Name: כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למד שיטת immunofluorescence כמותית למדידת רמות חלבון בcentrosomes בתאים קבועים באמצעות נורמליזציה לסטנדרט פנימי. השיטה מאפשרת השוואה מדויקת בין מדגמים שעברו עיבוד נפרד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של המכונים הלאומיים לבריאות (GM77311) ומענק זרע מ-The Ohio Cancer Research Associates (ל-H.A.F). SM נתמך חלקית על ידי מלגת Up on the Roof מהתוכנית לגנטיקה של סרטן אנושי של מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת אוהיו.

תרבות 1. תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הטלומרז אנושי הפוך transcriptase (hTERT) תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית הונצחו (hTERT-RPE1; המכונה כאן RPE1). הערה: תאי RPE1 הם תאים קרובים דיפלואידי, שאינו הופכים אדם שמשמשים בדרך כלל כדי ללמוד הרכבה צנטריול וciliogenesis. תאים אלה בצעו מחזור שכפול צנטריול נורמלי מתואם עם מחזור תא מוסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר מנה כמעט ומחוברות 100 מ&quot;מ תרבית תאים של תאי RPE1 ב 1: 5 דילול של התרבות המקורית לתוך צלחת 100 מ&quot;מ טריים המכילה 10 מיליליטר של DME / F-12 (1: 1) בינוני בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS), 100 U / ml פניצילין G ו- 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (הבינוני המלאה נקרא כDME / בינוני F-12). לגדל תאים על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips זכוכית העגולה 12 מ&quot;מ ב 50 מיליליטר של 1 N HCl בכוס זכוכית מכוסה, O / N בלי לרעוד, ב 60 ° C באמבט מים או בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> After השלכת פתרון החומצה, לשטוף את coverslips שלוש פעמים ב 100 מיליליטר מים מזוקקים על ידי דוגרים למשך 15 דקות, כאשר מדי פעם טלטול. חזור על הכביסה באופן דומה, בשנת 70% אתנול ו -95% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש coverslips ידי בנפרד הפצה אותם על נייר סופג מעבדה בארון בטיחות ביולוגית, ואחריו עיקור בקרינת UV במשך 60 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2-4 coverslips היבש בצלחת תרבית תאי 35 מ&quot;מ. לדלל את הפתרון של פיברונקטין או פיברונקטין כמו פולימר מהונדס (ריכוז מניות של 1 מ&quot;ג / מיליליטר) לריכוז של 25 מיקרוגרם / מיליליטר בתרבית תאי PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 80-100 μl של הפתרון המדולל על coverslip כל דגירה במשך 60 דקות למעייל בצד העליון של coverslip. שטוף את coverslips שלוש פעמים באמצעות PBS לפני הוספה בינונית מלא. </li></ol></li></ol> 2. תאי גידול ותאי טיפול עם מעכבי פרוטאזום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר 2 x 10 5 אסינכרוני לגדולתאי ing RPE1 בכל מנה 35 מ&quot;מ המכילים coverslips ולגדול התאים 2 מיליליטר בינוני מלא. החלף את מדיום התרבות כל שעות 24 עם בינוני מלא מראש חימם טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את ההשפעה של עיכוב הפרוטאזום ברמת centrosomal של חלבון הבדיקה (כאן VDAC3 או γ טובולין), לגדול התאים בשתי מנות 35 מ&quot;מ במשך 44 שעות. החלף את מדיום התרבות עם מדיום להשלים ולהוסיף גם MG115 או DMSO כממס שליטה בריכוז סופי של 5 מיקרומטר או 0.05% בהתאמה. באותו הזמן, להוסיף BrdU לתאים בריכוז סופי של 40 מיקרומטר ודגירת תאים במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כל coverslip בצלחת 24 גם. להוסיף מתנול 500 μl המצונן היטב כל אחד ודגירת הצלחת ב -20 ° C במשך 10 דקות כדי לתקן את התאים על coverslips. מייד לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם 500 חיץ לשטוף μl (1x PBS המכיל 0.5 מ&quot;מ MgCl 2 ו 0.05% Triton-X 100). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצור את השיירתאים מצלחת 35 מ&quot;מ ו צנטריפוגות התאים XG ב 1000 במשך 5 דקות. השתמש בתא גלולה לנתח את החלבון הכולל ידי מערבי סופג (שלב 6). </li></ol> 3. דופק BrdU וצ&#39;ייס Assay לנתח רמות חלבון בשלבי Cell Cycle שונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את הווריאציה של רמת חלבון (כאן VDAC3, Sas6 או Cep135) בcentrosomes בשלבים שונים של מחזור התא, תאים לגדול בשתי מנות של 35 מ&quot;מ המכילות coverslips במשך 44 שעות. החלף את מדיום התרבות עם מדיום מלא המכיל 40 מיקרומטר BrdU דגירה התאים במשך 4 שעות בתרבית תאי החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצלחת אחת, להעביר את coverslips לצלחת 24 גם כדי לתקן את התאים באמצעות מתנול הצונן כמתואר בשלב 2.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי דופק BrdU 4 שעות, להסיר את המדיום המכיל BrdU, לשטוף את התאים פעם עם PBS ופעם עם מדיום להשלים, להוסיף בינוני טרי, ולאחר מכן לגדול התאים בהעדר BrdU לזמנים שונים (בדרך כלל עוד 4 שעותלתאי RPE1) לפני תיקון התאים כמתואר בשלב 2.1.2. הערה: לתאי RPE1, רוב תאי BrdU חיובי נמצאים בS מאוחר או G2-שלב אחרי מרדף 4 שעות. זה צריך להיקבע באופן עצמאי לכל סוג תא. </li></ol> 4. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים הקבועים על coverslips ב -200 μl חיץ חסימה (BSA 2% ו -0.1% TritonX-100 ב 1x PBS) למשך 30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם שילוב של נוגדנים ראשוניים (בדרך כלל אחד וגדל ארנב ועוד גדלו בעכבר) בדילול מלא בחסימת O החיץ / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך תא humidified, לשים נייר מגבת רטובה בחצי התחתון של תיבת קצה פיפטה 1,000 μl ריקה. הנח רצועת Parafilm על פני השטח המדף, ולזהות אגל (15-20 μl) של פתרון הנוגדן על Parafilm עבור כל coverslip להיות מודגרות. היפוך coverslip על טיפה של פתרון נוגדן (כך שתאים שקועים) וקרובמכסה קופסא הקצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך coverslips שוב ולהחזיר אותם בחזרה לצלחת 24 גם. לשטוף coverslips ואז דגירה אותם בתערובת 150 נוגדנים משני μl (כאן צבע נגד ארנב מצומדות ירוק-ניאון וצבע אדום-ניאון אנטי עכבר מצומדות דילול בחסימת מאגר) במשך שעה 1 ב RT. שטוף את coverslips שלוש פעמים. הערה: הנוגדנים משני fluorophore מצומדות הם רגישים לאור. להגן על הדגימות מן האור במהלך שלבים 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו לצביעה נגד BrdU על ידי תיקון תאי RPE1 המוכתם שוב עם מתנול המצונן 500 μl ב -20 ° C למשך 10 דקות, כמתואר בשלב 2.1.2. שטוף את coverslips שלוש פעמים. הערה: קיבעון זה מאבטח את תיוג הנוגדן הראשוני והמשני של החלבון (ים) של עניין בתהליך הידרוליזה החומצה בשלב הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב -200 μl של 2 N HCl למשך 30 דקות ב RT. לנטרל עם 300 μl של 1 M טריס-Cl, pH 8ד לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את התאים שוב באמצעות 200 μl חיץ חסימה למשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם נוגדן אנטי BrdU חולדה (בדילול בחסימת מאגר) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא humidified. להחזיר את coverslips חזרה לצלחת 24 גם, לשטוף אותם ולאחר מכן דגירה עם נוגדן כחול-ניאון הצבע מצומדות אנטי-עכברוש המשני (בדילול מלא 150 μl חיץ חסימה בצלחת 24 גם עבור שעה 1 ב RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips שלוש פעמים. ספוט אגל (בערך 3-6 μl) של פתרון הרכבה המכיל antifade מגיב על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית. היפוך coverslip, עם התא בצד פונה כלפי מטה, על פתרון ההרכבה. נגב נוזל עודף בעדינות על ידי לחיצה על coverslip נגד השקופית באמצעות רקמות רכות ניקוי. החל לק שקוף בשולי coverslip כדי לאטום אותו לשקופית מיקרוסקופ. </li></ol> תמונת Immunofluorescence 5. Acquisition וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במטרת 100X תכנית Apo טבילת שמן (עם צמצם מספרי 1.4) לרכישת התמונות של תאי RPE1 BrdU חיובי בטמפרטורת הסביבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות במיקרוסקופ (ראה ציוד) מצורף עם מצלמה מסוגלת הדמיה דיגיטלית. עבור כל fluorophore, לקבוע את זמן החשיפה המתאים (בדרך כלל בין 300-1,000 אלפיות שני) על ידי בחינת אופן ידני את כל דוגמאות של ניסוי. לפני רכישת תמונות של תא, לקבוע באופן ידני העליון המתאימות ומישור מוקד תחתון לאורך ציר Z-(בדרך כלל 0.2 מיקרומטר גודל צעד). לרכוש תמונות של מדגמים שונים שנמצאים על coverslips הנפרד באמצעות זמן חשיפה זהה לfluorophores שונה לאורך ציר Z-שימוש בחבילת תוכנת הדמיה מיקרוסקופית דיגיטלית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע deconvolution (במקרים אלה באמצעות אלגוריתם לא השכן) של כל ערימות התמונה שנרכשו לאורך ציר Z-. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הקרנת העצמה הכוללת של כל ערימת תמונה לאורךZ-הציר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאים שבם centrosomes קרוב (מרחק בין שתי centrosomes הוא פחות מ -2 מיקרומטר), לצייר ריבוע קטן (בדרך כלל 20-30 פיקסלים לכל צד) סביב שני centrosomes וסמן את השטח שנבחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר ריבוע גדול יותר (בדרך כלל 24-35 פיקסלים לכל צד) המקיף את הכיכר הראשונה וסמן את השטח שנבחר לכיכר הגדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את האזור (A) ואת עוצמת הקרינה הכוללת (F) של כל fluorophore בכל תיבה (S מציין קופסא קטנה וL מציין קופסא גדולה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עוצמת הקרינה הרקע המתוקנת של כל fluorophore באמצעות הנוסחא שתוארה על ידי Howell et al 29:. F = F S - [(L F - F S) x S / (L - S)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את עוצמת הקרינה המנורמלת של החלבון של עניין (כאן VDAC3 או Sas6) על ידי חישוב יחס עוצמת הקרינה מתוקן רקע fluorophore לזה של fluorophore משמש להתקן שנבחר על פנימי (כאן γ טובולין, Sas6 או Cep135). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של ניתוח תאים בי centrosomes מופרדים היטב (מרחק בין שתי centrosomes יעלה על 2 מיקרומטר), לנתח כל centrosome בנפרד על ידי ציור שתי קבוצות נפרדות של תיבות. לצייר ריבוע קטן (בדרך כלל 15-25 פיקסלים לכל צד) סביב כל centrosome וסמן את השטח שנבחר. לצייר ריבוע גדול יותר (20-30 פיקסלים לכל צד) המקיף את הכיכר הראשונה וסמן את השטח שנבחר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את האזור (A) ואת עוצמת הקרינה הכוללת (F) של כל fluorophore בכל תיבה, ולחשב את עוצמות הקרינה רקע המתוקנת של כל fluorophore, בנפרד עבור כל centrosome, כמתואר בשלב 5.3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את עוצמות הקרינה רקע המתוקנת של כל חלבון משני centrosomes להשיג את רמת centrosomal הכוללת של חלבון שבתא ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגעוצמה מנורמלת לחלבון של עניין על ידי חישוב יחס עוצמת centrosomal הכוללת שלה לעצמת centrosomal הכוללת של התקן הפנימי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח לפחות 15-25 תאים לכל תנאי ניסוי ואת העלילה הגרף בגיליון אלקטרוני. </li></ol> 6. ניתוח החלבון סה&quot;כ שימוש סופג מערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי assay radioimmunoprecipitation חיץ (ריף) המכיל pH 50 מ&quot;מ טריס-HCl 8, 150 מ&quot;מ NaCl, 1% P-40, 1% deoxycholate נתרן, 0.1% סולפט dodecyl נתרן Nonidet (SDS) ודגירה של 10 דקות על קרח לlyse התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 10,000 XG במשך 10 דקות, להפריד את lysate מחלק גלולה ולמדוד את ריכוז החלבון הכולל של כל lysate באמצעות ערכת assay חומצת bicinchoninic (BCA). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 40 מיקרוגרם של lysate עם חיץ 4x SDS-PAGE טעינה (50 מ&quot;מ טריס-Cl, pH 6.8, 2% SDS, גליצרול 10%, 100 מ&quot;מ dithiothreitol, ברום 0.1%ophenol כחול). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים את הדגימות למשך 10 דקות ולהפעיל את הדגימות על 12.5% ​​denaturing SDS-PAGE במתח קבוע של 200 V. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את החלבונים מופרדים על SDS-PAGE על קרום nitrocellulose באמצעות טכניקה מערבית סופג (במתח קבוע של 90 V עבור שעה 1 בקור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם חלב 3% דל שומן ב1x PBS, ולאחר מכן דגירה הקרום עם פתרונות של נוגדנים עיקריים בדילול מלא (במקרה ארנב נגד VDAC3, אנטי-α-טובולין ארנב נגד γ טובולין ועכבר זה) ל1 שעות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שטיפת הקרום שלוש פעמים (כל אחד דגירה 5 דקות תחת רועד) באמצעות חיץ PBS-T (1x PBS ו -0.2% Tween-20), דגירה הקרום בתערובת של קרוב אינפרא אדום-צבע פלואורסצנטי (IR) נגד ארנב מצומדות ו נוגדני צבע פלואורסצנטי IR מצומדות אנטי עכבר משניים (בדילול מלא PBS-T) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים ולאחר מכן לסרוק את הקרום לנתח את הלהקות באמצעות f אינפרא אדוםמערכת ההדמיה luorescence מתאימה לזיהוי immunoblot. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulating+the+transition+from+centriole+to+basal+body%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulating the transition from centriole to basal body.</a> J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).</li>
<li>Azimzadeh, J., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Building the centriole.</a> Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).</li>
<li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).</li>
<li>Strnad, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+HsSAS-6+levels+ensure+formation+of+a+single+procentriole+per+centriole+during+the+centrosome+duplication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle.</a> Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).</li>
<li>Hilbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+centriolar+protein+SAS-6+forms+a+spiral+that+is+consistent+with+imparting+a+ninefold+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).</li>
<li>Pike, A. N., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centriole+assembly+and+the+role+of+Mps1%3A+defensible+or+dispensable%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable.</a> Cell Div. 6, 9(2011).</li>
<li>Haren, L., Stearns, T., Luders, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk1-dependent+recruitment+of+gamma-tubulin+complexes+to+mitotic+centrosomes+involves+multiple+PCM+components%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components.</a> PLoS One. 4, e5976(2009).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+the+human+centrosome+by+protein+correlation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling.</a> Nature. 426, 570-574 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R. 3rd, Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).</li>
<li>Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP+proteins%3A+the+knights+of+centrosome+dynasty%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">CEP proteins: the knights of centrosome dynasty.</a> Protoplasma. 250, 965-983 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+functional+interaction+between+mortalin+and+Mps1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase.</a> Genes Cells. 12, 797-810 (2007).</li>
