Name: שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: למדו שיטות להערכת בריאות שריר תת-תאית ב-C. elegans באמצעות GFP ממוקם וצבעים קטיוניים. טכניקות הדמיה מתקדמות אלו מאפשרות ניתוח מבני ופונקציונלי מפורט של שריר שלד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות בארה"ב המכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (AR-054342) ל-NJS. CJG מומן על ידי מלגת הכשרה לדוקטורט במימון אוניברסיטת נוטינגהאם. JJB מומן על ידי פרס הכשרת דוקטורט של MRC (J500495). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

1. זנים, תרבות, ומיקרוסקופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זנים לטפל ולשמור על של C. elegans כפי שתוארו לעיל 19. זנים זמינים ממרכז Caenorhabditis הגנטיקה (CGC). הערה: הזנים המשמשים בניסויים אלה היו CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) אני;-8 (e1489 IV)) עם חלבוני היתוך GFP המקומיים למיטוכונדריה וגרעין; PJ727 (jls01 (מיו-3 :: GFP, רול-6 (su1006)); UNC-54 :: lacZ V) עם חלבוני היתוך GFP המקומיים למנגנון ההתכווצות וPD55 (ccIs55 (sup-7 (st5); unc- 54 :: lacZ V)) עם חלבוני היתוך β-galactosidase המקומיים לcytosol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויי RNAi מלאים כפי שתואר לעיל עבור ניסויי RNAi דורית 13 ולקבל חיידקי RNAi מהרצף מאומתים ספריית ORF-RNAi שנבנתה על ידי מארק ואח ידאל אל. 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות זנים המכילים &lt; em&gt; ccIs 4251, jls01 או ccIs 55 תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית 20. השתמש transgenes אלה כדי ליצור מתח כדי להעריך מבנה המיטוכונדריה רשת, ארגון שרירן או מדינת פרוטוסטאזיס, בהתאמה. לחצות את הזנים למוטציה בי מסתכל על אחד מהתאים תת-התאיים אלה בכל בעל חיים הוא רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במעכב PtdIns-3-kinase, LY-294,002 (LY) כפי שתוארו לעיל 21. בקצרה, להוסיף LY-294,002 בריכוז סופי של 160 מיקרומטר על גבי צלחות NGM OP50 הזרע יבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד את כל התמונות באמצעות מסנן ה- GFP לניסויים מבוסס-GFP ומיקרוסקופ עם מסנן משולש עוקף המאפשר הדמיה של ערוצים אדומים, ירוק וכחול במקביל להערכה בפוטנציאל הממברנה vivo עם C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, נפוץ משווק כMitoTracker האדום CMXRos. לבצע ניתוח תמונה והכנת דמות בתוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>s = "jove_title"&gt; 2. סנכרון של בעלי חיים הזחל L1 שימוש הכבידה הנפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות יום 1 צורך לפני, לעשות חיץ M9 - 22.04 מ"מ KH 2 PO 4, 42.27 מ"מ Na 2 4 HPO, 85.56 מ"מ NaCl (ריכוזים סופיים), ולעקר ידי מעוקר. ברגע שהתקרר עד 45 מעלות צלזיוס, להוסיף סטרילי MgSO 4 עד 1 מ"מ לאחר מעוקר כדי למנוע משקעים 22. לאפשר M9 להתקרר על 4 מעלות צלזיוס וaliquot לתוך צינורות 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הניסוי, להוסיף 3 מיליליטר חיץ M9 לצלחת 9 סנטימטר בודד עם מספרים גבוהים של זחלי L1. לשטוף את הצלחת שוב ושוב על ידי aspirating נוזל M9 וpipetting נגד פני השטח של אגר עם הצלחת שנערכה בזווית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את L1 של מהצלחת ולאחר מכן להעביר את M9 למבחנת 10 מיליליטר בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר למשך 2.5 דקות, כדי לאפשר למבוגרים ולבעלי חיים בשלב זחל מאוחר יותר הגדולים יותר ליפול לתחתית המבחנה ובעלי החיים L1 הקטנים יותר להישאר ליד top של חיץ M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 500 μl העליון של M9 במבחנה באמצעות פיפטה. אז פיפטה זחלי L1 M9 המכילים לצלחת NGM חדשה שנזרע עם 500 OP50 μl מתחת היקף לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל, שואף להעביר ~ 200-300 זחלי L1 לכל צלחת. צג צלחות יומיים מבגרות ובמידת צורך, לאסוף בעלי חיים על צלחות NGM OP50 טריות כדי למנוע להישרף מקור מזון OP50. הערה: זה בדרך כלל 1-3 טיפות של M9 באמצעות פיפטה P1000, אם כי זה משתנה במידה רבה בהתאם למספר L1 של על הצלחת המקורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מחקרים פרוספקטיביים בבעלי חיים בודדים רצויים, ברגע שבעלי חיים מגיעים לבגרות, לאסוף בעלי חיים בודדים להפריד צלחות NGM זרע. העברת בעלי חיים בכל שעות 24-48 להיפרד מבעלי החיים זחל. </li></ol> 3. מבחני תנועה 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מינימום של 2 שעות לפני תחילת ניסויים, להסיר aliquot 50 מיליליטר של M9 ולאפשר לאזן לטמפ 'החדרerature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר חיה מבוגר יחידה למאגר M9 50 μl על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר העיקולים גוף השמאלי וימינה ב 10 שניות, שבו שמאלה אחד ועיקול אחד ימינה שווים למכה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הספירה של תנועות גוף כדי לתת כולל של לפחות 5 מדידות שממנו ניתן לקחת ממוצע. להכפיל מספרים אלה על ידי שש לתת שיעור התנועה לדקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, להעביר את בעל החיים חזרה לצלחת פטרי. שיטה זו מאפשרת מדידה זמנית של תנועה לאורך כל תוחלת החיים בים elegan ג. </li></ol><img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600"> איור 1: מבחני תנועה. ברגע שתולעים נאספים למאגר, שמאלה אחד () וימינה עיקול אחד (B) מתווספים יחד כדי לתת תנועה אחת מלאה(שבץ). 