Name: מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: חקור את השפעות התרופה האפיגנטית DZNep על יתושי מלריה בשלבי חיים שונים. השיטה כוללת חשיפה מימית לזחלים והזנה דמית לנקבות בוגרות, עם מדידת השרדות, פוריות ועיכוב אנזימטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לויקטור מרקז על אספקת DZNep.HCl ולסקוטי בולינג על ייצור מזיני הדם. הזנים Mopti ו-SUA2La של An. gambiae התקבלו ממרכז המשאבים למחקר והתייחסות למלריה (MR4). עבודה זו נתמכה על ידי מכון פרלין למדעי החיים ומענק מהמכונים הלאומיים לבריאות 1R21AI094289 לאיגור ו. שרחוב.

הערה: שלושה חלקים של הפרוטוקול מתארים את החשיפה המימית של תרופת DZNep ליתושי זחל, חשיפה מבוססת דם של DZNep לנשים בוגרות ללמוד את השפעתו של פוריות, ועיכוב hydrolase SAH ידי DZNep נמדד באמצעות טכניקת colorimetric פשוטה. ייצוג סכמטי של מבחני אלה מוצג באיור 1. 1. מבחני כילה נגד פיתוח והישרדות ילדותיים הערה: סעיף זה מסביר את השימוש בתרופה מסיס במים המשפיעה על התפתחות זחלי יתושים והישרדות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האץ ביצי gambiae על 28 מעלות צלזיוס במים מזוקקים (DH O 2) וזחלי instar להם 2 nd אחוריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח DNAse שש היטב, צלחת תרבית תאים חופשית RNAse ולשפוך 10 מיליליטר DH 2 O היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר זחלי יתושים ב2 nd instar ולהוסיף 15 זחלים בכל טוב. לפני הוספת זחלי instar 2 nd לצלחת, עמ &#39;ut אותם על מגבת נייר במשך 2-3 שניות כדי להסיר עודפי מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות תווית עם קלטות בצבעים באקראי ניסוי. לייבל 2 בארות לריכוז מבחן על כל צלחת (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן hydrochloride 1 מ&quot;מ DZNep פתרון מניות (MW = 298.73) על ידי המסת DZNep 0.3 מ&quot;ג ב 1 מיליליטר של DH 2 O. הוספת פתרון מניות של DZNep.HCl לבארות שכותרתו כדי להשיג ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר ו5.0 מיקרומטר. הערה: פתרון המניות יכול להיות מאוחסן על 4 ° C לטווח קצר (יום 1 לחודש) או -20 מעלות צלזיוס למשך זמן ארוך (יותר מאחד בחודש). הערה: תוספת של פתרון המניות לריכוזים האמורים לא תשנה את נפח מים בבארות באופן משמעותי. אולם במקרה של ריכוזים גבוהים בהרבה, רצוי לפזר את המתחם במדיום הזחל כדי למנוע דילול מיותר של המתחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמות שווה של מזון דגי פתית היטב כל אחד. מכסה את הצלחתשל דגירה אותם ב 28 ° C באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התמותה ליתושי זחל שטופל DZNep ואינו מטופלים לאחר תקופת חשיפה של 24 שעות. להסיר ולסלק כל זחלים מתים. חזור על הקלטה זה כל יום עד שכל קוביית הזחלים או pupate ולהתגלות כמבוגרים. רשום את הגודל של זחלים בכל יום שני, כלומר, יום 0, 2, 4, 6, 8, עד שהם pupate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את נתוני פיתוח ותמותת זחל באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית הולמת. הערה: גרף עמודות ניתן להשתמש כדי לייצג את נתוני התמותה ב- Microsoft Excel. ניתוח רב משתני שונה (MANOVA) הופיע עם תוכנה כגון JMP או SPSS יגלה אם מינונים שונים של התרופה לגרום להישרדותם של זחלי יתושים שונים באופן משמעותי. </li></ol> 2. פוריות Assay על ידי מתן תרופות באמצעות מזין מלאכותי ליתושי נקבה הערה: סעיף זה מפרט את התוספת של התרופה לדםnd להאכיל אותו ליתושי נקבה בוגרים באמצעות מערכת מזין מלאכותית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את כלובי יתושים בוגרים עם מספר שווה של יתושים ממין זכר ונקבה לשליטה וכלוב מבחן. לספק 10% תמיסת סוכר ספוגים בכדורי צמר גפן לשני כלובים עד הנקבות מוכנים להאכלה (3-5 ימים הוא אופטימליים עבור אנופלס gambiae). