזמן (הזמן צריך להינתן בשניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;עמודה ריקה&#39;, להכניס את המכתב המגדיר את המיקום של העמודה ריקה (בדרך כלל, אך לא בהכרח ובA1 של צלחת 96-היטב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת &#39;ערך OD &quot;, לבחור ערך OD 600 המינימלי הפך נדרש לייזום חישוב MDT (בדרך כלל .15-.25). הגדרת ערך זה מונע חישובים של MDT לתרבויות בשלב פיגור עקב דילול מוגזם, כך שMDT מחושב רק עבור דגימות המגיעות לערך OD 600 המוגדר או גבוה יותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהערך האחרון כבר נכנס, לחץ על הכפתור &#39;המחשבון&#39; בחלק התחתון של המסך. ודא שסרגל ההתקדמות בצד הימין משתנה בהדרגה לזנענעה. אל תפתחו את קובץ הגיליון האלקטרוני במהלך תהליך החישוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא שתי קבוצות של נתונים המופיעות באופן אוטומטי על המסך בסיום חישוב MDT לגיליון אלקטרוני. יש לוודא שהנתונים כוללים: (א) ערך MDT לכל טוב שעובר את מבחן ערך OD המינימלי (כמפורט בסעיף 5.2.1.6) ונקודת הזמן הראשונית של הרווח ממנו MDT חושב (ב) (התחל זמן). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li>
<li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li>
<li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+the+cell+cycle%3A+with+this+RING+I+do+thee+destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li>
<li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT%CE%B12+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li>
<li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica.%2C+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li>
<li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li>
<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li>
<li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li>
<li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms%3A+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li>
<li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope%2Fendoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li>
<li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li>
<li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li>
<li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator%3A+the+yeast+2+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li>
<li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li>
<li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuthrie%2C+C+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. 194, Academic Press. (1991).</li>
<li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li>
<li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li>
<li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li>
<li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li>
<li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים assay המבוסס על צמיחת תאים לקביעת תעריפי פירוק חלבונים יחסית, המכונה &quot;קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי &#39;(GiLS). יש assay GiLS מספר יתרונות: זה פשוט להגדיר, רכישת נתונים וניתוח הוא פשוט וזה מאוד מודולרי. כתוצאה מכך, יכול להיות מיושם GiLS בו-זמנית לדוגמאות רבות בפורמט ידידותי למשתמש רב גם צלחת שיכול להיות מותאם לאוטומציה ליישומי תפוקה גבוהות. והכי חשוב, GiLS מספק נתונים לשחזור ביותר, כמותי וחזקים וגמיש יותר ממבחנים מבוסס צמיחה אגר-צלחת שיבחרו לצמיחה ...