4. הדמיה של מיטוכונדריאלי רשתות וSarcomeres בגוף קיר שרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: הפרוטוקול זהה חל על הדמיה של שתי המיטוכונדריה וsarcomeres. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן תולעים כפי שתואר לעיל (סעיף 1) ולגדול ל48-60 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, כאשר הם מגיעים לבגרות צעירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 תולעים (נציג של הצלחת) מהצלחות אל 20 μl M9 על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל להחליק את המכסה ולהמשיך תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תחת מסנן GFP (460-500 ננומטר, עירור אור הכחול) ב40X הגדלה. </li></ol> 5. הערכת ממברנה פוטנציאלית על ידי שימוש צבירה Assay in vivo עם MitoTracker האדום CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנכרן CB5600 (סעיף 1), כל שכותרתו עם GFP במיטוכונדריה של שרירים, ולגדול לבגרות מוקדמת על OP50 מכיל NGM ל48-60 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μl DMSO לaliquot 50 מיקרוגרם של 32 C H 32 Cl 2 N 2 O כדי להפוך את פתרון מניות של 940.692 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 1 μl של פתרון מניות 940.692 מיקרומטר וresuspend לתוך 199 μl M9 ליצור פתרון עבודה של 4.70 מיקרומטר (4.70346 מיקרומטר). להכין את זה בצינורות 1.5 מיליליטר חומים כי C 32 H 32 Cl 2 N 2 O הוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20 aliquots μl של מיקרומטר 4.70 פתרון עובד (20 תולעים בוגרות לכל 20 aliquot μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 בעלי חיים מבוגרים ל -20 μl של C 4.70 מיקרומטר 32 H 32 Cl 2 N 2 O בצינורות 1.5 מיליליטר החומים. לדגור על 20 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1 שעה, להוסיף 1 מיליליטר M9 לצינורות 1.5 מיליליטר החום המכילים תולעים, צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 10 שניות ולאחר מכן להסיר את supernatant. חזור על שלב זה לשטוף לפני resuspending גלולה התולעת והעברת 20 μ שנותרl (המכיל תולעים) לשקופית הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות של המיטוכונדריה עם 40X הגדלת שימוש במסנן מעביר משולש שמאפשר הדמיה של שני הערוצים האדומים, כחולים וירוקים בו זמנית. הדמיה באמצעות המסנן המשולש העוקף תערוכות שיתוף לוקליזציה של 32 C H 32 Cl 2 N 2 O עם GFP המקומי למיטוכונדריה מופיעה ככתום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלקח תמונה של המיטוכונדריה הכתומה, צילום להלבין את בעלי החיים במשך 10 שניות באמצעות אור באורך הגל 540/25 ננומטר על הגדרות מקסימום עם כל המסננים הוסרו. זה להלבין אדום בתוך המיטוכונדריה ולחשוף את ה- GFP המיטוכונדריה לבד כדי לאשר colocalization במיטוכונדריה שרירים. </li></ol> 6. הערכה של פירוק חלבוני שריר ב C. elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD55s לסנכרן (או כל זן המכיל את גן lacZ) על צלחות NGM זרע עם OP50 (סעיף 1). לגדול לבגרות צעירה ל48-60 שעות ב20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 20 תולעים בוגרות ל -20 μl DDH 2 O על שקופיות מיקרוסקופ. להיות זהיר כדי לנסות ולבחור רק את התולעת ולא כל חיידקים עם הבחירה. תווית שקופית מיקרוסקופ בעיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בתא הייבוש למשך 30 דקות לייבוש ולפצח את הציפורן של בעלי החיים. להבטיח חותם חזק על הייבוש באמצעות שומן סביב החותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את ההתייבשות היה יעיל תחת בהיקף לנתח (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את שקופיות מיקרוסקופ באצטון קר כקרח ל3.5 דקות לאחר מכן לעזוב את שקופית מיקרוסקופ על מגבת נייר בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות, כדי לאפשר אצטון בשקופית להתאדות. בשלב זה להפשיר את חיץ X-gal וחמצון ולאפשר equilibrating לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף X-gal 2 μl 100 μl חיץ חמצון ומערבולת בעדינות כדי להבטיח זאת היא הומוגנית. זהו תמהיל אב חיץ X-gal / החמצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מיקס מאסטר חיץ X-gal / חמצון לכל oאזור riginal של 20 תולעים. בדוק תחת בהיקף לנתח על מנת להבטיח את תערובת האב מכסה לחלוטין את כל בעלי החיים לחלוטין. בעדינות להטות את שקופית מיקרוסקופ כדי להעביר את תערובת האמן על אזורים שבם בעלי חיים אינם מכוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שקף מיקרוסקופ בתא לחות ל1-2.5 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. בעלי חיים תמונה כאשר צבע כחול כהה נמצא בקיר שרירי גופם של בעלי החיים שליטה. להעריך חיות שליטה לפי היקף לנתח כל 15 דקות כדי לקבוע מתי צריכים להיות צילמו בעלי חיים. </li></ol><img alt="איור 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600"> איור 2: הערכה של פירוק חלבוני שריר תוך שימוש במבחני β-galactosidase. בעלי חיים (א) המכילים transgene lacZ נקטפים מצלחות פטרי 20 μl DDH 2 O בשקופית מיקרוסקופ (ב '). בעלי החיים מיובשים ולהיות בורה <s>(ד '). ברגע שאצטון מתאדה תערובת אמן חיץ X-gal / חמצון נוספת (E). הפיתוח של צבע הכחול בבעלי החיים שליטה נבחנים במרווחים של 15 דקות (FL) מt = 0 דקות (F) ועד צבע כחול כהה מתקבל על פני האורך של בעלי החיים (L). תמונות של תולעים נלקחות בהגדלה 2.5x ב AE ו 8X בפלורידה. מתקרב C, D, F, G, ו- L הוא 4X ההגדלה המקורית. </s>

