המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את הדינמיקה של קיים ארוך שאינו מקודד, RNA, והשינוי האפיגנטי הקשור אליו במהלך השבתת כרומוזום X על ידי שימוש בהכלאה פלואורסצנטית מהירה באתרה בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות. פרוטוקול זה דורש הכנת ציטוזין של שקופיות עם תאי גוף עובריים מבדילים, אשר מחלחלים ולאחר מכן מקובעים לצביעה. סמן פלואורסצנטי הבא הממוקם על ידי נוגדן להיסטון H שלושה טרימתיל ליזין 27 מצטבר על כרומוזום X הלא פעיל.

השלב האחרון משתמש בבדיקות אוליגונוקלאוטידים המכילות שינוי אמינו של חמישה ראשוניים ומסומנות בפלואורופור תגובתי ממוצע AM לביצוע קיים. דג RNA. בסופו של דבר נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להראות את הלוקליזציה של שינוי ענן RNA והיסטון קיים במהלך התמיינות תאי E E.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שאנו משתמשים במספר אוליגונוקלאוטידים ייחודיים, המסומנים בארבע פלואורו יחיד. זה מספק לנו זיהוי ספציפי טרנס, שמקטין את הרקע, וזה גם מגביר את החדירה לגרעין וזה מגביר או משפר את עוצמת האותות. נוסף על כך, כאשר אנו מגדילים את ריכוז הבדיקות, אנו יכולים להפחית משמעותית את הזמן הנדרש להשלמת הניסוי הזה בדגים חיסוניים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי לוקליזציה של RA קיים על כרומוזום האקס הלא פעיל ושינוי הכרומו הקשור אליו. ניתן ליישם אותו גם על מערכות ביולוגיות אחרות לאיתור RAs והשינוי האפיגנטי הקשור אליו, לוקליזציה גרעינית וויסות בין-דורי. כדי להכין את הבדיקות תחילה, השג מספר אוליגואים באורך 20 עד 30 נוקלאוטידים עם טמפרטורת התכה של 63 עד 65 מעלות צלזיוס, ואשר מכילים רצף אנטי-סנס ייחודי לשינוי קיים של RNA ו-A חמישה אמינו ראשוניים.

השעו את האוליגוס הללו בכמויות שוות ערך של בריכת מים טהורים של האוליגו השונים בסך הכל 4.5 מיקרוגרם של DNA. לאחר מכן, בהתאם להוראות היצרן, סמן את האוליגו בצבע פלואורסצנטי תגובתי ממוצע לאחר תיוג האוליגוס. העבירו אותם דרך עמודה G 25.

ואז בעזרת אתנול ונתרן אצטט, זרז את האוליגוס. זה דורש פרק זמן של חצי שעה במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני סיבוב של 21,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הגלולה פעם אחת עם אתנול 70% לאחר הכביסה.

Resus משהה את האוליגוס ב-50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז או tris EDTA לריכוז סופי של 10 מיקרו-מולרי DNA. זה גורם לתמיסת מלאי הגשושית להשתמש בבדיקה לרכז אותה מחדש ל-250 ננו מולרית במאגר הכלאה. בתור התחלה, יש תאים ממיינים של ES או EB הגדלים בשש צלחות באר, שואבים את מדיום התרבות מהבארות ואז שוטפים את התאים בטמפרטורת החדר.

PBS שואפים ביסודיות את ה-PBS. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר תמיסת טריפסין לכל באר ודגרו על הצלחת למשך חמש עד 10 דקות. עצור את תגובת הטריפסין על ידי הוספת חמישה מיליליטר מדיה לכל באר ופיפטינג עדין שלהם.

לאחר מכן העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר. כעת סובב את התאים למשך חמש דקות ב-200 גרם בטמפרטורת החדר, הסר את כל הסופרנטנט והשהה מחדש את משטח התאים בשני מיליליטר PBS. לאחר מכן ספרו את התאים ודללו את התרחיף ל -400,000 תאים למיליליטר ב- PBS.

כעת, הרכיבו כל שקופית עם כרטיס פילטר, תא וקליפס. הכינו כמה שצריך ומקמו אותם ברוטור של סיבוב ציטו. הוסף 250 מיקרוליטר של מתלה תאים לכל שקופית וסובב את המגלשות ב-1500 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

ואז סלסול ותקן. ראשית, העבירו במהירות את המגלשות ל-PBS קר כקרח למשך חמש דקות כשלב שטיפה. שנית, העבירו את השקופיות למאגר CSK קר כקרח למשך דקה אחת כדי לנפח את השלישית, העבירו את השקופיות למאגר CSKT למשך חמש דקות כדי לחלחל לתאים.

רביעית, שטפו את התאים במאגר CSK קר כקרח למשך דקה. ולבסוף, תקן אותם בטמפרטורת החדר 4% אלדהיד פרפורם ב- PBS למשך 10 דקות. ראשית, הסר את השקופיות מפתרון ה-PFA.