מערכת השפלה יוביקוויטין-פרוטאזום היא מכונה רגולטורים גדולה, שהיה מעורבת בשמירה על הומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. UPS תחילה conjugates מולקולות יוביקוויטין מרובים לחלבון מטרה לאחר שחלבון פולי-יוביקוויטין מתויג הוא מושפל על ידי הפרוטאזום 26s. ברוב המקרים, שיעור הגבלת צעד להשפלת יוביקוויטין תיווך הוא ubiquitylation מצע, בתיווכו של E2 ו- E3 conjugating אנזימי ligating אנזימים (Ligases E3) 1. כתוצאה מכך, יציבות תאית של חלבונים ספציפיים משקפת את הרגישות שלהם ליוביקוויטין-נטיה ואת הפעילות של אנזימי ubiquitylation המקור שלהם. ligases E3 הם מרכיבי הכרת המצע העיקריים של UPS. ככזה, אנזימים אלה להכיר degrons בתוך מצעים שלהם, כי הם קיימים או לא נחשפו בעמיתים שלהם יציבים 2. לדוגמא, רגולטורים רבים של מ &#39;מחזור התאיוסט להיות מסונתז ומושפל באופן באופן זמני ספציפי על מנת לשמור על התקדמות מחזור התא כדי. הפירוק של חלבונים אלה נשלט בדרך כלל על ידי זרחון, בתיווכו של קינאז המוסדר איתות התא 3,4. מצד השני, מוכרים חלבונים מקופלים aberrantly דרך degrons הנסתר. אלה הם אזורים שהם בדרך כלל חבויים במבנה היליד ונחשפים על ההפרעות מבנה. degrons אלו כולל תחומים הידרופובי 5-7 ומגזרים במהות סדר 8. מאז גילוי הזרע של יוביקוויטין-המערכת לפירוק חלבונים ואפיון של עקרונות היסוד שלה בlysates reticulocyte 9, שמרי גנטיקה סייעה בגילוי רב של הרכיבים במערכת היוביקוויטין 10. ההצלחה של שמרי כאורגניזם מודל לניתוח שיטתי של פירוק חלבונים על ידי UPS היא בעיקר בשל העובדה כי UPS היא גבוההly נשמרים בכל אאוקריוטים 4, בשילוב עם amenability כמערכת ניסיונית. ואכן, מערכות המבוססים על שמרים בדרך מועסקות לפענח את מנגנוני פעולה של מכונות ubiquitylation. לומד פירוק חלבונים באמצעות יוכימיים בדרך כלל דורש הכנת תמציות תא. בעוד ניתן לחלץ חלבוני תא חי בתנאים מתונים יחסית השומרים על אינטראקציות חלבון ותפקוד, הנוכחות של דופן תא חזקה בשמרים 11 דורשת תנאי הפרעה להחמרה ניכרת שבעלולים להשפיע על התאוששות חלבון. ואכן, הליכים שונים להפרעת תא שמרים להשתנות במידה ניכרת ביכולתם לשחזר את החלבונים שלמים בסכומים שבצורה נכונה לייצג השפע הסלולרי היחסי שלהם. אי דיוק נוסף טמון בשיטות השונות מועסקות לקביעת תעריפי פירוק של חלבונים ספציפיים: ניסויי מטבוליות המבוסס על תיוג &quot;דופק מרדף&quot; אחרי immunoprecipitation, כדי לבודד חלבונים ספציפיים 12, הוא לעתים קרובות לא כמותי בקפדנות. לכן, כאשר פירוק חלבונים בהשוואה בשיטה זו, זהירות צריכה להיות למימוש בלפרש את התוצאות. כדי לעקוף את זה חסרון, יכול להיות מועסק assay מרדף cycloheximide חלופי (CHX) 12. ב assay זה, מעכב התרגום יתווסף לתרביות תאים ושינויים זמניים ברמות מצב יציב חלבון נמצאים במעקב בהמשך. עם זאת, השימוש בCHX מוגבל לחלבונים עם מחצית חיים קצרים יחסית (&lt;90 דקות), כמו עיכוב ארוך טווח של סינתזת חלבון הוא רעיל לתאים. יש לציין, שניהם מבחני הנ&quot;ל דורשים שימוש בנוגדנים ספציפי לחלבון, שאינם תמיד זמינים. כדי להתגבר על מגבלות טכניות אלה, חוקרים פיתחו כמה גישות שאינם דורשים מיצוי תא וטיפול חלבון ישיר. גישה אחת מבוססת על הקמת כן auxotrophicזני st, שהושגו על ידי המחיקה של גני המקודדים אנזימים מטבוליים חיוניים. גנים אלה כוללים HIS3, LEU2, LYS2 וTRP1, קידוד לאנזימים דרושים לסינתזה של חומצות אמינו, כמו גם URA3 שמקודד decarboxylase OMP (URA3), אנזים חיוני של סינתזת ribonucleotide פירימידין. URA3 כבר בשימוש נרחב במחקרי פירוק חלבונים. במבחנים אלה, ביטוי מכונן של URA3 מציל צמיחה של תאי URA3 במדיום אורציל לקוי 13. כתוצאה מכך, ערעור יציבות URA3 באמצעות השילוב של degron יכולה להפחית צמיחת תאים באורציל הבינוני חסר המינימלי. שיטה זו נעשתה שימוש במחקרי פירוק חלבונים שונים, כוללים זיהוי של השפלה גורמי 5, E3 ligases 14 וubiquitylation עזר גורמי 15 וגילוי degrons UPS רומן 16. כל השיטות האלה מועסקות צמיחת תאים על צלחות אגר כקריאת assay. עם זאת, לאהוא קריטריון צמיחה (צמיחה חיובית / שלילית), ואילו חזק ויעיל, הוא בעיקר איכותי ואינו מספק מידע כמותי שהוא חשוב להערכת העוצמה של degron או את תרומתו היחסית של גורמי השפלה עזר שונים. לכן פיתחנו ומנוצלים וקטורי שמרים ושיטות הקרנה המאפשרים ניתוח שיטתי וכמותית של פירוק חלבונים על ידי URA3 -degron מערכת היתוך. הפרוטוקול מבוסס על assay-לידית קלה המודד קינטיקה צמיחה בתרבות נוזלית בתנאי סלקטיבי (GiLS) ועל הדור של עקומות גדילה סטנדרטית. קינטיקה צמיחת שמרים מתאפיינות בשלושה שלבים עיקריים - הפיגור, מעריכי (יומן) ושלב הנייח. חישוב קינטיקה שמרי שכפול בשלב היומן בתנאים סלקטיבית, אשר נקבע על ידי רמות ביטוי של URA3-degron, מספק o מדידת כמותית בלתי משוחדתפירוק חלבונים ו. שיטה זו יכולה להיות מיושמת למדידה והשוואה של שיעורי השפלה של מצעי UPS המרובים בו זמנית במספר רב של זנים ובתנאים שונים.