<ol><li>Wannamethee, S. G., Shaper, A. G., Lennon, L., Whincup, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+muscle+mass+and+increased+central+adiposity+are+independently+related+to+mortality+in+older+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Decreased muscle mass and increased central adiposity are independently related to mortality in older men.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 86, 1339-1346 (2007).</li>
<li>Marquis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midthigh+Muscle+Cross-Sectional+Area+Is+a+Better+Predictor+of+Mortality+than+Body+Mass+Index+in+Patients+with+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Midthigh Muscle Cross-Sectional Area Is a Better Predictor of Mortality than Body Mass Index in Patients with Chronic Obstructive Pulmonary Disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166, 809-813 (2002).</li>
<li>Metter, E. J., Talbot, L. auraA., Schrager, M., Conwit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle+Strength+as+a+Predictor+of+All-Cause+Mortality+in+Healthy+Men%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gerontology%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle Strength as a Predictor of All-Cause Mortality in Healthy Men.</a> Journal of Gerontology: Biological Sciences. 57, 359-365 (2002).</li>
<li>Hairi, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Muscle+Strength%2C+Mass+%28Sarcopenia%29%2C+and+Quality+%28Specific+Force%29+and+Its+Relationship+with+Functional+Limitation+and+Physical+Disability%3A+The+Concord+Health+and+Ageing+in+Men+Project%5BTitle%5D)+AND+%22JAGS%22%5BJournal%5D)">Loss of Muscle Strength, Mass (Sarcopenia), and Quality (Specific Force) and Its Relationship with Functional Limitation and Physical Disability: The Concord Health and Ageing in Men Project.</a> JAGS. 58, 2055-2062 (2010).</li>
<li>FitzGerald, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+Fitness+and+All-Cause+Mortality%3A+Prospective+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Activity+and+Health%22%5BJournal%5D)">Muscular Fitness and All-Cause Mortality: Prospective Observations.</a> Journal of Physical Activity and Health. 1, 7-18 (2004).</li>
<li>Consortium, C. eS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854-854 (1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Caenorhabditis+elegans+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode.</a> Caenorhabditis elegans Dev Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>White, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+J+%22The+Anatomy.+In+The+nematode+C.+elegans%22">The Anatomy. In The nematode C. elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1988).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Moerman, D. G., Williams, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+assembly+in+C.+elegans+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22%5BJournal%5D)">Sarcomere assembly in C. elegans muscle.</a> The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+improving+Caenorhabditis+elegans+phenome+mapping+with+an+ORFeome-based+RNAi+library%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library.</a> Genome Res. 14, 2162-2168 (2004).</li>
<li>Etheridge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpains+Mediate+Integrin+Attachment+Complex+Maintenance+of+Adult+Muscle+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Calpains Mediate Integrin Attachment Complex Maintenance of Adult Muscle in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 8, 1002471(2012).</li>
<li>Shephard, F., Adenle, A. A., Jacobson, L. A., Szewczyk, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Functional+Clustering+of+Genes+Regulating+Muscle+Protein+Degradation+from+amongst+the+Known+C.+elegans+Muscle+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Identification and Functional Clustering of Genes Regulating Muscle Protein Degradation from amongst the Known C. elegans Muscle Mutants.</a> PLoS ONE. 6, e24686(2011).</li>
<li>Lehmann, S., Bass, J. J., Szewczyk, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+the+C.+elegans+Kinome+identifies+Kinases+required+for+normal+protein+Homeostasis%2C+Mitochondrial+network+structure%2C+and+Sarcomere+structure+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+%26+Signaling%22%5BJournal%5D)">Knockdown of the C. elegans Kinome identifies Kinases required for normal protein Homeostasis, Mitochondrial network structure, and Sarcomere structure in muscle.</a> Cell Communication & Signaling. 11, (2013).</li>
<li>Herndon, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+and+genetic+factors+influence+tissue-specific+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22C.+elegans.+Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing.</a> C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).</li>
<li>Munoz-Lobato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+DNJ-27%2FERdj5+in+Caenorhabditis+elegans+models+of+human+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Protective role of DNJ-27/ERdj5 in Caenorhabditis elegans models of human neurodegenerative diseases.</a> Antioxid Redox Signal. 5, 5(2013).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Zdinak, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-coded+chimeric+proteins+as+reporters+of+intracellular+proteolysis%3A+starvation-induced+catabolism+of+a+lacZ+fusion+protein+in+muscle+cells+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transgene-coded chimeric proteins as reporters of intracellular proteolysis: starvation-induced catabolism of a lacZ fusion protein in muscle cells of Caenorhabditis elegans.</a> J Cell Biochem. 67, 143-153 (1997).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J Vis Exp. 18, e833(2008).</li>
<li>Szewczyk, N. J., Peterson, B. K., Barmada, S. J., Parkinson, L. P., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposed+growth+factor+signals+control+protein+degradation+in+muscles+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Opposed growth factor signals control protein degradation in muscles of Caenorhabditis elegans.</a> The EMBO Journal. 26, 935-943 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2006).</li>
<li>Gaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prednisone+reduces+muscle+degeneration+in+dystrophin-deficient+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Prednisone reduces muscle degeneration in dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans.</a> Neuromuscular Disorders. 14, 365-370 (2004).</li>
<li>Dillin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+Behavior+and+Aging+Specified+by+Mitochondrial+Function+During+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development.</a> Science. 298, 2398-2401 (2002).</li>
<li>Bakeeva, L., Chentsov, Y., Skulachev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+framework+%28reticulum+mitochondriale%29+in+rat+diaphragm+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial framework (reticulum mitochondriale) in rat diaphragm muscle.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 501, 349-369 (1978).</li>
<li>Ichishita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+for+mitochondrial+proteins+required+to+maintain+the+morphology+of+the+organelle+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen for mitochondrial proteins required to maintain the morphology of the organelle in Caenorhabditis elegans.</a> J Biochem. 143, 449-454 (2008).</li>
<li>Mitchell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+phosphorylation+to+electron+and+hydrogen+transfer+by+a+chemi-osmotic+type+of+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism.</a> Nature. 191, 144-148 (1961).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+mitochondria+with+MitoTracker+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Labeling mitochondria with MitoTracker dyes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 1, 990-992 (2011).</li>
