Name: המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: למד את פרוטוקול ה-FISH המהיר המשולב עם immunofluorescence לחקירת דינמיקת RNA ארוך שאינו מקודד בתאי גזע עובריים מתמיינים. שיטה זו מאפשרת הדמיה של ענן Xist RNA לצד שינויי היסטון בכרומוזום X הלא פעיל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-Hongjae Sunwoo על עצות מועילות לתכנון אוליגונוקלאוטידים ב-RNA FISH. אנו מודים גם לסרניטי קרטיס על עריכת כתב היד. ניו יורק נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט למחקר בחו"ל של האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS). עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH (RO1-GM102184), קרן המחקר March of Dimes (#6-FY12-337), וקרן ההתפתחות ומענק הנאמן במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי ל-Y.O.

1. בדיקה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג oligonucleotides מרובה הייחודי בXist (oligonucleotides 20-30 נוקלאוטיד באורך, טמפרטורת 63-65 מעלות צלזיוס היתוך, טבלת 1) עם שינוי 5&#39;-אמינו ולהשעות במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמויות בריכת equimolar של oligonucleotides עם 5&#39;-אמינו שינוי (סה&quot;כ 4.5 מיקרוגרם) ותווית עם צבע פלואורסצנטי אמין-reactive הבא הוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את oligonucleotides נקווה ב5 μl הסופי של מים nuclease חינם ולהוסיף 3 μl של סודיום ביקרבונט 1 M לפתרון oligonucleotide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת DMSO 2 μl לבקבוקון של צבע אמין-reactive ובקצרה מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את פתרון oligonucleotide עם צבע תגובתי בDMSO דגירה את התערובת בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את בדיקות oligonucleotide שכותרתו fluorescently על ידי עמודת G-25 ואחריו משקעים אתנול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; טור צנטריפוגה G-25 ב 750 XG עבור 1 דקות כדי להסיר חיץ אחסון עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים nuclease ללא 40 μl לתערובת התיוג מיוצרת בשלב 1.2.3 ואחול על עמודת G-25. צנטריפוגה ב 750 XG למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מים μl nuclease ללא, 10 נתרן אצטט μl 3 M (pH 5.2) ו -250 אתנול μl לבדיקה המטוהרת מהשלב 1.3.2. חנות ב -80 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו צנטריפוגות ב 21,000 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את oligonucleotides זירז פעם אחת עם 1 מיליליטר של אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש ב -50 μl nuclease ללא מים או TE (10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) לריכוז סופי של כ -10 מיקרומטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את בדיקות oligonucleotide שכותרתו fluorescently לריכוז סופי של nM 250 עם חיץ הכלאה (פוראמיד 10%; 2x SSC [300 מ&quot;מ NaCl; ציטראט 30 מ&quot;מ נתרן]; 2 מ&quot;ג / מיליליטר BSA, 10% סולפט dextran). הערה: עם פרוטוקול FISH זה מהר, p oligonucleotideגלימות בXist תוכננו והשתמשו בריכוז גבוה מפרוטוקול FISH הרגיל באמצעות בדיקות oligonucleotide כדי לקצר את זמן הדגירה של הכלאה. </li></ol> 2. החלק הכנה הערה: ניתן להכין שקופיות לאימונו-FISH באמצעות עכבר גזע עוברי (ES) או גוף embryoid (EB) הבחנה תאים 20, 21 או על ידי גידולם ישירות בשקופית שטופל פולי-ליזין או באמצעות cytospin עם השעיה תא. כאן, הכנת שקופיות על ידי cytospin מוצגת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום התרבות בצלחת 6 באר. לשטוף עם PBS (בטמפרטורת חדר), ולשאוב ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של טריפסין לצלחת 6-גם, דגירה למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של מדיום ולפזר תאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התאים לצינור 15 מיליליטר, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 200 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את המדיוםד בעדינות להשעות את התאים 2 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer, ולדלל השעיה תא ב 4 x 10 5 תאים / מיליליטר ידי PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שקופיות, כרטיס מסנן וקאמרי עם קליפ ולהכניס אותם לתוך החריצים המתאימים ברוטור של cytospin. הוסף 250 μl של כל דגימה מוכנה בשלב 2.6 לכל תא של היחידות שהתכנסו בcytospin. צנטריפוגה ב 1500 סל&quot;ד במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 3 צנצנות coplin על קרח עם 40 מיליליטר כל אחד מחיץ PBS, CSK קר כקרח (10 צינורות מ&quot;מ, pH 6.8; 100 מ&quot;מ NaCl; 300 סוכרוז מ&quot;מ; 3 מ&quot;מ MgCl 2), וחיץ CSKT (חיץ CSK עם 0.5% Triton X-100), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר cytospin הוא סיים, להעביר במהירות את השקופית לתוך PBS קר כקרח ודגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השקופית למאגר CSK קר כקרח ודגירת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השקופית למאגר CSKT קר כקרח ודגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השקופית בחזרה לbuf CSK קר כקרחFER דגירה דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השקופית לתוך paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li></ol> 3. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בצנצנת coplin עם PBST (1x PBS עם Tween-20 0.1%) לכמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף מהשקופיות ולמקם אותו בתיבת pipet-קצה ריק עם מים. כיסוי השקופית עם 40 μl של פתרון חסימה (1x PBS, BSA 1%, 20-Tween 0.1%), מניח בעדינות coverslip, ודגירה של 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip, להסיר את פתרון החסימה, ולהוסיף 40 μl של הנוגדן הראשוני היסטון H3K27me3 המדולל לריכוז של 1: 500 בחסימת פתרון. מניחים את coverslip חזרה על שקופיות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: מעכב RNase בפתרון החסימה עשויה להיות מועילה כדי לשמר RNA בRNA FIS זהפרוטוקול H כאשר נוגדני polyclonal משמשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף להחליק 2 פעמים בצנצנות coplin מלאות PBST, במשך 5 דקות כל אחד, בעדינות רועדת בזמן הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף ובמקום להחליק בחזרה לתוך תיבת הקצה. שכבה עם 40 μl של הנוגדנים משני (1: 500) מדוללים בחסימת פתרון, במקום coverslip, ודגירה במשך 15 דקות בחושך. לשלבים הבאים, לשמור על השקופיות בחושך בכל העת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 2 פעמים בCoplin צנצנות עם PBST כמו בשלב 3.4. </li></ol> FISH RNA 4. עם oligonucleotide בדיקות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם תיבת pipet-קצה ריק עם מים בתחתית כדי למנוע שקופיות מהתייבשות על 37 מעלות צלזיוס במשך FISH RNA בשלב 4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות את נוזל עודף השקופיות מצעד 3.6 ובמקום להחליק לתוך תיבת pipet-הקצה עם ואטאה בתחתית. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף FISH (פוראמיד 10% ב2x SSC) בשקופית ודגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון לשטוף FISH, להוסיף 8 μl של בדיקות oligonucleotide לשקופית, במקום להחליק כיסוי, ולהעביר את השקופיות לתיבת pipet-טיפ מראש חימם עם מים בתחתית; לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 צנצנות coplin מראש חימם באמבט מים ב 37 ° C עם חיץ לשטוף FISH, חיץ לשטוף FISH עם DAPI, ו2x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה שעה 1-2 לRNA FISH, לשים את השקופיות לחיץ לשטוף FISH מראש חימם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השקופיות במשך כמה דקות עד coverslip נופל של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף חזרה לחיץ לשטוף, ולהמשיך דגירה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השקופית לצנצנת coplin אחרת עם חיץ לשטוף FISH מראש חימם עם 0.5 ng / ml DAPI ודגירה של 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השקופית לצנצנת coplin אחרת עם מראש חימם 2x SSC ודגירה של 5 ק&quot;מn. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בשיפוע המאפשר נותר חיץ לזרום במורד המגלשה. לנגב בזהירות נוזל עודף ובמקום להחליק בחזרה לתוך תיבת קצה יבשה. הוסף 4 μl של antifade עם DAPI לשקופית ומניח coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את coverslip עם לק ולהתבונן תחת מיקרוסקופ. השקופית יכולה להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בחושך במשך כמה חודשים. </li></ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gracefully+ageing+at+50%2C+X-chromosome+inactivation+becomes+a+paradigm+for+RNA+and+chromatin+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).</li>
<li>Gendrel, A. V., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+X-inactivation+research%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fifty years of X-inactivation research.</a> Development. 138, 5049-5055 (2011).</li>