<table><tbody><tr><td>בסיס חנקן שמרים Difco ללא חומצות אמינו ואמוניום גופרתי</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>לגידול שמרים על מדיה מינימלית SD.&nbsp; חומצות האמינו שיסופקו הן: ארגינין, היסטידין, איזולאוצין, לאוצין, ליזין, מתיונין, פנילאלנין, תראונין, טריפטופן</td></tr><tr><td>אמוניום סולפט</td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>אדנין</td><td>סיגמא - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>חומצות האמינו</td><td>הגבוהות ביותר טוהר זמין&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>ניתן להשתמש בכל מותג תואם אחר</td></tr><tr><td>Cyclohexamide&nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>עובד conc. 0.5 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>סדרת Infinite 200 PRO</td><td>Tecan</td><td></td><td>לדגירת שמרים ומדידות OD600. ניתן להשתמש בכל קורא תואם אחר הנשלט על ידי זמנים.</td></tr><tr><td>MDTcalc</td><td></td><td></td><td>תוכנה ניסיונית</td></tr></tbody></table>

assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

פירוק חלבונים על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום (UPS) הוא מנגנון רגולציה עיקרי להומאוסטזיס חלבון בכל אאוקריוטים. הגישה סטנדרטית לקביעת פירוק חלבונים תאיים מסתמכת על מבחני ביוכימיים לבעקבות קינטיקה של ירידת חלבון. שיטות כאלה הן לעתים קרובות מייגע וגוזלים זמן ולכן לא ניתן לניסויים שמטרתם להעריך את מצעים מרובים ותנאי השפלה. כחלופה, מבחני מבוססי צמיחת תאים פותחו, שהם, בפורמט קונבנציונלי, מבחני נקודת סיום שלהם שלא ניתן לקבוע כמותית שינויים יחסי ברמות חלבון. כאן אנו מתארים שיטה שבנאמנות קובעת שינויים בשערי פירוק חלבונים על ידי צימודם לקינטיקה תא צמיחת שמרים. השיטה מבוססת על מערכת בחירה הוקמה בי auxotrophy אורציל של URA3 -deleted תאי שמרים הוא חולץ על ידי חלבון כתב הביע באופן אקסוגני, מורכב מהיתוך בין גן URA3 החיוני ומכריע השפלה (degron). חלבון הכתב מתוכנן כך ששיעור הסינתזה שלה הוא קבוע בזמן שקצב הפירוק שלה נקבע על ידי degron. כצמיחת תאים במדיום אורציל הלקוי היא פרופורציונלית לרמות היחסית של URA3, קינטיקה הצמיחה הן תלויה לחלוטין בפירוק חלבוני כתב. שיטה זו מדויקת מודדת שינויים בקינטיקה פירוק חלבונים תוך-התאית. זה היה מוחל על: (א) הערכת התרומה היחסית של גורמי conjugating היוביקוויטין ידועים proteolysis (ב) E2 מבנה-תפקוד אנזים conjugating מנתח (ג) זיהוי ואפיון של degrons רומן. יישום של המערכת מבוססת URA3 degron- מתעלה תחום פירוק החלבונים, כפי שהוא יכול גם להיות מותאם לשינויי ניטור של רמות חלבון הקשורים לפונקציות של מסלולים סלולריים אחרים.