<li>Seo, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+role+of+mitochondria+in+aging%3A+mitochondrial+dynamics+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">New insights into the role of mitochondria in aging: mitochondrial dynamics and more.</a> J Cell Sci. 123, 2533-2542 (2010).</li>
<li>Brys, K., Castelein, N., Matthijssens, F., Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+insulin+signalling+preserves+bioenergetic+competence+of+mitochondria+in+ageing+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Disruption of insulin signalling preserves bioenergetic competence of mitochondria in ageing Caenorhabditis elegans.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Dorrens, J., Rennie, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ageing+and+human+whole+body+and+muscle+protein+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Medicine+%26+Science+in+Sports%22%5BJournal%5D)">Effects of ageing and human whole body and muscle protein turnover.</a> Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 13, 26-33 (2003).</li>
<li>Rennie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressed+protein+synthesis+is+the+dominant+characteristic+of+muscle+wasting+and+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Physiology%22%5BJournal%5D)">Depressed protein synthesis is the dominant characteristic of muscle wasting and cachexia.</a> Clinical Physiology. 3, 387-398 (1983).</li>
<li>Mitch, W. E., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+muscle+wasting.+The+role+of+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway.</a> N Engl J Med. 335, 1897-1905 (1996).</li>
<li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C. The C. elegans Research Community, WormBook. , 1551-8507 (2012).</li>
<li>Kawano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imbalancing+act%3A+gap+junctions+reduce+the+backward+motor+circuit+activity+to+bias+C.+elegans+for+forward+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An imbalancing act: gap junctions reduce the backward motor circuit activity to bias C. elegans for forward locomotion.</a> Neuron. 72, 572-586 (2011).</li>
<li>Fostel, J. L., Benner Coste, L., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+transgene-coded+and+endogenous+proteins+in+the+muscles+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Degradation of transgene-coded and endogenous proteins in the muscles of Caenorhabditis elegans.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 312, 173-177 (2003).</li>
<li>Meissner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+strategy+to+study+muscle+development+and+myofilament+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An integrated strategy to study muscle development and myofilament structure in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genet. 5, (2009).</li>
<li>Rogalski, T. M., Gilbert, M. M., Devenport, D., Norman, K. R., Moerman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIM-1%2C+a+novel+immunoglobulin+superfamily+protein+in+Caenorhabditis+elegans%2C+is+necessary+for+maintaining+bodywall+muscle+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">DIM-1, a novel immunoglobulin superfamily protein in Caenorhabditis elegans, is necessary for maintaining bodywall muscle integrity.</a> Genetics. 163, 905-915 (2003).</li>
<li>Gieseler, K., Grisoni, K., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+suppression+of+phenotypes+arising+from+mutations+in+dystrophin-related+genes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic suppression of phenotypes arising from mutations in dystrophin-related genes in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1092-1097 (2000).</li>
<li>Wilson, K. J., Qadota, H., Benian, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+localization+of+proteins+in+Caenorhabditis+elegans+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent localization of proteins in Caenorhabditis elegans muscle.</a> Methods Mol Biol. 798, 171-181 (2012).</li>
<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 79-99 (2006).</li>
<li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction%2C+oxidative+stress%2C+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death Dis. 9, 513(2014).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li>
<li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Wibom, R., Hagenfeldt, L., von Döbeln, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ATP+production+and+respiratory+chain+enzyme+activities+in+mitochondria+isolated+from+small+muscle+biopsy+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of ATP production and respiratory chain enzyme activities in mitochondria isolated from small muscle biopsy samples.</a> Analytical Biochemistry. 311, 139-151 (2002).</li>
<li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Western+blots%3A+Pitfalls+of+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30, 1845-1855 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שריר הוא רקמה רב תכליתי, להערכה גם לתפקידה בתנועה, תמיכה וחילוף חומרים יציבות. הפיתוח והתחזוקה של שרירים בריאים דורשים התיאום של תהליכים תאיים רבים ורכיבים. או דרך נזק או מחלה, חוסר ויסות יכול להתרחש, וכתוצאה מכך מבנה שריר שינה ו / או בתפקוד. ירידת גיל הקשורים בתפקוד שרירים מציגה נטל משמעותי לתקציבי בריאות בעולם המערבי, שכן מסת שריר 1,2 ובמיוחד כוח וסבולת שרירים 3-5 מתואם שלילי עם תמותה. המדידה של היבטים הקשורים בתפקוד שרירים מתדרדר כגון מיטוכונדריה שינו או שיבוש sarcomere, יכולה לאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים שבבסיס פיתוח שרירים כללי ובריאות. elegans aenorhabditis C (סי אלגנס) הוא BES נמטודות מיקרוסקופילא ידוע כי זה היה אורגניזם רב-תאי הראשון שיש כל הגנום שלו רצף 6, הראשון לגנים המושתקים באמצעות 7 RNAi, ומטזואניים רק כדי elegans 9 נקבע. ג השושלת כל תא 8 וneuroanatomy הוצע לראשונה כ מודל ללימוד הבקרה הגנטית של התנהגות בשנת 1974 על ידי סידני ברנר 10 ואת החשיבות של זה ואת העבודה שלאחר מכן הוכר עם הראשון של שלושה פרסי הנובל שהוענק לחוקרי C. elegans. כ -35% מC. elegans גנים זיהו orthologues בבני אדם, עם סי אלגנס להיות האורגניזם מפתח המשמש להבנת הבקרה הגנטית של התפתחות שרירים 11. כמעט בכל גן בגנום סי אלגנס יכול להיות שברה באמצעות RNAi 7,12. כך, על ידי דריסה גנים בשרירים מפותחים במלואו, מרכיבים גנטיים תורמים למחדשgulation בריאות שרירים יכול להיחקר עם פשטות היחסית 13. היכולת המשולבת לשימוש, מוטציות, ותרכובות כימיות RNAi עושה C. elegans מערכת מובילה לחקר הרגולציה הגנטית 7,14,15 של מבנה שרירים ובתפקוד עם גיל 16 ובמודלים של מחלות 17. ההשפעה של מציאה גן, מוטציה, ו / או חשיפה לחומרים כימיים במבנה שריר ו / או תפקוד ניתן למדוד באמצעות היבטים רבים. כאן אנו מתארים בקצרה טכניקות פשוטות להערכת מבנה C. elegans שרירים ובתפקוד, שרבים מהם יכולים לשמש במחקרים פרוספקטיביים של בריאות שרירים. הפיתוח של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 18 אפשר להדמיה של שני היישוב של חלבונים ספציפיים והמבנה הכללי של האברונים ב C. elegans. כאן אנחנו מסבירים כיצד ה- GFP הביע ספציפיfically בתוך המיטוכונדריה קיר שרירים גוף, ניתן להשתמש בגרעינים, או sarcomeres כדי לקבוע אם ניוון של מבנים תת-תאיים אלה הוא הווה. כמבנה הוא לא תמיד תחליף אמין לפונקציה, אנחנו גם מסבירים כיצד השימוש בצבע קטיוני in vivo מאפשר הערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה פגום שבתוך שריר. כאשר הצבעים משמשים בשילוב עם ה- GFP, שמתירים ללימודי אדריכלות ולתפקד באופן זמני לאורך כל חיים. לבסוף, אנחנו גם מסבירים כיצד הומאוסטזיס חלבונים בתוך שריר ניתן להעריך וכיצד כל אלו, ניתן להשתמש כדי לתאם שינויים בבריאות שרירים בעלי החיים שלמים באמצעות שימוש במבחני תנועה. טכניקות אלו, בשילוב עם מציאה גן, מוטציות, ו / או תרכובות כימיות לספק ארסנל רב עוצמה ללימוד כיצד גנים או תרכובות מסוימים להשפיע על בריאות שרירים בגוף חי. המקבילות במבנה, חילוף חומרים ותפקוד ברוטו של שריר בין סי אלגנס ויונקים אומר סי אלגנס הוא אורגניזם מודל מצטיין להבנת הרגולציה של שריר באורגניזמים שונים, לרבות בני אדם.

