כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את השינויים היחסיים ברמת החלבון בצנטרוזומים בתנאים שונים. לדוגמה, בנקודה מסוימת במחזור התא לאחר עיכוב הפרוטאזום, זה מושג על ידי טיפול ראשון בתאים הגדלים על החלקות כיסוי עם מעכב הפרוטאזום MG one 15 או עם ממס הבקרה DMSO. ואז מיד להוסיף BRDU לשני התאים ולדגור אותם במשך ארבע שעות באינקובטור תרבית תאים.

השלב השני הוא העברת החלקות הכיסוי לצלחת 24 בארות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, התאים מוכתמים בנוגדנים נגד BRDU והחלבונים המעניינים, ולאחר מכן בנוגדנים משניים מתאימים. השלב האחרון הוא רכישת תמונות של תאים חיוביים BRDU באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותוכנת הדמיה דיגיטלית כדי להחיל זמן חשיפה זהה ואורך ציר Z על תאים מכל דגימה.

לאחר מכן ניתוח התמונות כדי לכמת את הרמה היחסית של VDA C3 רומלי. בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כמותית כדי להראות כי המאגר הסנטרו סומלי של VDA C3 גדל פי שניים כאשר הפרוטאזום מעוכב במהלך שלב S. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ציטומטריית זרימה, ספיגה חיסונית או מיקרוסקופ כמותי, הוא שטכניקה זו מנתחת את הרמה הרומלית היחסית של החלבון בשתי דגימות שטופלו באופן שונה המעובדות על שתי החלקות כיסוי שונות. שיטה זו משתמשת בנורמליזציה לתקן פנימי כדי לשלוט בצורך לעבד את שתי אוכלוסיות התאים הניסיוניות.

בנפרד, אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות של חלבונים ספציפיים בצנטרוזומים. ניתן ליישם אותו גם במצבים אחרים כגון מבנים תת-תאיים אחרים או בחינת מאגרים ספציפיים של חלבונים הנמצאים במספר אתרים בתוך התא. מדגים את ההליך יהיה schu majumder, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי כדי להתחיל את הניסוי לעבור פעמיים כפול 10 לחמישי גידול אסינכרוני של תאי RPE אחד לתוך צלחות 35 מילימטר שהוכנו בעבר עם שפתי כיסוי ולגדל את התאים בשני מיליליטר של מדיום שלם.

החלף את מדיום התרבות כל 24 שעות במדיום טרום חם טרי לאחר 44 שעות. החלף את מדיום התרבית במדיום שלם המכיל 0.05% DMSO או MG אחד 15 בריכוז סופי של חמש מיקרומולר, ובמקביל הוסף BRDU לתאים בריכוז סופי של 40 מיקרומולר לדגור על התאים למשך ארבע שעות. לאחר מכן, העבירו כל תלוש כיסוי לצלחת 24 בארות.

הוסף 500 מיקרוליטר של מתנול מעובד מראש לכל באר ודגר את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לתקן את התאים. לאחר 10 דקות, יש לשטוף מיד את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה. דגרו את התאים הקבועים על הכיסוי, החליקו פנימה 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם למשך 30 דקות בזמן שהתאים דוגרים.

הכן תא לח על ידי הנחת מגבת נייר רטובה במחצית התחתונה של קופסת קצה פיפטה ריקה בנפח 1000 מיקרוליטר. הניחו רצועת בושם על משטח המתלה והוסיפו טיפה של 20 מיקרוליטר של הארנב נגד V DDA 3 ונוגדני גמא טובולין נגד גמא מדולל במאגר חוסם על הפרפורם. לאחר החסימה, הפוך את החלקת הכיסוי על כל טיפה של תמיסת נוגדנים.

ודא שהתאים שקועים וסגור את המכסה של קופסת הקצה. דגרו על התאים עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בתא הלח. הפוך שוב את פתקי הכיסוי והחזר אותם ל-24.

ובכן לשטוף כלים את הכיסוי מחליק, ואז לדגור אותם בתמיסה של 150 מיקרוליטר של נוגדנים משניים, מדולל במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, שטפו את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם מאגר כביסה. תקן את תא ה-RPE המוכתם ב-500 מיקרוליטר מתנול מקורר במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים התקבעו למשך 10 דקות, שטפו אותם שלוש פעמים במאגר כביסה.