<li>Jakobsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+asymmetrically+localizing+components+of+human+centrosomes+identified+by+complementary+proteomics+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods.</a> Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).</li>
<li>Sang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+NPHP-JBTS-MKS+protein+network+reveals+ciliopathy+disease+genes+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways.</a> Cell. 145, 513-528 (2011).</li>
<li>Dowdle, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+ciliary+B9+protein+complex+causes+Meckel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome.</a> Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).</li>
<li>Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+regulates+centriole+assembly+by+targeting+Mps1+to+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes.</a> Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).</li>
<li>Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plk4+trans-autophosphorylation+regulates+centriole+number+by+controlling+betaTrCP-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation.</a> J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).</li>
<li>Holland, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autoregulated+instability+of+Polo-like+kinase+4+limits+centrosome+duplication+to+once+per+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle.</a> Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).</li>
<li>Kasbek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+the+degradation+of+mps1+at+centrosomes+is+sufficient+to+cause+centrosome+reduplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).</li>
<li>Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antizyme+restrains+centrosome+amplification+by+regulating+the+accumulation+of+Mps1+at+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).</li>
<li>Puklowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCF-FBXW5+E3-ubiquitin+ligase+is+regulated+by+PLK4+and+targets+HsSAS-6+to+control+centrosome+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication.</a> Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).</li>
<li>Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cep97+and+CP110+suppress+a+cilia+assembly+program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program.</a> Cell. 130, 678-690 (2007).</li>
<li>Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrin-2+is+required+for+centriole+duplication+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells.</a> Curr. Biol. 12, 1287(2002).</li>
<li>Lukasiewicz, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+centrin+stability+by+Aurora+A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Control of centrin stability by Aurora A.</a> PLoS One. 6, e21291(2011).</li>
<li>Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+is+recruited+to+the+centrosome+in+response+to+inhibition+of+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes.</a> J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).</li>
<li>Korzeniewski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cullin+1+functions+as+a+centrosomal+suppressor+of+centriole+multiplication+by+regulating+polo-like+kinase+4+protein+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels.</a> Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).</li>
<li>Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signal+transduction+by+Smoothened%3A+pharmacologic+evidence+for+a+2-step+activation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).</li>
<li>Majumder, S., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC3+and+Mps1+negatively+regulate+ciliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis.</a> Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).</li>
<li>Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Mad2+dynamics+at+kinetochores%2C+along+spindle+fibers%2C+and+at+spindle+poles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells.</a> J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).</li>
<li>Meraldi, P., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+cohesion+is+regulated+by+a+balance+of+kinase+and+phosphatase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities.</a> J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).</li>
<li>Lee, K., Rhee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLK1+phosphorylation+of+pericentrin+initiates+centrosome+maturation+at+the+onset+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis.</a> J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).</li>
<li>Lin, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microcephaly+protein+CEP135+binds+to+hSAS-6+and+CPAP%2C+and+is+required+for+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly.</a> Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).</li>
<li>Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+cytoskeletal+organization+by+digital+fluorescent+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy.</a> Cytometry A. 54, 8-18 (2003).</li>
<li>Keller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+centriole+proteome%3A+the+conserved+WD40+domain+protein+POC1+is+required+for+centriole+duplication+and+length+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).</li>
<li>Venoux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poc1A+and+Poc1B+act+together+in+human+cells+to+ensure+centriole+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity.</a> J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).</li>
<li>Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSas-6+and+Ana2+coassemble+into+tubules+to+promote+centriole+duplication+and+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement.</a> Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).</li>
<li>Machiels, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+cell+cycle+kinetics+upon+proteasome+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition.</a> Cytometry. 28, 243-252 (1997).</li>
<li>Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mps1+phosphorylation+sites+regulate+the+function+of+centrin+2+in+centriole+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly.</a> Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).</li>
<li>Tsou, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo+kinase+and+separase+regulate+the+mitotic+licensing+of+centriole+duplication+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells.</a> Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מיקרוסקופיה כמותי בביולוגיה של תא היא נפוצה הקשורים מבחני Live- תא הדמיה כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג), שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), וכו &#39;עם זאת, יש דוגמאות הולך וגדל של ביולוגים של תא פיתוח מבחני כמותיים מיקרוסקופיה שונות לקבועים תאים בשנים האחרונות 27,34-36. חשוב לציין, התקדמות בהבנת הביולוגיה centrosome לעתים קרובות דורשת הבנה של פונקצית centrosome הספציפית של חלבונים שcentrosomal בריכות עשויים להיות מוסדרת באופן שונה מברכות אחרות. לפ...