<table><tbody><tr><td>MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td><td>Invitrogen</td><td>M-7512</td><td>צבע מיטוכונדריאלי אדום המצטבר על בסיס פוטנציאל ממברנה שלילי</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>67-63-5</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>BDH</td><td>301584L</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה שקופיות</td><td>Starfrost</td><td>K220</td><td></td></tr><tr><td>תלושי כיסוי מיקרוסקופיה</td><td>VW2 International</td><td>631-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל Eppendorph Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB74031</td><td></td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>Nalgene</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>H600L</td><td>מיקרוסקופ ניקון H600L עם תוכנה קניינית</td></tr><tr><td>Nikon Camera</td><td>Nikon DS-Fi1</td><td>Nikon Digital Sight DS-Fi1 מצלמה דיגיטלית&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>Ax10</td><td>Zeiss AX10 מיקרוסקופ עם מצלמה דיגיטלית Axiocam MRC ותוכנת Axiovision LE ומסנן משולש</td></tr><tr><td>צלחות 9 ס"מ</td><td>Starstedt</td><td>82-1473</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 ס"מ</td><td>Gosselin</td><td>BP53-01</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פרוציאניד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>14459-95-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na3PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7601-54-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7240-90-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>68-12-2&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב c. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

שריר הוא רקמה דינמית המגיבה לשינויים בתזונה, פעילות גופנית, ומצב מחלה. אובדן מסת שרירים ובתפקוד עם מחלה וגיל הוא עול משמעותי על בריאות ציבור. בשלב זה אנו מבינים קצת על הרגולציה הגנטית של בריאות שרירים עם מחלה או גיל. סי אלגנס נמטודות הוא מודל שהוקם להבנת הרגולציה הגנומי של תהליכים ביולוגיים של עניין. קיר שרירי גוף של תולעת זו להציג מידה רבה של הומולוגיה עם השרירים של מינים מטזואניים גבוהים יותר. מאז סי אלגנס הוא אורגניזם שקוף, הלוקליזציה של ה- GFP למיטוכונדריה וsarcomeres מאפשרת הדמיה של מבנים אלה in vivo. באופן דומה, האכלת בעלי חיים צבעים קטיוני, אשר מצטברים על בסיס קיומו של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, מאפשר ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה in vivo. שיטות אלה, כמו גם הערכה של homeosta חלבון השריראחות, בשילוב עם הערכה של תפקוד שרירים בעלי החיים שלם, בצורה של מבחני תנועה, כדי לאפשר התאמה של פגמי משנה הסלולר עם פעולות פונקציונליות של ביצועי שרירים. כך, סי אלגנס מספק פלטפורמה רבת עוצמה שבה להעריך את ההשפעה של מוטציות, מציאה גן, ו / או תרכובות כימיות במבנה שרירים ובתפקוד. לבסוף, כGFP, צבעי קטיוני, ומבחני תנועה מוערכים הלא פולשני, ניתן לבצע מחקרים פרוספקטיביים של מבנה שרירים ובתפקוד בכל רחבי כמובן חיים וזה כיום לא ניתן לחקור בקלות in vivo בכל אורגניזם אחר.