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 שעות לפני האכלת הדם, להסיר את כדורי צמר גפן כדי להבטיח נקבות רעבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שני מתקני האכלת דם מלאכותיים שמורכבים ממשפך הפוך רחב תחתית כוס (קוטר = 50 מ&quot;מ, אורך = 70 מ&quot;מ) ופלסטיק המקיף אטום עם דבק תעשייתי. צרף צינורות פלסטיק (קוטר = 7 מ&quot;מ) לשני שקעים &#39;מתקני ההאכלה (קוטר = 10 מ&quot;מ) באמצעות מחברים ליבוא ויצוא של מים. תווית שני מתקני ההאכלה כמו &quot;שליטה&quot; ו- &quot;5 מיקרומטר DZNep.&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגוף חימום זמין מסחרי, הגדיר את התכנית להאכלה. ב&quot; תפריט &quot;ללכת&quot; הגדרות &quot;ובחר &quot;Setpoints&quot;; תוכניות שנטענו מראש יופיעו. בחר באפשרות &quot;SP1&quot; ולהגדיר את הטמפרטורה ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: גוף החימום מבטיח כי הדם מנוהל נשמר בטמפרטורה קבועה. הגדרות תכנית נוספות עשויות לשמש למיני יתושים או חרקים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא דלי במים ולטבול את גוף החימום למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכי חתיכה מרובעת של Parafilm (50 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) ולמתוח אותו לעשות סרט קרומי דק. מכסה את חלקו התחתון של מתקני ההאכלה המלאכותיים עם Parafilm. לחתוך חתיכת Parafilm (50 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ) אחרת, למתוח וסוגר את הקצוות של מתקני ההאכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את המערכת, חיבור מתקני ההאכלה וגוף חימום על ידי הצינורות. ברגע שסיים, לעבור על המערכת ובחר באפשרות &quot;SP1&quot;. לחץ על &quot;Enter&quot; כדי להפעיל את מערכת. הערה: המים יקבלו מחוממים ל 37 ° C ונשמר בטמפרטורה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג הטמפרטורת דואר של מים באמצעות מדחום בדלי המים. הערה: המחברים והצינורות לעזור לשמור על זרימה קבועה של מים במערכת, כך שהטמפרטורה של הדם נשארת על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מגש תחתון שטוח עם פתרון אקונומיקה 10% שישמש כדי לטהר כל נשפך דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של דם הכבשים defibrillated לצינור microcentrifuge. תווית זו כ&quot; שליטה &quot;. חזור על התהליך עבור הצינור הניסיוני שכותרתו &quot;5 מיקרומטר DZNep&quot; .Add μl 6 של פתרון מניות DZNep (ראה שלב 1.5) לצינור הניסיוני שכותרתו &quot;5 מיקרומטר DZNep&quot; בעדינות מערבב את הדם וסמים על ידי היפוכו כמה פעמים. דגירה צינור 10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להוסיף 2 מיליליטר של שליטה ודם מבחן לחלק העליון של מתקני האכלה שכותרתו בהתאם. מחק את פיפטה בפתרון אקונומיקה. לכסות את הכלוב עם שקית כהה ולנשום אוויר בכלוב מעת לעת כדי לעודד females להאכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו היתושים להאכיל למשך כ -30 דקות. ברגע ההאכלה הושלמה, לכבות את גוף החימום, לקחת את מתקני ההאכלה החוצה ולהפשיט את Parafilm. משרים את המזין בפתרון אקונומיקה למשך כ -5 דקות ולשטוף היטב במים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מתקני ההאכלה ולשים כדורי צמר גפן במי סוכר בכלובים במשך 48 שעות. מניחים צלחת ביצה המכילה מים ונייר סינון בכלובי לילה כדי להקל על הטלת ביצים. לייבל כל צלחת ביצה עם ריכוז מבחן או שליטה בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת הביצה למחרת ולבחון את המספר והמבנה של ביצים תחת מיקרוסקופ סטריאו. להשיג תמונות באמצעות