Centrosomes מורכב של זוג centrioles מוקף חומר pericentriolar (PCM). להיות המרכזים המארגנים microtubule הגדולות (MTOCs) בתאי יונקים, centrosomes לשמש כשני הקטבים של צירים mitotic בתאים מתחלקים, ובכך לסייע לשמור על שלמות הגנומי 1. בתאים שקטים (לדוגמא, בשלב G0), אחד משני centrioles של centrosome, כלומר צנטריול אמא, הופך לגוף בסיסי להרכיב cilium העיקרי, אברון חושי הבולט החוצה מתא השטח 2. ברגע שהתאים להזין מחדש את מחזור התא, cilia העיקרי מפורק וכל צנטריול מכוון את ההרכבה של procentriole בקצה הפרוקסימלי שלה שמתארך בהדרגה ליצירת צנטריול בוגר 3. בתחילת S-שלב, מבנה דמוי גלגלון-המספק הסימטריה 9 פי לצנטריול נוצר על פני השטח של כל צנטריול הקיים ויהפוך את הבסיס של כל procentriole. t Sas6כובע הוא הכרחי להרכבת צנטריול מגויסת כדי ליצור את הרכזת של גלגלון 4-6. לאחר מכן חלבוני centriolar אחרים הם התאספו על גלגלון בפיקוח הדוק, הפרוקסימלי לאופן דיסטלי 7. לאחר שסיים בדיוק כפילות צנטריול, תאים להרכיב חומרי pericentriolar נוספים לבניית שתי centrosomes פונקציונלי בסוף שלב G2 8. בנוסף לרכיבי ליבת centriolar 9-11, כמה חלבונים אחרים, כולל קינאז, phosphatases, מלווים, רכיבי פיגום, חלבונים הקשורים קרום ומכונות השפלה משויך centrioles, גופים בסיסיים וPCM בזמנים שונים של מחזור התא 12-16. הוא ציין כי לעתים קרובות רמות centrosomal של חלבונים רבים מוסדרות באופן זמני על ידי מנגנוני מיקוד centrosomal ו / או השפלה proteasomal בcentrosomes. חשוב לציין, התנודות ברמת centrosomal של כמה חלבונים כגון Plk4, Mps1, Sas6, וCP110נקודות שונות t של מחזור התא נראית חיוני להסדיר הרכבה צנטריול 5,17-22, ובמקרה של Mps1 מניעת השפלה centrosomal זה מוביל להיווצרות של centrioles העודף 19. מצד השני, השברים centrosomal של כמה חלבונים הם פחות יציבים בהשוואה לבריכות cytosolic. לדוגמא siRNA בתיווך למטה ויסות של Centrin 2 (Cetn2) הוביל לירידה מתונה בלבד של רמת החלבון בcentrioles למרות ירידה גדולה ברמות התא כולו 23. לכן זה חיוני כדי למדוד את השינויים ברמה של חלבוני centrosomal בcentrosome ולא מדידת רמות חלבון תא כל עת הערכת פונקציות centrosome הספציפית שלהם. במחקר זה פיתחנו assay באמצעות immunofluorescence העקיף (IIF) לכמת את הרמה היחסית של חלבון בcentrosomes. assay זו פותח במיוחד לאבחון תאים שנמצאים ממדגמים שוניםולכן לא יכול להיות צילם באותו הזמן. דגימות אלה יכולים להיות תאים שטופלו בחומרים כימיים שונים (כלומר, תרופה לעומת קבוצת ביקורת), שנאספו בנקודות זמן שונות (כלומר, דופק לעומת מרדף), או נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא. העיקרון של assay זה טמון במדידת עוצמת ניאון הרקע תיקן מתאים לחלבון באזור קטן ולנרמל את הערך שנגד אותם לחלבון אחר שרמות לא להשתנות תחת תנאי ניסוי נבחרו. מספר מחקרים בביולוגיה centrosome לאחרונה נצלו טכניקות שונות כמותי מיקרוסקופיה, בשני תאי החיים או קבועים, כדי לקבוע את פונקצית centrosome הספציפית של חלבוני מועמד 24-27. בדומה למבחנים אלה, הטכניקה הנוכחית גם מודדת את עוצמת הקרינה הרקע המתוקנת של חלבון המבחן. עם זאת, ההכללה של הנורמליזציה באמצעות תקן פנימי בassay זה היית צפוי להציע יותרדיוק וביטחון בניתוח שני מדגמים שונים שנמצאים בשני coverslips שונה. יתר על כן, בנוסף לבחינה של רמת החלבון בcentrosomes, עם התאמות קלות בשיטה זו יכולה להיות מיושמת על קבוצה מגוונת של תנאי ניסוי או באתרים סלולריים אחרים. כאן, אנו משלבים assay מיקרוסקופיה הכמותי שלנו עם אסטרטגית דופק מרדף BrdU להשוות תאים משלבי מחזור התא שונים. במקום להשתמש בטכניקות עצירת מחזור התא סטנדרטית ושחרור ללמוד נקודות שונות בזמן מחזור התא, תאים גדלו באופן אסינכרוני מודגרת עם BrdU לתייג תאים בS-שלב, והתאים שכותרתו נרדפים לזמנים שונים (בדרך כלל 4-6 שעות). רוב התאים שכותרתו יהיה בשלב S-מייד לאחר הדופק. אורכו של המרדף נבחר כך שלאחר המרדף, תאים שכותרתו יהיו בS, G2, או מיטוזה מאוחר, אשר יכול להיות מאומת על ידי מאפיינים מורפולוגיים עמדת As- כזה של centrosomes ביחס לnucליי, מרחק בין centrosomes, עיבוי של כרומוזומים וכו &#39;לכן, לאורכו של המרדף תלוי במח&quot;מ של S, G2 ושלב M של סוג תא מסוים. מאז גישה זו נמנעת מעכבי מחזור התא כגון hydroxyurea, aphidicolin, nocodazole, וכו &#39;, זה מאפשר יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ניתוח מחזור התא. לפיכך, אנו מראים כאן שassay מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותית בלבד, או בשילוב עם assay דופק המרדף BrdU, הוא טכניקה פשוטה אך רבת עוצמה כדי למדוד במדויק את השינויים יחסי ברמת centrosomal של חלבון מועמד במהלך מחזור תא מוטרד. מדדנו את רמת centrosomal של VDAC3, חלבון שזיהינו לאחרונה בcentrosomes בנוסף למיטוכונדריה 16,28, באמצעות מבחני אלה. תוצאות שהתקבלו כאן לאמת התצפית הקודמת שלנו שברכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת על ידי השפלה, וגם משתנה בdependen מחזור התאאופן t 16, יתר על כן אימות תחולתה של שיטה זו.