לאחר מכן העבירו אותם לצנצנת קופלן עם PBST למשך מספר שניות, ולאחר מכן הניחו אותם על שיפוע לניקוז. לאחר מכן, טען קופסת קצה פיפטה ריקה עם מים מתחת לתוספת מחזיק הקצה. לאחר מכן נגב את הצדדים האחוריים של השקופיות והעבר אותם לתיבה זו.

כעת כסו כל שקופית ב-40 מיקרוליטר של תמיסת חסימה וכסו בעדינות את השקופיות בהחלקות כיסוי. תנו להם לדגור בקופסה למשך 10 דקות על הספסל. לאחר מכן הסר את החלקות הכיסוי והניח את המגלשות על שיפוע.

כעת הוסיפו 40 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים העיקרית. החזר את החלקות הכיסוי ותן לשקופיות לדגור על הספסל למשך 30 דקות לאחר חצי שעה. הסר את הנוגדנים הלא קשורים על ידי שטיפת השקופיות פעמיים ב-PBST בצנצנות קופלן.

השתמשו בניעור עדין והניחו לכל שטיפה למשך חמש דקות. לאחר מכן החזר את השקופיות לשיפוע ותן ל- PBST להתנקז. לאחר מכן ניגוב התמיסה העודפת מהצד האחורי של המגלשה ולאחר מכן החזרת השקופיות לקופסה.

כעת יש למרוח 40 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית אחת עד 500 על כל שקופית. כסו את המגלשות בפתקי כיסוי ותנו להן לדגור על הספסל למשך 15 דקות מוגנות מפני אור קדימה. יש להגן תמיד על המגלשות מפני אור.

הסר את הנוגדנים באמצעות PBST כמו קודם, ולאחר מכן הנח את השקופיות על שיפוע כדי להתנקז. בעת ביצוע אימונופלואורסצנטי, יש לחמם מראש קופסה המכילה מים ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר ניגוב מאגר הכביסה מהצד האחורי של המגלשה, הניחו אותם בקופסת קצה פיפטה עם מים בטמפרטורה ומרחו 500 מיקרוליטר של מאגר שטיפת דגים על כל מגלשה.

תנו להם לדגור במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, שאפו את התמיסה מהשקופיות שליד כל שקופית בשמונה מיקרוליטר של הגשושית העובדת בטמפרטורת החדר ומרחו פתק כיסוי. כעת העבירו את השקופיות לקופסת השקופיות החמה מראש ודגרו עליהן למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, רחצו את המגלשות במאגר שטיפת דגים בצנצנת קופלן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר החלקות הכיסוי נופלות, מה שבדרך כלל לוקח מספר דקות, הסר את החלקות הכיסוי ואפשר לשקופיות לדגור למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את השקופיות לצנצנת המכילה מאגר שטיפת דגים עם 0.5 ננוגרם של כתם למיליליטר, גם הוא ב-37 מעלות צלזיוס.

תן לשקופיות לדגור בתמיסה זו למשך חמש דקות. כעת שטפו את השקופית בשני XSSC חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לסיום, הנח את השקופיות על ניקוז משופע עודף שני XSSC.

נגב אותם והרכיב אותם עם ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת אנטיפה המכילה dpi. דגים חיסוניים מהירים שימשו לצפייה בלוקליזציה של RNA קיים ושינוי היסטון. בתאי EB נקביים מתמיינים קיימים, RNA נראה כמו ענן ירוק המכסה את כל אורכו של כרומוזום X מושבת אחד בתאים אלה, שינוי ההיסטון H שלוש טרימתיל ליזין 27 מוצג באדום והגרעינים מוכתם נגדי על ידי DPI בכחול.

תאי EB של עכברים נקבות עובדו ביום ה-12 של ההתמיינות. בשלב זה, יותר מ-90% מהתאים הראו ענן קיים בתאים שבדיקות אוליגונוקלאוטידים קצרות של גרעינים הצליחו לחדור ביעילות וכתוצאה מכך הצביעו כמעט את כל אותות ההיסטון H שלושת הטרימתיל ליזין 27 עם ענני RNA קיימים ב-150 גרעינים, 97% מאותות ה-RNA הקיימים נמצאו כמתמקמים יחד עם היסטונים מתיליים אלה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מחמש שעות כדי להשלים הכנה קלה.

פלואורסצנציה חיסונית חיסונית עבורו הוא שלושה שליש ב 27 וקיים RA. אם ביצענו כראוי, ניתן ליישם את פרוטוקול הדגים החיסוני הזה על שינויים אפיגנטיים אחרים של RNA וחלבונים מעניינים. על מנת ליישם פרוטוקול זה על מערכת ביולוגית אחרת, ייתכן שתזדקק לאופטימיזציה מסוימת. בהצלחה בניסויים שלך.