חוקר את תפקידם של אנזימים של מסלול Doa10 בהשפלתו של מצע כתב כדי לבדוק את תקפותה של שיטת GiLS זה היה בהשוואה לassay השפלה מסורתית. ניסוי זה מעריך את תרומתו היחסית של רכיבים של ER-הקרום מקומי Doa10 E3-האנזים מורכב 20,21 לזילות של מצע כתב בקרת איכות חלבון Deg1- VU (איור 3 א). פלסמיד Deg1- VU שולב תאים מסוג בר או לתאים חסרי הגן לאנזים conjugating...

כאן אנו מתארים בדיקה ביולוגית חזקה לכימות השיעור היחסי של פרוטאוליזה על ידי מערכת היוביקוויטין-פרוטאזום. קריאת הבדיקה היא קצב גידול השמרים בתרבית נוזלית, התלוי ברמות התאיות של חלבון מדווח הכולל אות פירוק המותך לסמן מטבולי חיוני.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את השינויים בשיעורי פירוק החלבון בצורה שיטתית על ידי צימודם לקינטיקה של גידול שמרים בתרבית נוזלית. זה מושג על ידי תאים גדלים ראשונים המבטאים חלבון מדווח המורכב מאות פירוק המחובר לסמן מטבולי בן לילה לשלב נייח בתווך סלקטיבי מתאים. לאחר מכן, נמדדת הצפיפות האופטית של התאים כדי לקבוע את קינטיקת הצמיחה של התאים, ולאחר מכן מחושב זמן ההכפלה המינימלי של התאים במהלך שלב הלוג מקינטיקה של הגידול באמצעות תוכנה ייעודית.בסופו של דבר, ניתן להשתמש בזמן ההכפלה המינימלי המחושב כדי להגדיר וריאציות בקינטיקה של פירוק החלבון. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ציקלמט או מבחני השפלה של מרדף דופק הוסיפו שהטכניקה שלנו פשוטה להגדרה. רכישת הנתונים וניתוחם הם פשוטים, ועיצוב החיבור הוא מודולרי ביותר.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום פירוק הסיר, כגון אילו אלמנטים נדרשים לזיהוי סיר לא מקופל על ידי מערכת סיר היוביקוויטין. הרעיון לשיטה הזו עלה לי לראשונה כשרציתי לעשות סקר כדי לזהות את החלבונים הכוללים הסרת יוביקוויטין מתת-הקבוצה שלהם. אז יצרתי דרך פשוטה להשוות מספר דגימות כדי להכין את התאים לניתוח.התחל בהפיכת תאי השמרים האטרופים המתאימים כגון TRY 4 67 עם פלסמיד המכיל היתוך U three Deron וסמן מטבולי נוסף לבחירה ותחזוקה של פלסמיד. לבחירת פלסמיד ותחזוקה

reporter-based-growth-assay-for-systematic-analysis-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה כדי לעקוב אחר פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים מתוארת. Degron-מעורער GFP-(GFP-DGN) וחלבון היתוך יציב GFP-dgnFS נוצר וtransduced לתוך התא באמצעות וקטור ביטוי lentiviral. טכניקה זו מאפשרת ליצור קו יציב GFP-dgn/GFP-dgnFS להביע תא שבו פעילות היוביקוויטין-הפרוטאזום ניתן להעריך בקלות באמצעות epifluorescence או cytometry זרימה.