תוכנת Q-colors5. לספור את מספר הביצים. לנתח הבדל במספר הביצים המתקבלות מכלובים בדיקה ובקרה. הערה: מבחן t מזווג ניתן להשתמש כדי לקבוע אם מספר הביצים שונים באופן משמעותי (p ≤0.05). </li></ol> 3. ביוכימיים Assay של יתוש אנזים עיכובעל ידי תרופות הערה: סעיף זה מתאר assay פעילות אנזים באמצעות DTNB כאינדיקטור לקבוע את ההשפעה של DZNep על עיכוב hydrolase SAH בזכר בוגר ויתושים ממין נקבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 HPO 4 פתרון 0.1 M Na (פוספט נתרן dibasic) על ידי הוספת 14.19 גרם של Na 2 HPO 4 לL 1 של DH 2 O. בשלב הבא, להכין 4 פתרון 0.1 M לאא 2 PO (פוספט נתרן monobasic) על ידי הוספת 13.79 גר &#39;לאא 2 PO 4 לL 1 של DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל M Na פתרון 0.1 2 HPO 4 עם פתרון 0.1 M לאא 2 PO 4 לpH 8.5. הערה: זה יהיה פתרון המניות החוזרת של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הומוגניזציה של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) על ידי הוספת 0.3% Triton X-100. הערה: פתרון הומוגניזציה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלסיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepare פתרון 1.6 מ&quot;מ SAH (MW = 384.4) על ידי המסת 6.15 מ&quot;ג של SAH ב 10 מיליליטר של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1.6 מ&quot;מ DTNB (MW = 396.4) על ידי המסת 6.3 מ&quot;ג של DTNB ב 10 מיליליטר של 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5). שמור את פתרון DTNB הטרי על קרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מ&quot;מ DZNep.HCl 1 (MW = 298.73) פתרון על ידי המסת 0.3 מ&quot;ג של DZNep ב1ml DH 2 O. בשלב הבא, לדלל את פתרון מ&quot;מ DZNep 1 לסדרה של ריכוזים מ1,000 מיקרומטר ל0.002 מיקרומטר ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את עיכוב hydrolase SAH ידי DZNep, להכין תמצית אנזים גולמי של יתושים: Homogenize 10 יתושים בוגרים שאינם דם-fed ב 1 מיליליטר של קר כקרח 0.1 M לאא 2 PO 4 (pH 8.5), המכילים 0.3% Triton X- 100, באמצעות homogenizer רקמת זכוכית. מעביר את homogenate לצינור microcentrifuge 1.5ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate 5 דקות ב10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס. מעביר את supernatant לנקי1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. השתמש supernatant כמקור האנזים לassay ביוכימיים SAH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפול הריק (כלומר, לא DZNep, אין אנזים), להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, ו -100 μl 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) לבארות בודדות של 96-היטב, microplate תחתית שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשליטה (כלומר, אין DZNep), להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, 50 μl 0.1 M Na 2 HPO 4 (pH 8.5) ו -50 אנזים μl (hydrolase SAH מתקבל מתמצית גולמי) ליחיד בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפולי DZNep, להוסיף 50 μl 1.6 מ&quot;מ SAH, 50 μl 1.6 מ&quot;מ DTNB, 50 אנזים μl ו -50 μl ריכוז DZNep נבחר לבארות בודדות. הכן 4 חזרות לכל טיפול ושליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצפיפות האופטית (OD) של דגימות אנזים SAH ב 405 ננומטר במשך 5 דקות במרווחים של 20 שניות באמצעות קורא microplate 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסר OD הריק משליטהnd טיפול OD המתקבל מכל טוב. לחשב את האחוזים הנותרים פעילות hydrolase SAH באמצעות המשוואה הבאה:% פעילות שיורי = (הטיפול OD / הבקרה OD) x 100. </li></ol>