<table><tbody><tr><td>פיברונקטין</td><td>סיגמא</td><td>F8141</td><td>מלאי של 1 מ"ג/מ"ל במים</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma SCP0005</td><td></td><td>מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>מלאי של 10 מ"מ ב-DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-tubulin (עכבר חד-שבטי, שיבוט GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 במאגר חסימת IIF&nbsp;</td></tr><tr><td>אנטי-VDAC3 (רב-שבטי של ארנב)&nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 במאגר חסימת IIF, 1:1,000 במאגר חסימת WB</td></tr><tr><td>Anti-SAS6 (חד שבטי של עכבר)&nbsp;</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-81431</td><td>1:100 במאגר חסימת IIF</td></tr><tr><td>אנטי-Cep135 (רב-שבטי ארנב)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 במאגר חסימת IIF</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (חד שבטי חולדה)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 במאגר חסימת IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 עז נגד עכברוש IgG (H+L)</td> <td>טכנולוגיות חיים</td><td>A21093</td><td>1:200 במאגר חסימת IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד עכבר IgG (H+L) טכנולוגיות חיים נוגדנים</td><td></td><td>A21202</td><td>1:1,000 במאגר חסימת IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 חמור נגד עכבר IgG (H+L) טכנולוגיות חיים נוגדן</td><td></td><td>A21203</td><td>1:1,000 ב-IIF מאגר חוסם</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנב IgG (H+L) טכנולוגיות נוגדן</td><td>חיים</td><td>A21206</td><td>1:1,000 במאגר חסימת IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 חמור נגד ארנב IgG (H+L) טכנולוגיות חיים נוגדנים</td><td></td><td>A21207</td><td>1:1,000 במאגר חסימת IIF</td></tr><tr><td>אנטי-&#947;-טובולין (רב-שבטי ארנב)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 במאגר</td></tr> <tr><td>חסימת WBאנטי-&#945;-טובולין (מונוקלונלי של עכבר, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20,000 במאגר חסימת WB</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 חמור נגד ארנב IgG (H+L)</td> <td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10,000 במאגר חסימת WB</td></tr><tr><td>עכבר IgG (H& L) נוגדן IRDye800CW נוגדנים מצומדים</td><td>Rockland</td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 במאגר חוסם WB</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Reagent&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>הרכבה מדיה</td></tr><tr><td>כיסויים עגולים 12CIR.-1</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס IX-81 מיקרוסקופ</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394 מצלמת IR</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X תוכנית Apo טבילת שמן מטרת</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>1.4 צמצם מספרי</td></tr><tr><td>חבילת תוכנת Slidebook</td><td>חידושי הדמיה אינטליגנטית</td><td></td><td></td></tr> מערכת <tr><td>הדמיה Odyssey IR מערכת הדמיה</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה בינצ'ונינית (BCA) מבחן</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 קוביית</td> <td>UV צרהמסנן אולימפוס</td><td>U-M622</td><td></td></tr><tr><td>קובייה כחולה צרה</td><td>מסנן</td><td>אולימפוס</td><td>U-M643</td></tr><tr><td>מסנן MNU2 קובייה ירוקה צרה</td><td>מסנן אולימפוס</td><td>U-M663</td><td></td></tr></tbody></table>