מבחני תנועה לכמת פגמי תנועה ירידת תנועה היא מנבא טוב לתמותה בג elegans 16, עם ירידה בשיעורים המצביעים על בעיות במערכת העצבית-שהרירית. שינויים בתנועה, כפי שהוערך על ידי מבחני תנועה, יכולים לנבוע מRNAi נגד גן ספציפי או טיפול תרופתי (איורים 3-5) או בבעלי חיים שעברו מוטציה 13, 23. ירידה בתנועה יכולה לנבוע מפיתוח שינה לדוגמא הבאה דפיקה התפתחותית מטה של גני הובלת אלקטרונים קידוד אני מורכב, III, IV או V 24. בנוסף, ניתן לבדוק התערבויות ספציפיות על סי אלגנס מבוגרים רק כדי לחקור את ההשפעה על פיזיולוגיה פוסט-התפתחותית. לדוגמא, בעלי חיים שטופלו בRNAi נגד UNC-112, המקודדים את C. elegans orthologue של Kindlin-1 אשר מותאם לintegrin מכילהמתחמי קובץ מצורף שריר (איורים 3 ו -4), או גז-1, אשר מקודד מרכיב שלי מורכב של שרשרת העברת אלקטרונים (איור 4), להציג מתווית הפחתה בתנועה לעומת שליטה מתפקיד בגרות-48-72 שעות. זה עשויה להצביע על בעיות עם פיזיולוגיה של שרירים. באופן דומה, הפסד של תנועת 24-72 שעות הוא ציין בתגובה לטיפול במבוגרים בדרך כלל פותח עם טיפול במעכב PI3K LY-294,002 (איור 5). אפשר גם לבדוק את ההשפעה של טיפול שני RNAi, מוטציה, או תרופה בשיקום תנועה בבעלי חיים בו מוצגות תנועה מופחתת בתגובה להתערבות ראשונית. לדוגמא, 112 מוטציות unc- להציג ירידה לכימות בתנועה בהשוואה לבעלי חיים מסוג בר שמוחלש בנוכחות מוטציה שנייה ב 1 לעמעם-13. לכן, מבחני תנועה יכולים לזהות שתי ההתערבויות שמשנות neuromuscuפיתוח LAR ו / או בתפקוד, כמו גם אלה המשפרים ו / או לשקם את התפקוד עצבי-שרירית. הערכה של שיבוש sarcomere לאחר שזיהה את פגם תנועה, הוא לעתים קרובות רצוי לקבוע אם הגורם לפגם התנועה יכול להיות מוסבר על ידי בעיות בעצבים, שרירים, או שניהם. Sarcomeres הם קומפלקסים רב-חלבון בתוך שריר המאפשרים התכווצות וכך להכריח את הדור ותנועה. על ידי בעלי חיים תוך ניצול להביע חלבוני היתוך GFP שרירן מקומיים למנגנון ההתכווצות, לחוטי שרירן וsarcomeres מידת השיבוש יכולה להיות שנצפתה יחסית הלא פולשני ולהבא בבעלי חיים בודדים באמצעות פיתוח ו / או בבגרות. חיות בר-סוג להציג sarcomeres ערוך המופיעים מספר שורות הירוקות מקבילות ישר בתוך כל גוף קיר שרירים (איור 3). הפרעה למערכים הרגילים אלה עשויות להיות קטנה יחסית עםsarcomeres ערוך מופיע להתאחד, במקום שנותר במקביל. פנוטיפ זה, גלוי עם UNC-112 RNAi בזמן t = 24 שעות או 48 שעות (איור 3), דומה להזרמת Z-קו של אתרים מצורפים אקטין בשריר של יונקים. באופן דומה, מנות קטנות של המערכים יכולות להתמוטט או שהם יכולים להיעלם כגון לחלוטין כטיפול בUNC-112 RNAi בזמן t = 48 שעות או t = 72 שעות (איור 3). הנוכחות של פגמי sarcomere בתוך השריר של בעלי חיים המציגים פגם תנועה (איור 3) די בכך כדי להסביר את פגם התנועה אך לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות בתגובה להתערבות . הערכה של מבנה מיטוכונדריאלי רשת בנוכחות פגם תנועה זה לפעמים רצוי לבחון שרירים לפגמים אחרים שעלולות לגרום או לתרום לדה התנועהfect. המיטוכונדריה מספקת את חלק הארי של אנרגיה בתאים וירידה בתנועה עשויה להיות התוצאה של מתן ATP מופחת, צמצום זמינה להתכווצות שריר האנרגיה. כך המבנה של המיטוכונדריה יכול להיבחן על ליקויים. חשוב לא לטשטש חיות עם אזיד הנתרן כפי שגורם לפיצול במיטוכונדריה מהיר; בעלי חיים בניסויים אלה היו משותקים על ידי הלחץ המופעל על ידי להחליק את המכסה. בתוך סי אלגנס wild-type קיר שרירים גוף, מיטוכונדריה נמצאות בתוך רשתות מאורגנות (איור 4) ומיטוכונדריה קיימות ופועלת כרשתית 25. שיבוש של הרשת של המיטוכונדריה מציג כפיצול של הרשת (גז-1 RNAi, איור 4) 26. פיצול עשוי להיות חמור מספיק שלא מראית עין של רשתות מאורגנות נשארה כגון טיפול עם UNC-112 RNAi (איור 4 ב ו-ג) 13. כwiשיבושי ה במבנה sarcomere, פגמים במבנה המיטוכונדריה שרירים בבעלי המציגים פגם תנועה עשויים להיות מספיק כדי להסביר את פגם התנועה אבל זה לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות. לדוגמא, UNC 112-מוטציות 13 וטיפול בUNC-112 RNAi (איורים 3 ו -4) תצוגת שני sarcomeres שיבש ושבשו מבנה המיטוכונדריה. הערכה של תפקוד המיטוכונדריה Vivo פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה קובע את היכולת של המיטוכונדריה כדי ליצור כוח המניע של פרוטונים וליצור 27 ATP, ולכן היכולת להעריך את פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה in vivo מציין את היכולת של בעלי החיים כי כדי לייצר ATP. כשיבושים מבניים המיטוכונדריה יכולים או לא יכולים לשנות יכולת התפקודית של המיטוכונדריה, זה עשוי להיות desirable כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה בבעלי חיים בו מוצגות מבנה המיטוכונדריה שינה. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מצטבר במיטוכונדריה, בכל סוגי התאים, שבו פוטנציאל קרום הוא בהווה ובמכתים את המיטוכונדריה 28 (איור 4C). במיוחד כדי להעריך את התפקוד המיטוכונדריה בשריר, אפשר להשתמש 32 C H 32 Cl 2 N 2 O ומיטוכונדריה השרירים GFP שכותרתו כדי להדגים את ההשפעות של התערבות באופן ספציפי על המיטוכונדריה שריר (איור 4C). לדוגמא, אובדן טיפול המיטוכונדריה קרום פוטנציאלי הבא עם UNC-112 RNAi מונע C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מלהיכנס למטריקס. המיטוכונדריה לכן להראות מעט, אם בכלל כתמים אדומים של המיטוכונדריה בנוסף לתיוג GFP של המיטוכונדריה (איור 4C). גם צילום הלבנה ניתן להשתמש כדי לוודא שנצפהמיטוכונדריה הן דווקא אלה בשריר (איור 4C). זיהוי של קיבולת מופחתת כדי לייצר ATP די בכך כדי להסביר את פגם תנועה שנצפה אך לא לשלול בעיות אחרות בתוך שריר, עצב, ו / או רקמות אחרות. ללא קשר, כמו כושר ייצור ATP המופחת קשור למצבי מחלה בבני אדם 29 והזדקנות 30, זיהוי פגם כזה בתגובה להתערבות מספק במה להקרנה לתרכובות ו / או טיפולי RNAi המשפרים את כושר ייצור ATP ולאחר מכן רשאית אלה תחקור יותר לעומק לפוטנציאל טיפולי. הערכה של פירוק חלבונים בנוכחות פגם תנועה וsarcomeres והמיטוכונדריה נורמלים זה לפעמים רצוי לבחון שרירים לפגמים אחרים שעלולות לגרום או לתרום לפגם התנועה. היכולת לשמור על הומאוסטזיס חלבון היא חתימה של לאבריאות mal, ואילו ירידה בסינתזה של חלבונים ו / או עלייה בפירוק חלבונים היא תוצאה של הזדקנות 31 ומצבי מחלה מרובים 32,33. לכן זה עשוי להיות רצוי לבחון את השרירים של בעלי חיים עם מום תנועה להומאוסטזיס חלבון שונה. ניתן לעשות זאת באמצעות הערכה של רמות של חלבוני שריר cytosolic. השימוש בחלבונים המקודדים על transgenically מאפשר הערכה של פרוטוסטאזיס הספציפי שרירים. לדוגמא, שימוש בבעלי החיים המכילים β-galactosidase, התמזגה לחלק N-terminal של שרירן, שמסונתזים תחת שליטתו של אמרגן שרירן ומשפרים מאפשר הערכה של תכולת חלבון שריר cytosolic 19. הנוכחות של כתם הכחול במבוגרים wild-type מדגימה את הנוכחות של β-galactosidase הפעיל והעדר פירוק חלבוני cytosolic פתולוגיים. הפסד של מכתים בתגובה לטיפול מצביע על פירוק חלבונים פתולוגיים מתרחש (איור 5 13,14,19. לדוגמא, בעלי חיים שלא טופלו wild-type להציג כתם כחול 72 שעות אינטנסיביות אחרי הבגרות, ואילו LY-249,002 חיות שטופלו להציג חוסר הכתם (איור 5). כמו בפגמים במבנה sarcomere ותפקוד המיטוכונדריה, הנוכחות של פירוק חלבוני שריר פתולוגיים די לחשבון לפגם תנועה נצפית אך לא בהכרח לשלול בעיות אחרות עם שרירים, עצבים, ו / או רקמות אחרות. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600"> איור 3: (א) UNC-112 RNAi גורם פגם תנועה משמעותי בזמן t = 72 שעות הערכה (B) של מבנה להקה ערוך בתוך קיר גוף שרירים.. בwלא, להקות בשריר מופיעים קווים ישרים כמו בבגרות צעירה (t = 0 hr) ונותרו במידה רבה אחיד עד מעבר 72 שעות של בגרות (ראה זום WT). UNC-112 RNAi גורם sarcomeres לאבד ארכיטקטורה באזורים קטנים של השריר (t = 24 שעות), התמוטט וsarcomeres החסר (t = 48 שעות), צבירה (פנל העליון t = 72 שעות וזום) ואיבוד הליניאריות של sarcomeres (פנל תחתון t = 72 שעות וזום). ברים סולם מייצגים 25 מיקרומטר ומתקרב הם 2.5x. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600"> איור 4: () UNC-112 או גז 1 RNAi גורם פגם תנועת הערכה (B) של מבנה המיטוכונדריה בתוך קיר גוף שרירים.. המיטוכונדריה בשרירים מופיעה קווים ישרים ברשת כבבגרות צעירה (WT). טיפול בבעלי החיים עם UNC-112 RNAi התוצאה mitochondrפיצול ial כפי שנצפה בעבר בין 24 שעות ו -72 שעות של בגרות (מתקרב וחץ) 13. כמו כן, RNAi נגד גז -1 תוצאות בפיצול של רשתות המיטוכונדריה כפי שנצפו בעבר 26. אלה נמצאים כפערים קטנים ברשת של המיטוכונדריה בזמן t = שעה 24 והתקדמות לחוסר ארגון נרחב ב 72 שעות (ראה זום וחץ). הערכה (C) של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה in vivo. בבעלי חיים המכילים גם GFP מקומי למיטוכונדריה, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O מצטבר במיטוכונדריה שריר קיר גוף ומופיעים כתומים תחת מסנן משולש הגבהה מבגרות צעירה (t = 0 שעה) עד שלאחר בגרות 72 שעות. טיפול עם UNC-112 RNAi גורם לאובדן הדרגתי של פוטנציאל הממברנה כפי שמוצג ב 72 שעות שבו המיטוכונדריה שנותרה להראות פחות הצטברות של C 32 H 32 Cl 2 N 2 O לעומת WT. Photobleaching 10 seג באמצעות מלביני 540/25 ננומטר אור האדום מMitoTracker ומגלה GFP המקומי למיטוכונדריה שריר (+ אקונומיקה תמונה). ברים סולם מייצגים 25 מיקרומטר ומתקרב הם 2.5x. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600"> איור 5: (א) טיפול בLY-294,002 בעלי חיים גורם פגם תנועת הערכה (B) של פירוק חלבונים באמצעות assay β-galactosidase.. הגיל המסונכרן WT זחלי L1 גדלים לבגרות צעירה ב 20 ° C (t = 0 שעה) לפני העברה לNGM זרע עם OP50 (שליטת WT) או NGM זרע עם LY-294,002 (טיפול מעכב PI3K) למשך 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס . ב, כ 20-30 בעלי חיים מוכתמים עבור פעילות β-galactosidase (הכחול) בשעה t = 0 שעה ולאחר 24 שעות, 48 שעות ו -72 שעות.