<ol><li>CDC Report. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/malaria">http://www.cdc.gov/malaria</a> (2010).</li>
<li>Gatton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+mosquito+behavioural+adaptations+to+malaria+control+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%3B+International+Journal+of+Organic+Evolution%22%5BJournal%5D)">The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa.</a> Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).</li>
<li>Sternberg, E. D., Thomas, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+to+temperature+and+the+implications+for+vector-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Local adaptation to temperature and the implications for vector-borne diseases.</a> Trends in Parasitology. , (2014).</li>
<li>Rocca, K. A., Gray, E. M., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2La+chromosomal+inversion+enhances+thermal+tolerance+of+Anopheles+gambiae+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">2La chromosomal inversion enhances thermal tolerance of Anopheles gambiae larvae.</a> Malaria Journal. 8, 147(2009).</li>
<li>Coluzzi, M., Sabatini, A., Petrarca, V., Di Deco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+differentiation+and+adaptation+to+human+environments+in+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Chromosomal differentiation and adaptation to human environments in the Anopheles gambiae complex.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73, 483-497 (1979).</li>
<li>Donepudi, S., Mattison, R. J., Kihslinger, J. E., Godley, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Cancer+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Direct%22%5BJournal%5D)">Update on Cancer Therapeutics.</a> Science Direct. 2 (4), 157-206 (2007).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+from+mechanism+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li>
<li>Clough, E., Tedeschi, T., Hazelrigg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+oogenesis+and+germ+stem+cell+maintenance+by+the+Drosophila+histone+methyltransferase+Eggless%2FdSetDB1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of oogenesis and germ stem cell maintenance by the Drosophila histone methyltransferase Eggless/dSetDB1.</a> Developmental Biology. 388, 181-191 (2014).</li>
<li>Conrad, T., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+in+Drosophila+melanogaster%3A+epigenetic+fine-tuning+of+chromosome-wide+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation in Drosophila melanogaster: epigenetic fine-tuning of chromosome-wide transcription.</a> Nature Reviews. Genetics. 13, 123-134 (2011).</li>
<li>Miranda, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DZNep+is+a+global+histone+methylation+inhibitor+that+reactivates+developmental+genes+not+silenced+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">DZNep is a global histone methylation inhibitor that reactivates developmental genes not silenced by DNA methylation.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 8, 1579-1588 (2009).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRIMA-1%2C+a+Mutant+p53+Reactivator%2C+Restores+the+Sensitivity+of+TP53+Mutant-type+Thyroid+Cancer+Cells+to+the+Histone+Methylation+Inhibitor+3-Deazaneplanocin+A+%28DZNep%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">PRIMA-1, a Mutant p53 Reactivator, Restores the Sensitivity of TP53 Mutant-type Thyroid Cancer Cells to the Histone Methylation Inhibitor 3-Deazaneplanocin A (DZNep).</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 99 (11), E962(2014).</li>
<li>Fujiwara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Deazaneplanocin+A+%28DZNep%29%2C+an+inhibitor+of+S-adenosyl-methionine-dependent+methyltransferase%2C+promotes+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">3-Deazaneplanocin A (DZNep), an inhibitor of S-adenosyl-methionine-dependent methyltransferase, promotes erythroid differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polycomb+group+protein+EZH2+is+a+novel+therapeutic+target+in+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The polycomb group protein EZH2 is a novel therapeutic target in tongue cancer.</a> Oncotarget. 4, 2532-2549 (2013).</li>
<li>Nakagawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+therapy+with+the+histone+methyltransferase+EZH2+inhibitor+3-deazaneplanocin+A+inhibits+the+growth+of+cholangiocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Epigenetic therapy with the histone methyltransferase EZH2 inhibitor 3-deazaneplanocin A inhibits the growth of cholangiocarcinoma cells.</a> Oncology Reports. 31, 983-988 (2014).</li>
<li>Crea, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+disruption+of+Polycomb+Repressive+Complex+2+inhibits+tumorigenicity+and+tumor+progression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic disruption of Polycomb Repressive Complex 2 inhibits tumorigenicity and tumor progression in prostate cancer.</a> Molecular Cancer. 10, 40(2011).</li>
<li>Vella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+down-regulation+exacerbates+lipid+accumulation+and+inflammation+in+in+vitro+and+in+vivo+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">EZH2 down-regulation exacerbates lipid accumulation and inflammation in in vitro and in vivo NAFLD.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14, 24154-24168 (2013).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+disruption+of+Polycomb-repressive+complex+2-mediated+gene+repression+selectively+induces+apoptosis+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic disruption of Polycomb-repressive complex 2-mediated gene repression selectively induces apoptosis in cancer cells.</a> Genes & Development. 21, 1050-1063 (2007).</li>
<li>Chiang, P. K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li>
<li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+repressive+complex+2+%28PRC2%29+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ישנם מספר צעדים חיוניים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. עבור assay הזחל, יש להקפיד לתייג בצורה נכונה ולשכפל את כל ריכוז בדיקה. באופן אקראי, דגימות בדיקה והוספת הסכום המיועד של תרופה לבארות מבחן המתאימות היא חלק חשוב מניסיוני זה להגדיר. לפני הוספת זחלי היתושים instar 2 nd לmicroplate 96-היטב, ניתן לשים כל זחל על מגבת נייר במשך 2-3 שניות כדי להסיר עודפי מים. כדי למנוע התייבשות, זחלים חייבים להיות מועברים באופן מיידי לבארות microplate בעזרת זוג מלקחיים בוטה. זה מבטיח את נפח ...