כמותי immunofluorescence assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בcentrosomes

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes הם אברונים קטנים אך חשובים, המשמשים כקטבים של ציר mitotic כדי לשמור על שלמות הגנומי או להרכיב cilia העיקרי כדי להקל על פונקציות חושיות בתאים. רמת חלבון עשויה להיות מוסדרת באופן שונה בcentrosomes מאשר במקומות אחרים .cellular, והשינוי ברמת centrosomal של כמה חלבונים בנקודות שונות של מחזור התא נראה חיוני לוויסות הנכונה של ההרכבה צנטריול. פיתחנו assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותיים המודד שינויים יחסי ברמת חלבון בcentrosomes בתאים קבועים ממדגמים שונים, כגון בשלבים שונים של מחזור התא או לאחר טיפול בחומרים כימיים שונים. העיקרון של assay זה טמון במדידת עוצמת ניאון הרקע תיקן המתאימה לחלבון באזור קטן, ולנרמל את המדידה שנגד אותם לחלבון אחר שאינו משתנה על פי ג הניסיוני נבחרondition. ניצול assay זה בשילוב עם דופק BrdU ואסטרטגיה מרדף ללמוד מחזורי תא מוטרדים, יש לנו כמותית תוקף התצפית האחרונה שלנו כי בריכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת בcentrosomes במהלך מחזור התא, סביר להניח בשפלה בתיווך פרוטאזום במיוחד בcentrosomes.

המחקרים האחרונים שלנו זיהו לוקליזציה רומן centrosomal ותפקוד של VDAC3, אחד מporins המיטוכונדריה 16,28. Immunostaining של מספר תאי יונקים כוללים תאי RPE1 באמצעות נוגדן VDAC3 ספציפי הראה צביעת centrosomal בולטת והכתמה של המיטוכונדריה חלשה יחסית. אנחנו גם הראו כי VDAC3 centrosomal קשור באופן מועדף עם צנטריול אמא, ובריכת centrosomal של שני אנדוגני וectopically הביע VDAC3 מוסדרת על ידי השפלה 16. על מנת לאמת את assay IIF הכמותי בחנו את השינויים בבריכת VDAC3 הקשורים...