<li>Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+by+RNAs%3A+X-inactivation+as+a+model+for+lncRNA+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function.</a> J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).</li>
<li>Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Xist+in+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirement for Xist in X chromosome inactivation.</a> Nature. 379, 131-137 (1996).</li>
<li>Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xist-deficient+mice+are+defective+in+dosage+compensation+but+not+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis.</a> Genes Dev. 11, 156-166 (1997).</li>
<li>Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+paints+the+inactive+X+chromosome+at+interphase%3A+evidence+for+a+novel+RNA+involved+in+nuclear%2Fchromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure.</a> J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).</li>
<li>Sado, T., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+chromosome+silencing+by+the+long+non-coding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Xist.+Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA.</a> Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li>
<li>Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation.</a> Science. 300, 131-135 (2003).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+histone+h3+methylation+on+the+inactive+X+chromosome+requires+transient+recruitment+of+Eed-Enx1+polycomb+group+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes.</a> Dev Cell. 4, 481-495 (2003).</li>
<li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+synthesis+of+the+genes+for+ribosomal+RNA+during+amphibian+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).</li>
<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
<li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
<li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309, 1564-1566 (2005).</li>
<li>Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-inactivation+intergenic+transcription+elements+that+regulate+the+probability+of+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice.</a> Mol Cell. 11, 731-743 (2003).</li>
<li>Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+inactivation+in+mouse+ES+cells%3A+histone+modifications+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).</li>
<li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells%3A+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).</li>
<li>Lee, J. T., Lu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+Tsix+leads+to+nonrandom+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation.</a> Cell. 99, 47-57 (1999).</li>
<li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182, 685-698 (2009).</li>
<li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+histone+H3+modifications+as+revealed+by+a+panel+of+specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies.</a> Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).</li>
<li>Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersection+of+the+RNA+interference+and+X-inactivation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways.</a> Science. 320, 1336-1341 (2008).</li>
<li>Kohlmaier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromosomal+memory+triggered+by+Xist+regulates+histone+methylation+in+X+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation.</a> PLoS Biol. 2, 171(2004).</li>
<li>Wang, K. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Mol Cell. 43, 904-914 (2011).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

במאמר זה, שהצגנו פרוטוקול חיסוני FISH מהיר שלוקח פחות מ 5 שעות כדי להשלים הכנת שקופיות, Xist RNA FISH, וimmunofluorescence לH3K27me3. בהשוואה לגישה חיסונית FISH הכללי לXist RNA זיהוי, אשר בדרך כלל צריך דגירה הלילה לRNA FISH, פרוטוקול זה לא רק מפחית באופן משמעותי את משך זמן, אלא גם משפר את הרגישות של חיסון-FISH באמצעות בדיקות oligonucleotide. מאז Xist הוא עיבד מאוד במהלך איון כרומוזום X והתמליל שלה נמצא לצבור עוצמ...