מלריה היא אחראית למספר הגבוה ביותר של מקרי מוות הקשורים חרקים בעולם. 219 מיליון מקרים מוערכים מתרחשים מדי שנה ברחבי העולם, וכתוצאה מכך כ 660,000 מקרי מוות, בעיקר באפריקה 1. למרות מאמצי תוכניות מלריה, בפני מספר אתגרים. בעוד bednets חרקים טופלו ורכיבי מפתח צורת ריסוס שייר מקורה של התכנית, התנגדות לחומרי הדברה באוכלוסיות מקומיות לעכב את המאמצים אלה 2. הגידול המהיר באוכלוסיות יתושים עמידות חרקים מיוחסים במידה רבה ליכולתם של יתושי המלריה להסתגל במהירות לשינויים בסביבה שלהם ולנצל נישות שונות 3,4,5. כדי להתגבר על המנגנונים קיימים התנגדות חרקים, החקירה של מטרות הדברה רומן ותרכובות הדור הבא היא מוצדקת. פרוטוקול פשוט, צעד-אחר-צעד לקביעת היעילות של חומרי הדברה ניסיוניות בשלבי החיים השונים של מלריה מ &#39;osquitoes היה לשפר באופן משמעותי את המאמצים הללו. מחקרים פרמקולוגיים של שפעות תרופה על שורות תאים ומודלים של בעלי החיים הקימו את השימוש בסמים אפיגנטיים ככלי שימושי לויסות הגנטיקה והפיסיולוגיה של תאים ואורגניזמים. מתילציה DNA ושינוי היסטון שני מנגנונים אפיגנטיים המשפיעים על ביטוי גנים ביצורים רב-תאיים, מבלי לשנות את רצף ה- DNA הבסיסי 6. שינויי ההודעה translational כגון מתילציה לשחק תפקיד מכריע בשמירה על שלמות תאים וביטוי גנים, ועשויים להשפיע על מספר תהליכים בסיסיים 7,8,9. מחקר בכמה מיני חרקים הדגיש את החשיבות של אפיגנטיקה בתהליכים מעורבים אאוגנזה ותאי גזע תחזוקה 10, וכן פיצוי מינון 11. עם זאת, כגון היבטים בוקטורי מחלה טרם נחקרו. שימוש במתחם לווסת מערכת זו ביתושים עשוי לספק לנו במראות למסלולי יעד הדברה הרומן. 3-Deazaneplanocin (DZNep) הוא מעכב מתילציה היסטון ידוע, המשפיעים על סוגים שונים של הסרטן נחקרו 12,13,14,15,16. DZNep הוא תרופה יציבה מסיסים במים אפיגנטיים שבעקיפין מעכבת -methyltransferase N ליזין היסטון (EZH2), מרכיב של Polycomb המורכב המדכא 2 (PRC2) בתאי יונקים. PRC2 משחק תפקיד חשוב בויסות הצמיחה של תאי גזע ביצורים רב-תאיים, ומתילציה היסטון היא היבט מרכזי של השתקת גני PRC2 תיווך. בעכברי מדוכאי חיסון, תאים טרום שטופלו בDZNep הוכחו להיות פחות tumorigenic 17. תרופה זו הופכת משמשת לחקר מחלות אחרות, כגון מחלת כבד השומני שאינו אלכוהוליים, שבו הוא מעורבת EZH2 18. DZNep הוא מעכב -adenosylhomocysteine ​​S הוקם (SAH) hydrolase 19, 20. העיכוב של תוצאות hydrolase SAH בהצטברות של SAH ו, בתורו, מובילה לעיכוב של פעילות methyltransferase ידי הגבלת קבוצות תורמות מתיל זמינות. SAH הוא נגזר של חומצת אמינו מנוצל על ידי אורגניזמים רבים, כוללים חרקים, במסלולים המטבוליים שלהם. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי DZNep במינונים נמוכים עלולים להשפיע דיאפאוזה ולעכב את ההתפתחות בחרקים 21. כאן, פרוטוקול חזק כדי לחקור את ההשפעות של מתחם מסיס במים בשלבי חיים שונים של יתושים מפותח. שלושה החלקים של פרוטוקול זה כוללים הוראות לבחינת ההשפעות של מתחם מסיס במים ביתושים בוגרים, נקבות האכלה-דם למבוגרים, ופעילות אנזים של זכר בוגר ונקבת יתושים. ראשית, DZNep מומס במים ללמוד פיתוח יתושים בוגר והישרדות. המהלך זה מתבצע בשני ריכוזים להשוות כל הבדלים הנובעים מגידול של פי 10 בחשיפה לסמים. כדי לחקור את ההשפעה של תרופה על יתושי נקבה, DZNep הבוגרמתווסף לדם כבשים defibrillated והאכיל את הדם באופן מלאכותי לנקבות. בהמשך לכך, התוצאה של התרופה על פוריות נבחנה. לבסוף, assay פעילות אנזים מתבצע באמצעות 5,5&#39;-dithiobis- (חומצת 2-nitrobenzoic) (DTNB) כאינדיקטור לקבוע את ההשפעה של DZNep על עיכוב hydrolase SAH בזכר בוגר ויתושים ממין נקבה. בעוד פרוטוקול זה הוא פותח עם יתושים מלריה, אנופלס gambiae, זה יכול להתאים בקלות לחקר ההשפעות של תרכובות של ריבית על כל מינים של יתושים או חרקים אחרים. הטכניקות מפורטות בפרוטוקול זה לא יכולה להיות מיושמות ביעילות לתרופה עם מסיסות מוגבלת או לא במים או בתקשורת מימית.