כאן, פותחה בדיקת פלואורסצנציה כמותית חדשה כדי למדוד שינויים ברמת חלבון במיוחד בצנטרוזומים על ידי נורמליזציה של עוצמת הקרינה של החלבון לזו של תקן פנימי מתאים.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת את השינויים היחסיים ברמת החלבון בצנטרוזומים בתנאים שונים. לדוגמה, בנקודה מסוימת במחזור התא לאחר עיכוב הפרוטאזום, זה מושג על ידי טיפול ראשון בתאים הגדלים על החלקות כיסוי עם מעכב הפרוטאזום MG one 15 או עם ממס הבקרה DMSO. ואז מיד להוסיף BRDU לשני התאים ולדגור אותם במשך ארבע שעות באינקובטור תרבית תאים.השלב השני הוא העברת החלקות הכיסוי לצלחת 24 בארות כדי לתקן את התאים. לאחר מכן, התאים מוכתמים בנוגדנים נגד BRDU והחלבונים המעניינים, ולאחר מכן בנוגדנים משניים מתאימים. השלב האחרון הוא רכישת תמונות של תאים חיוביים BRDU באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותוכנת הדמיה דיגיטלית כדי להחיל זמן חשיפה זהה ואורך ציר Z על תאים מכל דגימה.לאחר מכן ניתוח התמונות כדי לכמת את הרמה היחסית של VDA C3 רומלי. בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כמותית כדי להראות כי המאגר הסנטרו סומלי של VDA C3 גדל פי שניים כאשר הפרוטאזום מעוכב במהלך שלב S. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו ציטומטריית זרימה, ספיגה חיסונית או מיקרוסקופ כמותי, הוא שטכניקה זו מנתחת את הרמה הרומלית היחסית של החלבון בשתי דגימות שטופלו באופן שונה המעובדות על שתי החלקות כיסוי שונות. שיטה זו משתמשת בנורמליזציה לתקן פנימי כדי לשלוט בצורך לעבד את שתי אוכלוסיות התאים הניסיוניות.בנפרד, אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות של חלבונים ספציפיים בצנטרוזומים. ניתן ליישם אותו גם במצבים אחרים כגון מבנים תת-תאיים אחרים או בחינת מאגרים ספציפיים של חלבונים הנמצאים במספר אתרים בתוך התא. מדגים את ההליך יהיה schu majumder, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי כדי להתחיל את הניסוי לעבור פעמיים כפול 10 לחמישי גידול אסינכרוני של תאי RPE אחד לתוך צלחות 35 מילימטר שהוכנו בעבר עם שפתי כיסוי ולגדל את התאים בשני מיליליטר של מדיום שלם.החלף את מדיום התרבות כל 24 שעות במדיום טרום חם טרי לאחר 44 שעות. החלף את מדיום התרבית במדיום שלם המכיל 0.05% DMSO או MG אחד 15 בריכוז סופי של חמש מיקרומולר, ובמקביל הוסף BRDU לתאים בריכוז סופי של 40 מיקרומולר לדגור על התאים למשך ארבע שעות. לאחר מכן, העבירו כל תלוש כיסוי לצלחת 24 בארות.הוסף 500 מיקרוליטר של מתנול מעובד מראש לכל באר ודגר את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לתקן את התאים. לאחר 10 דקות, יש לשטוף מיד את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה. דגרו את התאים הקבועים על הכיסוי, החליקו פנימה 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם למשך 30 דקות בזמן שהתאים דוגרים.הכן תא לח על ידי הנחת מגבת נייר רטובה במחצית התחתונה של קופסת קצה פיפטה ריקה בנפח 1000 מיקרוליטר. הניחו רצועת בושם על משטח המתלה והוסיפו טיפה של 20 מיקרוליטר של הארנב נגד V DDA 3 ונוגדני גמא טובולין נגד גמא מדולל במאגר חוסם על הפרפורם. לאחר החסימה, הפוך את החלקת הכיסוי על כל טיפה של תמיסת נוגדנים.ודא שהתאים שקועים וסגור את המכסה של קופסת הקצה. דגרו על התאים עם נוגדנים ראשוניים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בתא הלח. הפוך שוב את פתקי הכיסוי והחזר אותם ל-24.ובכן לשטוף כלים את הכיסוי מחליק, ואז לדגור אותם בתמיסה של 150 מיקרוליטר של נוגדנים משניים, מדולל במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, שטפו את הכיסוי מחליק שלוש פעמים עם מאגר כביסה. תקן את תא ה-RPE המוכתם ב-500 מיקרוליטר מתנול מקורר במינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר שהתאים התקבעו למשך 10 דקות, שטפו אותם שלוש פעמים במאגר כביסה.לאחר מכן, דגרו על התאים ב-200 מיקרוליטר של שני HCL רגילים למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר יש לנטרל את התאים עם 300 מיקרוליטר של טריס CL pH מולארי אחד שמונה, ולשטוף את התאים שלוש פעמים. עם מאגר כביסה חוסמים את התאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר החסימה, דגרו על התאים עם נוגדן נגד BRDU של חולדות וחוצץ חוסם למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא הלח. החזר את החלקות הכיסוי בחזרה ל-24. ובכן לשטוף ולשטוף את התאים.לאחר מכן, דגרו אותם עם נוגדן משני מדולל ב-150 מיקרוליטר של חיץ חוסם. בכלי 24 באר למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את החלקות הכיסוי שלוש פעמים עם נקודת XPBS אחת, טיפה של שישה מיקרוליטר של תמיסת הרכבה המכילה מגיב אנטיפה על מיקרוסקופ זכוכית.החלק הפוך את החלקת הכיסוי כשצד התא פונה כלפי מטה אל תמיסת ההרכבה. בעזרת רקמת ניקוי רכה, לחץ בעדינות על החלקת הכיסוי על השקופית כדי להסיר עודפי נוזלים אטום את החלקה על המיקרוסקופ. יש להחליק על ידי מריחת לק לאורך קצה החלקת הכיסוי.השתמש במטרת טבילה בשמן APO של 100 x עם צמצם מספרי של 1.4 כדי לרכוש את התמונות של תאי RPE חיוביים של BRDU בטמפרטורת החדר. קבעו את מישור המוקד העליון והתחתון המתאים לאורך ציר Z עם גודל הצעד של 0.2 מיקרון, והשיגו תמונות לאורך ציר Z. לאחר מכן, בצע דה-קונבולוציה של כל ערימות התמונות שנרכשו לאורך ציר Z.השג את הקרנת העוצמה הכוללת של כל תמונה. ערמו לאורך ציר Z עבור תאים שהצנטרוזומים שלהם מופרדים בפחות משני מיקרון. צייר ריבוע קטן של 20 עד 30 פיקסלים לכל צד סביב שני הצנטרוזומים וסמן את האזור שנבחר.ציירו ריבוע גדול יותר של 24 עד 35 פיקסלים לכל צד סביב הריבוע הראשון וסמנו את האזור שנבחר בריבוע הגדול. לאחר מכן השג את השטח ואת עוצמת הקרינה הכוללת של כל פלואורו ארבע. בכל קופסה, חשב את עוצמת הקרינה המתוקנת ברקע של כל פלואורו. ארבע.לבסוף, השג את עוצמת הקרינה המנורמלת של VDA C3 על ידי חישוב היחס בין עוצמת הקרינה המתוקנת ברקע של הפלואורו שלו. ארבעה מזה של הפלואורו, ארבעה ששימשו לתמונות הסטנדרטיות הפנימיות שנבחרו נלכדו משדות אקראיים של RPE הגדל באופן אסינכרוני, תא אחד מודגר עם BRDU ומעכב הפרוטאזום MG אחד 15 או ממס הבקרה DMSO ומציג DNA ו-BRDU. הרקע תיקן את עוצמת הקרינה המתאימה לסנטרו סומל.VD 3 היה גבוה בערך פי 2.5 בתאי MG 15 שטופלו ואז בתאי ביקורת כפי שמודגם על ידי דיאגרמת הקופסה והשפם הזו. כאשר הנתונים נורמלו עבור סך כל הפלואורסצנטיות של VD שלוש לעומת זה של גמא טובולין, הקפל גדל, ירד מעט עד פי שניים בערך. צביעת VD C3 בציטים שאינם רומליים או ברמה התאית הכוללת של VD 3 לא הושפעו מעיכוב פרוטאזום.לפיכך, המאגר הרומלי של VDA C3 מווסת על ידי השפלה מתווכת פרוטאזום. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי יש להעלות את הנוגדנים כנגד חלבון הבדיקה והתקן הפנימי במינים פונדקאים שונים וכי יש לרכוש את התמונות של שתי הדגימות באמצעות פרמטרי הדמיה זהים, כגון מספר הניתוחים הקיסריים וזמני החשיפה על מנת למזער את השפעת ההדמיה הדיגיטלית.