לאחר מכן, דגרו על התאים ב-200 מיקרוליטר של שני HCL רגילים למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר יש לנטרל את התאים עם 300 מיקרוליטר של טריס CL pH מולארי אחד שמונה, ולשטוף את התאים שלוש פעמים. עם מאגר כביסה חוסמים את התאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר החסימה, דגרו על התאים עם נוגדן נגד BRDU של חולדות וחוצץ חוסם למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא הלח. החזר את החלקות הכיסוי בחזרה ל-24. ובכן לשטוף ולשטוף את התאים.

לאחר מכן, דגרו אותם עם נוגדן משני מדולל ב-150 מיקרוליטר של חיץ חוסם. בכלי 24 באר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם נקודת XPBS אחת, טיפה של שישה מיקרוליטר של תמיסת הרכבה המכילה מגיב אנטיפה על מיקרוסקופ זכוכית.

החלק הפוך את החלקת הכיסוי כשצד התא פונה כלפי מטה אל תמיסת ההרכבה. בעזרת רקמת ניקוי רכה, לחץ בעדינות על החלקת הכיסוי על השקופית כדי להסיר עודפי נוזלים אטום את החלקה על המיקרוסקופ. יש להחליק על ידי מריחת לק לאורך קצה החלקת הכיסוי.

השתמש במטרת טבילה בשמן APO של 100 x עם צמצם מספרי של 1.4 כדי לרכוש את התמונות של תאי RPE חיוביים של BRDU בטמפרטורת החדר. קבעו את מישור המוקד העליון והתחתון המתאים לאורך ציר Z עם גודל הצעד של 0.2 מיקרון, והשיגו תמונות לאורך ציר Z. לאחר מכן, בצע דה-קונבולוציה של כל ערימות התמונות שנרכשו לאורך ציר Z.

השג את הקרנת העוצמה הכוללת של כל תמונה. ערמו לאורך ציר Z עבור תאים שהצנטרוזומים שלהם מופרדים בפחות משני מיקרון. צייר ריבוע קטן של 20 עד 30 פיקסלים לכל צד סביב שני הצנטרוזומים וסמן את האזור שנבחר.

ציירו ריבוע גדול יותר של 24 עד 35 פיקסלים לכל צד סביב הריבוע הראשון וסמנו את האזור שנבחר בריבוע הגדול. לאחר מכן השג את השטח ואת עוצמת הקרינה הכוללת של כל פלואורו ארבע. בכל קופסה, חשב את עוצמת הקרינה המתוקנת ברקע של כל פלואורו. ארבע.

לבסוף, השג את עוצמת הקרינה המנורמלת של VDA C3 על ידי חישוב היחס בין עוצמת הקרינה המתוקנת ברקע של הפלואורו שלו. ארבעה מזה של הפלואורו, ארבעה ששימשו לתמונות הסטנדרטיות הפנימיות שנבחרו נלכדו משדות אקראיים של RPE הגדל באופן אסינכרוני, תא אחד מודגר עם BRDU ומעכב הפרוטאזום MG אחד 15 או ממס הבקרה DMSO ומציג DNA ו-BRDU. הרקע תיקן את עוצמת הקרינה המתאימה לסנטרו סומל.

VD 3 היה גבוה בערך פי 2.5 בתאי MG 15 שטופלו ואז בתאי ביקורת כפי שמודגם על ידי דיאגרמת הקופסה והשפם הזו. כאשר הנתונים נורמלו עבור סך כל הפלואורסצנטיות של VD שלוש לעומת זה של גמא טובולין, הקפל גדל, ירד מעט עד פי שניים בערך. צביעת VD C3 בציטים שאינם רומליים או ברמה התאית הכוללת של VD 3 לא הושפעו מעיכוב פרוטאזום.

לפיכך, המאגר הרומלי של VDA C3 מווסת על ידי השפלה מתווכת פרוטאזום. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי יש להעלות את הנוגדנים כנגד חלבון הבדיקה והתקן הפנימי במינים פונדקאים שונים וכי יש לרכוש את התמונות של שתי הדגימות באמצעות פרמטרי הדמיה זהים, כגון מספר הניתוחים הקיסריים וזמני החשיפה על מנת למזער את השפעת ההדמיה הדיגיטלית.