<table><tbody><tr><td>96 בארות מיקרופלייט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>סורוול פרסקו</td><td>76003758</td><td>ניתן להשתמש בצנטריפוגה אחרת</td></tr><tr><td>גלילי סרט צבעוני</td><td>פישר</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>אולימפוס</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>כוסות</td><td></td><td></td><td></td>צלחת ביצה</tr><tr><td>ניירות סינון פישר</td><td></td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>מזיני זכוכית</td><td>וירג'יניה טק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית רקמות הומוגנייזר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גוף חימום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>Percival מדעית</td><td>I36VLC8</td><td>ניתן להשתמש בחממה אחרת צינור</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה, 2&nbsp; מ"ל</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה, 1.5&nbsp; מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>מד pH&nbsp;</td><td>מטלר טולדו 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>חנות ב -20 & #176; C</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

התנגדות חרקים מהווה בעיה גדולה עבור תוכניות שליטת מלריה. יתושים להתאים למגוון רחב של שינויים בסביבה במהירות, מה שהופך את המלריה לשלוט בעיה בכל מקום בארצות טרופיות. הופעתם של אוכלוסיות עמידות חרקים מצדיק את החקירה של מסלולי רומן יעד סמים ותרכובות לשליטת יתוש וקטור. תרופות אפיגנטיים מבוססות היטב בחקר הסרטן, אך לא הרבה ידועה על ההשפעות שלהם על חרקים. מחקר זה מספק פרוטוקול פשוט לבחינת ההשפעות הרעילות של 3-Deazaneplanocin (DZNep), תרופה ניסיונית אפיגנטיים לטיפול בסרטן, על וקטור המלריה, אנופלס gambiae. עליית ריכוז תלוי בתמותה וירידה בגודל נצפתה ביתושים בוגרים שנחשפו לDZNep, ואילו המתחם הפחית את הפוריות של יתושים בוגרים יחסית לשלוט טיפולים. בנוסף, חלה ירידה בסמים תלויים בS -adenosylhomocysteine ​​פעילות (SAH) hydrolase ביתושים בעקבות החשיפה לDZNep יחסי לשלוט טיפולים. פרוטוקולים אלה מספקים חוקר עם הליך פשוט, צעד-אחר-צעד כדי להעריך נקודות קצה טוקסיקולוגית מרובות עבור תרופה ניסיונית ו, בתורו, להפגין גישה רבת-שיניים ייחודיות לחקר ההשפעות הרעילות של תרופות אפיגנטיים מסיסים במים או תרכובות של עניין נגד יתושי וקטור וחרקים אחרים.