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים שיטה לניטור חלבון תא נגוע 0, ICP0 סחר בזיהום הרפס סימפלקס-1. לאחר סינתזת נובו, ICP0 עובר טרנסלוקציה לגרעין, ומאוחר יותר עובר לציטופלסמה במהלך התקדמות הזיהום. מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי חושף ומנתח את הלוקליזציה התת-תאית של החלבון, ומציע תובנות לגבי הסחר שלו לאורך שלבי זיהום.

טכניקת אימונופלואורסנציה ללוקליזציה של חלבונים נגיפיים בתאים נגועים

מוצגים הוא עבודה אינפורמטיקה גמישה המאפשרת ניתוח מבוסס תמונת ריבוב של תאים שכותרתו fluorescently. העבודה מכמתת סמנים גרעיניים וcytoplasmic ומחשבה טרנסלוקציה סמן בין תאים אלה. נהלים מסופקים ההפרעות של תאים באמצעות siRNA ומתודולוגיה אמינה לגילוי סמן על ידי immunofluorescence העקיף בפורמטי 96-היטב.

זרימת עבודה עבור גבוהה תוכן, כימות תא יחידה של פלורסנט סמנים מUniversal מיקרוסקופים נתונים, הנתמכים על ידי תוכנות קוד פתוחות

כאן אנו מדווחים על פרוטוקולים לאיתור חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים ואקסוגניים בתאים אנושיים ולכמת את רמות החלבון הללו בצנטרומר-קינטוכור על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עקיפה באמצעות קיבוע (קיבוע פרפורמלדהיד, אצטון או מתנול).

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

פיתחנו אסטרטגיה טיהור וגירוש של תמונה מספר רב של centrioles ב לשכנוע סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה של יחיד-חלקיקים ממוצע של נטיות שונות.

בידוד והדמיה פלורסצנטיות עבור שחזור יחיד-חלקיקים של Chlamydomonas Centrioles

פרוטוקול זה מתאר פלורסצנטיות תנודות מבוסס-ספקטרוסקופיה בגישה לחקור אינטראקציות בין חלבונים מתווכים תא-תא אינטראקציות, כלומר חלבונים מותאם צמתי תא, ישירות בתאים חיים. אנו מספקים הנחיות מפורט על מכשיר כיול, חדרי קירור והקפאה, ניתוח, כולל תיקונים למקורות אפשריים החפץ.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.

Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

כאן, אנו מתארים גישה כמותית לקביעת ההתפלגות של חלבון סינפטית יחסית חלבון סמן באמצעות צביעת immunofluorescence ', ' מיקרוסקופיה קונפוקלית, וניתוח מבוססת מחשב.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

אנו מתארים פרוטוקול ניצול הקרינה היברידיזציה באתרו (דג) כדי להמחיש RNAs מרובים של הרפס בתוך תאים אנושיים נגועים ליקיה, או בהשעיה או חסיד. פרוטוקול זה כולל כימות של זריחה המייצרת יחס נוקלאוציטוסמטי וניתן להארכה להדמיה סימולטני של חלבונים מארחים ונגיליים עם immunofluorescence (IF).

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

שיטה זו מתארת פרוטוקול אימונופלואורסנציה וצינור כימות להערכת התפלגות חלבונים עם דפוסי ארגון גרעיני מגוונים בלימפוציטים מסוג T אנושיים. פרוטוקול זה מספק הדרכה שלב אחר שלב, החל מהכנת הדגימה והמשך בביצוע ניתוח חצי אוטומטי בפיג'י, וכלה בטיפול בנתונים על ידי מחברת Google Colab.

צינור רב-תכליתי לניתוח שינויים דינמיים בגופים גרעיניים במגוון סוגי תאים

למד שיטת immunofluorescence כמותית למדידת רמות חלבון בcentrosomes בתאים קבועים באמצעות נורמליזציה לסטנדרט פנימי. השיטה מאפשרת השוואה מדויקת בין מדגמים שעברו עיבוד נפרד.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

גלה סרטונים נוספים