ניטור של פעילות יוביקוויטין-הפרוטאזום בתאי חיים באמצעות ערער-חלבון Degron (DGN) ירוק פלורסנט חלבון (GFP)-מבוסס כתב

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת צבירת חלבונים מבוססת תאים באמצעות מעכבי פרוטאזום, אשר חוסמים את פעילות הפרוטאזום, ומונעים מחלבונים מוטנטיים שאינם מקופלים כהלכה, מאוחים לתווית פלואורסצנטית, לעבור פירוק פרוטאזומלי תלוי יוביקוויטין, המוביל להצטברותם בתוך הציטופלסמה של התא. לאחר מכן מדמיינים את צברי החלבונים ומכמתים אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

סרטון זה מתאר בדיקת פירוק עבור חלבונים שאינם מקופלים כהלכה באמצעות טיפול cycloheximide יחד עם שבר דטרגנט. שיטה זו מסייעת בחקר הדינמיקה של חלבונים שאינם מקופלים כהלכה ובחשיפת המנגנונים המעמיקים של תחלופת החלבונים.

בדיקת פירוק חלבון נוטה לקיפול שגוי: טכניקה לניטור פירוק חלבון מקופל בצורה שגויה באמצעות טיפול בציקלוהקסימיד ושבירת חומרי ניקוי

פירוק חלבונים ממוקד מייצג מנגנון רגולציה עיקרי לתפקוד תא. היא מתרחשת באמצעות מסלול היוביקוויטין-proteasome נשמרים, אשר מייחס רשתות polyubiquitin לחלבון המטרה שלאחר מכן ישמש "תגים" מולקולריים להפרוטאזום 26S. כאן, אנו מתארים assay תא ללא פשוט ואמין לשפלת proteasomal של חלבונים.

מנסה לאמוד השפלה proteasomal במערכת תא ללא בצמחים

בדיקת המדווח הגנטי היא כלי מבוסס ורב עוצמה לניתוח הקשר בין רצפי DNA לפעילויות ויסות הגנים שלהם. צימוד אלמנטים רגולטוריים מועמדים לגנים מדווחים הנושאים תגי רצף מזהים מאפשר הקבלה מסיבית של מבחנים אלה.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

דוח זה מתאר פרוטוקולים למדידת שיעורי פירוק של חלבונים לא מקופלים על ידי כתם מערבי או מבחנים מבוססי פלואורסצנטיות. ניתן ליישם את השיטות לניתוח של חלבונים אחרים שקופלו בצורה לא נכונה ולסינון תפוקה גבוהה.

מבחנים עבור הפירוק של חלבונים בתאים Misfolded

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת חלבון מחצית החיים של תאים חסיד חי אחד, באמצעות הדופק תיוג פלורסצנטיות הדמיה בצילום מואץ של חלבונים פיוז'ן SNAP-תג.

תא בודד כימות של חלבון השפלה המחירים על-ידי קרינה פלואורסצנטית זמן לשגות מיקרוסקופ בתרבות תא חסיד

פרוטוקול זה מתאר את הגילוי הכמותי של קינטיקה של פירוק חלבונים בתאים חיים שהונדסו באמצעות CRISPR/Cas9 כדי לבטא תג זיהוי חלבון אנדוגני נטול נוגדנים שהתמזג עם חלבון מטרה. הוראות מפורטות לחישוב וקבלת פרמטרי השפלה כמותיים, קצב, Dmax, DC 50 ו- Dmax50 כלולים.

פרופיל תאי בתפוקה גבוהה של תרכובות ממוקדות לפירוק חלבונים באמצעות קווי תאי HiBiT CRISPR

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה לתיוג מטבולי של תאים סניסנטיים ולא מתחלקים עם SILAC פועם, ניתוח ספקטרומטריית מסה לא ממוקדת וחישוב יעיל של זמן מחצית חיים של חלבונים.

מדידת שיעורי תחלופת חלבונים בתאי תרבית סנסנטיים ולא מתחלקים באמצעות תיוג מטבולי וספקטרומטריית מסה

למדו לכמת קצבי פירוק חלבונים בצורה שיטתית באמצעות שימוש בתאי שמרים ובדיקת צמיחה בתרבית נוזלית. שיטה זו מספקת ניתוח פשוט ומודולרי של דרגות הפירוק.

Assay צמיחה מבוסס כתב ניתוח שיטתי של פירוק חלבונים

גלה סרטונים נוספים