ניתוח "מטען מיפוי" המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

המטרה הכוללת של מיפוי מטענים היא לקבוע את הכמות והסוג היחסי של חלבונים מוטוריים מולקולריים הקשורים ומניעים מטענים שלפוחיתיים, ולתאם את הרכב המנועים הזה עם כיווניות של תנועת מטען חי. זה מושג על ידי גידול ראשון של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של עכבר במכשירים מיקרופלואידיים כך שהאקסונים גדלים ישר יחסית ועל ידי רישום התנועה התוך-תאית החיה של חלבוני מטען המסומנים פלואורסצנטית באקסונים של נוירונים שעברו טרנספטציה חולפת. השלב השני הוא לתקן נוירונים במהלך הדמיית מטען חי ולאחר מכן לצבוע את האקסונים בנוגדנים כנגד חלבונים מוטוריים מולקולריים כגון קינזין ודין, ולאחר מכן הדמיית מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית.

לאחר מכן, תמונות המטען והמנוע הקבועות מיושרות לעלילות תנועת המטען לאורך זמן, הנקראות גם קראפטים על מנת לתאם את תנועת המטען החי עם המנועים הקשורים המוכתמים כפי שנקבע על ידי הצביעה האימונו-פלואורסצנטית. השלב האחרון הוא לקבוע את מיקומי תת-הפיקסלים של חלבוני מטען ומנוע באמצעות חבילת תוכנת MATLAB שפותחה בהתאמה אישית הנקראת קולוקליזציה מוטורית. תוכנה זו מספקת את קואורדינטות ה-XY המדויקות של כל מטען ומיקום מנוע, כמו גם את הכמות היחסית של עוצמות הקרינה הקשורות למטענים ומנועים.

בסופו של דבר, מתאם של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מטענים ומנועים חיים וקבועים ברמת רזולוציית תת-פיקסלים מספק מידע על סוגי המנועים הקשורים למטענים ספציפיים שעבורם ידועה כיווניות התנועה. אז שיטה זו מספקת תובנה לגבי מנגנון הובלת האקסון. ניתן ליישם אותו במחקרים אחרים המתאמים מיקרוסקופ חיים עם צביעה אימונו-פלואורסצנטית, כגון איגוד החלבונים למיקרו-צינורות במהלך דינמיקה של צינוריות מיקרוט או גיוס חלבונים במהלך אנדוציטוזיס.

הדגמה חזותית של שיטה זו תעזור לבצע את שלבי קיבוע וניתוח ההדמיה, שאחרת עשויים להיות קשים ללמידה מכיוון שהם דורשים הגדרה מיוחדת. הנוירונים הראשוניים של ההיפוקמפוס של העכבר להליך זה מוכנים כפי שמיוחס בטקסט הפרוטוקול ומושעים מחדש בגידול ביציות נוירו-בסיסיות. בינוני לצלחת הנוירונים במכשיר המיקרופלואידי.

הסר את המדיום מהמאגר המיקרופלואידי אחד ואחד ראשוני. מרחו 20 מיקרוליטר של תאים על המאגר המיקרופלואידי ואפשרו להם לזרום דרכו. הנח את המכשיר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך 20 דקות.

הסתכל מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נדבקו לזכוכית המכוסה. הוסף נוירו-בזאלי, מצע גידול כדי למלא את כל המאגרים. החזר את המכשיר עם התאים לחממה עד היום התשיעי.

בתרבית, הנוירונים מרחיבים אקסונים דרך תעלות המיקרו ומוכנים לטרנספקציה לביטוי חלבונים פלואורסצנטיים. ההדמיה החיה של תאי העצב הראשוניים של ההיפוקמפוס של העכבר מבוצעת במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי הפוך, המצויד באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ותא בקרה CO2. כדי להתחיל בהליך זה, בחר במטרה 100 x שמן.

מרחו שמן על המטרה והרכיבו את החלקת הכיסוי עם נוירוני ההיפוקמפוס הגדלים במכשיר מיקרופלואידי על שלב המיקרוסקופ. כדי למנוע מוות עצבי, עבדו במהירות כדי לשמור את הדגימות במיקרוסקופ לא יותר משעה. מצא אקסונים של תאים שעברו טרנספטציה המשתרעים דרך תעלות החדר המיקרופלואידי.

רשום את מספר הערוצים שבהם נמצא האקסון המועבר. ספור את מספר הערוצים באמצעות מונה ספירה ידנית להקלטה אופטימלית של תנועה חיה וניתוח קולוקליזציה לאחר מכן. בחר אקסונים שגדלים שטוחים יחסית דרך הערוצים כך שניתן יהיה לבצע הדמיה של רוב השלפוחיות במיקוד.

כדי להקל על יישור לאחר מכן של תמונות קבועות עם מסלולי תנועה על שתל chm. יישר את הקצה הימני של ערוצי המיקרו עם שדה הראייה במהלך ההדמיה. על מנת לתקן בהצלחה את התאים במהלך הדמיה חיה, ההליך מבוצע בצורה הטובה ביותר עם שני אנשים, אדם אחד להוסיף את הקיבוע ואדם אחר כדי להתאים את המיקוד.

חשוב גם שכל הריאגנטים יהיו מוכנים ובהישג יד. באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק של מיליליטר אחד. הסר את רוב המדיום מהמאגרים שניים ושניים של Prime Start המדמה תנועת מטען חי עם מפרטי זמן-lapse ספציפיים לדינמיקת ההובלה של המטען המנותח.