איור 1 הוא ייצוג סכמטי של מבחני; זה מתאר את השלבים השונים של ההליך המפורט במאמר זה. כפרוטוקול מבוסס על שלבי חיים שונים של יתושים, אין רצף מסוים כדי להיות במעקב במשך הניסויים המפורטים כאן. המשתמש יכול לבחור לנהל מבחני אחד או יותר באותו הזמן, בהתאם לזמינות מדגם. איור 2 מדגים את הצלחת להגדיר עבור מבחני התפתחות יתושים ושארות לא בשלה. מספ...

פותח פרוטוקול לבחינת ההשפעות של תרופה אפיגנטית DZNep על התפתחות, פוריות והישרדות של יתושים. כאן אנו מתארים נהלים לחשיפה מימית של DZNep ליתושים לא בשלים וחשיפה מבוססת דם של DZNep ליתושים בוגרים בנוסף למדידת עיכוב SAH הידרולאז.

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את ההשפעות של תרופה אפיגנטית על שלבי חיים שונים של יתושי מלריה. זה מושג על ידי המסת התרופה בבית הגידול של היתושים הלא בוגרים כדי לקבוע את השפעותיה על הזחלים, ההישרדות וגודל הגוף. התרופה מתווספת גם לדם יונקים ומוזנת לנקבות יתושים בוגרות, שיבדקו את השפעת התרופה על הרבייה.לבסוף, מתבצעת בדיקת אנזים על מנת לבדוק עיכוב של אנזים יתושים על ידי התרופה. התוצאות מראות את ההשפעות של שינויים אפיגנטיים על הישרדות יתושי המלריה ועבור קונטי בהתבסס על ניתוח ביולוגי, היה לנו לראשונה את הרעיון לפרוטוקול זה. כאשר אנו לומדים על סעודה שפותחה כתרופה אפיגנטית מבטיחה נגד סרטן, תרופה זו גורמת למוות אפופטוטי בתאי סרטן אנושיים כמנגנונים לשינוי היסטו הם בעלי חיים הורמונליים משומרים, אנו טועמים כאפליקציית השפעה על יתוש המלריה.כדי להתחיל, בחר את זחלי היתושים של נובליס גמבי במקום השני בכוכב והניח אותם על מגבת נייר למשך שתיים-שלוש שניות כדי להסיר עודפי מים. לאחר מכן הוסף בעדינות 15 זחלים לבאר של צלחת תרבית תאים נטולת נוקלאז של שש בארות המכילה 10 ליטר וילה של מים מזוקקים לבאר. סמן את הבארות בסרטים מקודדים בצבע כדי לחלק את הניסוי באופן אקראי.לאחר מכן סמן שתי בארות לכל ריכוז בדיקה על כל צלחת. לאחר מכן, הכינו תמיסת מלאי NEP הידרוכלוריד מילי-מולרית אחת על ידי המסת 0.3 מיליגרם של דיזי

toxicological-assays-for-testing-effects-an-epigenetic-drug-on

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בראיון זה, ג'ורג' Dimopoulos מתמקד מנגנונים פיזיולוגיים בשימוש על ידי יתושים להילחם Plasmodium falciparum וזיהומים וירוס דנגה. הסבר ניתנת כמה גנים עקשן מפתח, אותם גנים המקנה עמידות פתוגנים וקטור, מזוהות היתוש ועד כמה הידע הזה יכול לשמש כדי ליצור יתושים מהונדס כי אינם יכולים לשאת את טפיל המלריה או וירוס דנגה.

בניית יתוש עדיף: זיהוי הגנים הפעלת מלריה קדחת דנגי ההתנגדות ב א gambiae וא aegypti יתושים

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת הבדיקה המקומית כדי לקבוע את הרעילות של קוטל חרקים פוטנציאלי על נקבות יתושים בוגרות. באמצעות אנטגוניסט לקולטן דופמין הגורם לעיכוב קטלני של הולכה עצבית ביתושים, שיטה זו מתארת דרך להעריך את ההשפעות הרעילות של קוטלי חרקים בשימוש מקומי.