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

methods-to-assess-subcellular-compartments-of-muscle-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

C. לאלגנס יש שני סוגים של שרירים, סרקומר יחיד וסרקומר מרובה, או שרירים מפושטים. סרטון זה מתאר את סידור שרירי דופן הגוף המפוספסים, האחראים על תנועת התולעת, וכולל פרוטוקול לדוגמה למדידת מורפולוגיית שרירים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

C. elegans מדידות שטח שריר: שיטה סטנדרטית לכימות מורפולוגיית שריר מתוח

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

שקופים C. elegans המעי יכול לשמש"ויוו הרקמה תא" ללמוד apicobasal להן קרום ו לומן ברמה תא בודד, subcellular במהלך multicellular tubulogenesis. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב תיוג סטנדרטי, אובדן-של-פונקציה גנטית/RNAi וגישות מיקרוסקופיים לנתח תהליכים אלה ברמה המולקולרית.

C. elegans המעי כמו המודל עבור המערכת לומן מורפוגנזה ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן ברמה תא בודד: תיוג על ידי נוגדנים מכתים, ניתוח אובדן RNAi-של-פונקציה והדמיה

התעלה excretory C. elegans הוא מודל תא בודד ייחודית לניתוח חזותי ויוו של דה נובו מקוטב ממברנה להן. פרוטוקול זה מתאר שילוב של גישות, וישימה זיהוי ואפיון של מולקולות בימוי חד־תאיות tubulogenesis, הפסגה להן קרום ו לומן סטנדרטי גנטי/RNAi והדמיה.

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

פרוטוקול זה מדגים כיצד לעקוב אחר חלבונים גרעיניים התקה תחת עומס חום באמצעות של זריחה ירוק (GFP) פיוז'ן חלבון כסמן ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) מכתים. דאפי מכתים פרוטוקול מהיר ושומר את האותות לוקליזציה subcellular GFP וחלבון.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

מחקר זה מתאר את המידות הכמותיות של גודל ולוקליזציה, מורפולוגיה שרירים וצורה מיטוכונדרילית ב -C. אלגיה באמצעות כלים זמינים לעיבוד תמונות באופן חופשי. גישה זו מאפשרת לימודים עתידיים ב -C. אלגיה להשוות בין היקף רקמות ושינויים מבניים כתוצאה מוטציות גנטיות.

גישות כמותיים ללימוד מבנים סלולאריים ומורפולוגיה ארגונית בקנבאבדיוטיס

מחקר זה מציג פרוטוקולים עבור שתי גישות ניתוח פעילות לוקומוטור חצי אוטומטי ב C. elegans קומפלקס I מחלות גז-1(fc21) תולעים, כלומר, ZebraLab (בדיקת תפוקה בינונית) ו- WormScan (בדיקה בעלת תפוקה גבוהה) ומספקים ניתוח השוואתי בין מגוון רחב של שיטות מחקר לכימות התנהגות נמטודה ותפקוד עצבי שרירי משולב.

ניתוח השוואתי של שיטות ניסיוניות לכימות פעילות בעלי חיים בקאנורבדיטיס אלגנס מודלים של מחלות מיטוכונדריאליות

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

פרוטוקול זה מספק גישה סטנדרטית להדמיית מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ברקמות מרובות של C. elegans במהלך ההזדקנות.

הדמיה וכימות מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ב - C. elegans במהלך ההזדקנות

למדו שיטות להערכת בריאות שריר תת-תאית ב-C. elegans באמצעות GFP ממוקם וצבעים קטיוניים. טכניקות הדמיה מתקדמות אלו מאפשרות ניתוח מבני ופונקציונלי מפורט של שריר שלד.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans

גלה סרטונים נוספים