לאחר שנאספו מספיק נתוני תנועה חיים, בקש מאדם אחד למלא את המאגרים שניים ושניים ראשוניים עם קיבוע מחמם מראש. הימנע מלגעת במכשיר המיקרופלואידי מכיוון שהדבר ישבש את מיקוד ההדמיה החיה. בקש מהאדם השני להתאים את המיקוד בזמן הוספת הקיבוע.

באותו אופן, מלא את המאגרים אחד ואחד ראשוני בקיבוע הקיבוע מוצלח כאשר נצפית הפסקה מיידית של התנועה. לאחר מכן, הנוירונים הקבועים מוכתמים בנוגדנים כנגד חלבונים מוטוריים אנדוגניים ומצולמים כמתואר בטקסט הפרוטוקול. כדי להתחיל במיפוי מטענים יש ליצור כרומוגרף של תנועת המטען באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

תוסף Image J שפותח על ידי Rich Dorf Insights מומלץ ליצירת קראפט באמצעות תוכנה גרפית זמינה מסחרית ליישר ידנית את תמונת האימונופלואורסצנציה של המטען לגרף CHM של תנועת המטען, להניח את פונקטה המטען על מיקום המסלולים בגרף chm בנקודת הקיבוע כך שכל פונקטה מטען מתאימה למסלול ספציפי בגרף CHM. לקבלת תוצאות היישור הטובות ביותר, השתמש בפרוסת Z שנמצאת במיקוד הטוב ביותר עבור המטען הממופה. ניתן להשתמש במספר פרוסות Z לכל תמונה באוסף Z.

קבע את קואורדינטות ה-XY ואת אמפליטודות העוצמה עבור כל פונקטה פלואורסצנטית באמצעות אלגוריתם מבוסס כדי להתאים גאוס דו-ממדי לפונקציית התפשטות הנקודה המייצגת את מקורות הנקודה בכל אחד משלושת הערוצים. כדי להשיג את קואורדינטות ה-XY, פותחה חבילת תוכנת MATLAB שנבנתה בהתאמה אישית הנקראת לוקליזציה מוטורית, המשלבת אלגוריתם התאמה גאוס שפותח על ידי Yakima DONA ועמיתיו עבור כל אחד מפונקטות המטען הבודדות שמופו על המסלולים הניידים או הנייחים. בגרף Kog, בחר את קואורדינטות ה-XY ואת אמפליטודות העוצמה מהתוצאות של תוכנית הקו-לוקליזציה המוטורית.

השתמש במספר תמונות Zack כדי למפות מטענים נוספים שנמצאים במישורי מוקד שונים. השווה את קואורדינטות ה-XY הבודדות עבור המטען הממופה לאלו המתקבלות עבור כל אחד מערוצי המנוע בפרוסת Z המתאימה. קבע ובחר את קואורדינטות מנוע ה-XY שנמצאות ברדיוס של 300 ננומטר מהמטען עבור מטענים ומנועים שאותתו באותו מישור מוקד.

השתמש בחבילת תוכנת הקולוקליזציה של המנוע כדי לקבוע את הפונקטה הממוקמת ברדיוס של 300 ננומטר. מיפוי מטענים שימש למתאם בין הובלת שלפוחיות הנושאות חלבון פריון רגיל המתויג בחלבון פלואורסצנטי צהוב או Y-F-P-P-P-R-P-C עם כמויות יחסיות של קינזין ומנועי דיין באקסונים. גרף זה מציג את תנועת השלפוחית F-P-P-R-P-C והקו המקווקו מציין את זמן הקיבוע במהלך הדמיה חיה.

תמונות פלואורסצנטיות של שלפוחיות Y-F-P-P-R-P-C קבועות, כמו גם תמונות האימונופלואורסצנטיות המתאימות של Kinesin Light Chain One ו-Dine מיושרות לכרומוגרף. הגדלה זו מציגה אותות אימונופלואורסצנטיים של כל אחד משלושת הערוצים עם הקצאות פונקציות ג'יאן דו-ממדיות. גרף זה מייצג את כימות הקולוקליזציה בין שלפוחיות Y-F-P-P-P-R-P-C, שרשרת קלה של קינזין אחת וסעודה בתאי עצב מסוג פרא ובתאי עצב חסרי שרשרת כבדה של קינזין.

הכמות היחסית של שרשרת קלה של קינסין אחת וסעודה הקשורה לשלפוחיות Y-F-P-P-R-P-C מתקבלת מהאמפליטודות הגאוסיות ומתוכננת לבחון מתאמים אפשריים בין כמויות מוטוריות יחסיות וכיווניות התנועה. דוגמה זו מנוירונים פראיים מצביעה על כך ששלפוחיות Y-F-P-P-R-P-C, הנעות או נייחות קשורות לשרשרת הקלה של KINESIN אחת או לסעוד או לשניהם לאחר שליטה בטכניקה זו ניתן לבצע תוך שלושה ימים. בנוסף לכ-10 ימים של הכנת הדמיה טרום EM של מכשירי המיקרו-פיליק והנוירון הראשוני, תוך שלושה ימים, תוכל לבצע הדמיה חיה של צביעה אימונו-פלואורסצנטית וניתוח נתונים.

אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתעד תנועה חיה של מטענים ותאי עצב עם תווית פלואורסצנטית שגודלו במכשירים מיקרופלואידיים. כיצד לתקן תאי C במהלך הדמיה, כיצד לנתח קולוקליזציה כרזולוציית תת-פיקסלים, וכיצד לתאם את הקו-לוקליזציה של מטענים וחלבונים מוטוריים מולקולריים עם תנועת מטען.