בדיקה מקומית: טכניקה להערכת הפוטנציאל קוטל החרקים של אנטגוניסטים לקולטני דופמין על יתושים בוגרים על ידי יישום מקומי

סרטון זה מדגים בדיקת האכלת דם כדי להעריך את התמותה והפוריות של תרכובות בדיקה עם דרכי פעולה חדשות על נקבות יתושים. טכניקה זו מסייעת בסינון סוגים חדשים של קוטלי חרקים כדי להרוג את האוכלוסייה העמידה של יתושים ולשלוט בהתפשטות מחלות.

בדיקת האכלת יתושים: שיטה להערכת השפעות תרכובת הבדיקה על תמותה וצואה של יתושים בוגרים

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

פרוטוקולים מתוארים להערכת הרעילות של בדיקות, הביוכימיה כדי יתושים ילדותית, למבוגרים לפיתוח כמו שיעורים חדשים של larvicides, adulticides ו- endectocides. הפרוטוקולים מאפשרים תפוקה גבוהה בדיקה של מספר בדיקות, הביוכימיה ב נקודה אחת במינון והערכה עוקבות באמצעות מנה assay התגובה לקביעת רעילות במגע או באמצעות בליעה.

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

המתואר הוא זמן ושיטת חיסכון במקום לספור ביצים ולקבוע את שיעורי הצוהר של יתושים בודדים באמצעות 24 גם צלחות תרבית רקמה, אשר יכול להגדיל באופן משמעותי את קנה המידה ואת המהירות של פוריות ופוריות מבחני.

מבחני פוריות ופוריות משופרים עבור Aedes aegypti באמצעות 24 צלחות תרבית רקמה באר (צלחות EAgaL)

אנו מתארים את המתודולוגיה והחשיבות של היישום האקטואלי bioassay למדידת רגישות לקוטלי חרקים אצל יתושים וזבובי פירות. הבדיקה המוצגת היא בעלת תפוקה גבוהה, משתמשת במסת חרקים - ובכך מאפשרת לחשב מינון קטלני בעל יחסות מסה במקום ריכוז - וסביר להניח שיש לה שונות נמוכה יותר משיטות דומות אחרות.

יישום אקטואלי Bioassay כדי לכמת רעילות קוטל חרקים עבור יתושים וזבובי פירות

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

בהתחשב באנטומיה הפשוטה שלהם, אשכי אנופלס מציעים מודל ציטולוגי טוב לחקר זרע. פרוטוקול זה מתאר הכלאה פלואורסצנטית באתרה , טכניקה המשמשת לחקר תהליך ביולוגי זה, כמו גם את הפנוטיפ של זנים טרנסגניים בעלי מוטציות בגנים המעורבים בייצור זרע.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה לחקר ספרמטוגנזה ביתוש האנופלס

גנטיקה כימית כוללת החלפה של שאריות שוער בחומצת אמינו המכילה שרשרת צדדית שונה במוקד המטרה. כאן, יצרנו טפיל מוטנטי המכיל אלל היפומורפי של cdpk1 וזיהינו מסלולי פיצוי שאומצו על ידי הטפיל ברקע המוטנטי.

הבנת התפתחותם של מסלולי פיצוי בטפיל מלריה מוטנטי בעל אלל היפומורפי של קינאזות דמויות צמחים

התפתחות מינית של פלסמודיום מתרחשת במעי האמצעי של היתוש. התמקדות בשלבים המיניים של הטפיל היא אסטרטגיה מבטיחה לחסימת ההדבקה. פיתחנו את Ookluc, P. berghei טרנסגני המבטא ננו-לוציפראז לאחר היווצרות זיגוטה, המאפשר סינון בתפוקה גבוהה של תרכובות חוסמות העברה. מאמר זה מפרט את שיטות הבדיקה באמצעות Ookluc.

Ookluc: קו פלסמודיום ברגהיי לזיהוי תרכובות חוסמות שידור

חקור את השפעות התרופה האפיגנטית DZNep על יתושי מלריה בשלבי חיים שונים. השיטה כוללת חשיפה מימית לזחלים והזנה דמית לנקבות בוגרות, עם מדידת השרדות, פוריות ועיכוב אנזימטי.

מבחני לבדיקת השפעות רעילים של תרופות אפיגנטיים בפיתוח, פוריות והישרדות של יתושים מלריה

גלה סרטונים נוספים