איון כרומוזום X יונקים (xci) הוא אסטרטגיה כדי לפצות על חוסר האיזון במינון גן צמוד X בין XX וXY, שבו אחד משני כרומוזומי X-בנקבות הוא תעתיק 1 מומת. איון כרומוזום X הוא מערכת מודל נהדרת עבור RNA קידוד שאינו ארוך מחקר (lncRNA). איון כרומוזום X מוסדר על ידי lncRNAs מרובה, ונחקר בהרחבה בעשרות השנים האחרונות לחשוף את מנגנוני crosstalk בין lncRNAs, שעתוק, מבנה הכרומטין וארגון גרעיני 2, 3. מרכז איון X (XIC) הממוקם על כרומוזום X הוא מוקד גנטי מורכב מורכב ממספר גני ייצור RNAs ללא קידוד 4. X-פעיל תמליל ספציפי (Xist) lncRNA ביונקי eutherian הוא lncRNA אחד כזה אשר ממלא תפקיד מכריע באיון כרומוזום X 5,6. תמלילי Xist מקיפים את מיקומו של פוture Xi ליזום איון כרומוזום X, ומופיע כענן כאשר דמיינו באמצעות RNA FISH; מערך זה נקרא &quot;Xist הענן&quot; 7. מאז Xist RNA אינטראקציה עם אנזימי שינוי הכרומטין שונים, שיתוף לוקליזציה של ענני Xist עם שינויים אפיגנטיים שונים להכרומטין השקט ושעתוק דיכוי הוא ציין במהלך איון כרומוזום X 8. לדוגמא, Xist RNA אינטראקציה עם מורכב Polycomb מדכא 2 (PRC2) האחראית על H3K27me3 וגורם למצב הכרומטין דיכוי 9. המופע של ענן Xist על Xi ושיתוף הלוקליזציה שלה עם שינוי H3K27me3 האינטנסיבי מייצג נוף heterochromatin פקולטטיביים של Xi 10,11. טכניקות ציטוגנטית, כגון DNA / RNA FISH יש כברת דרך מהשיטה המסורתית באמצעות בדיקות radiolabelled 12 לטכניקות האחרונות ומתקדמות ברגישות ובמשופרותהדמיה ניאון באמצעות בדיקות oligonucleotide מרובות 13,14. FISH DNA / RNA בשילוב עם immunofluorescence נעשה שימוש באופן שגרתי ככלי ציטולוגית להבין ארגון spatiotemporal גרעיני, לוקליזציה RNA, מבנה הכרומטין ושינויים. הכנת הבדיקה סטנדרטית ביותר עבור RNA FISH כרוך בשימוש בפלסמיד או כרומוזום מלאכותי שיבוטים חיידקים (BAC) והתיוג הבא שלהם או עם תרגום לכינוי או לתחולו אקראי 15. עם זאת, כמעט 70% מהגנים בעכברים ו -40% מהגנים בבני האדם להראות חפיפה של תמלילי תחושה וantisense 16, ומכאן צורך בשיטת FISH גדיל הספציפי כדי להבדיל תמלילי תחושה וantisense. במבחנה בדיקות RNA עיבד (riboprobe ) משמש לעתים קרובות לFISH גדיל RNA ספציפי 17,18; עם זאת, מדובר בהכנת שיבוט פלסמיד או מוצר PCR עם T7, SP6, או אמרגן T3 וriboprobes סינתזה. יתר על כן, Riboprobes נגזר מgenomic DNA או cDNA לעתים קרובות מכיל אזורים שאינם ספציפיים ואלמנטים חוזרים, אשר יביאו לרעש רקע גבוה. בעיה נוספת היא שriboprobes, שהם כמה מאה נוקלאוטידים באורך ומכיל fluorophores מרובה, לא יכולה לחדור ביעילות לתוך הגרעין. כדי לעקוף את זה, בדיקות oligonucleotide קצרות מרובות שכותרתו עם fluorophore אחד בסוף פותחו שיש לי רגישות טובה, עוצמת אות אחידה, וקלות לניקוי וטיפול 14. בנוסף, oligonucleotides DNA הוא בדרך כלל יציב יותר מRNA. אנחנו מוחלים אסטרטגיה דומה של שימוש בoligonucleotides Xist RNA FISH 19 עם immunofluorescence להבין את הדינמיקה אפיגנטיים של Xi הנגרמת על ידי Xist lncRNA במהלך התהליך של איון כרומוזום X. פרוטוקול זה מתאר את הקמתה של בדיקות oligonucleotide והכנה נכונה של תאים, כמו גם ניצול של immunofluorescence וRNA FISH. Xist RNA FISH באמצעות oligonucle מרובהotides היא גישה יעילה עלות בטווח הארוך אם Xist RNA FISH מבוצע באופן שוטף במעבדתו של אחד. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות lncRNAs בתאים תוך מיפוי שיתוף הלוקליזציה שלה עם שינויים או גורמים אפיגנטיים בו-זמנית. אחד יתרונות עיקריים של הפרוטוקול הוא היכולת לשנות אותו בקלות כדי להתאים תחומי המחקר של אחד.

<table><tbody><tr><td>אוליגונוקלאוטידים עם שינוי אמינו 5'</td>-<td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Reactive Dye</td><td>Life Technologies</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin G-25 עמודות</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין, דרגת ביולוגיה מולקולרית (עבור מאגר הכלאה)</td> <td>Roche</td><td></td><td></td>10715859103</tr><tr><td>היסטון H3K27me3 נוגדן</td><td>מוטיב פעיל</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 עז נגד עכבר, ספיחה צולבת גבוהה</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold נוגדן נגד דהייה</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לxist rna משולב עם immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום x

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

שילוב ניאון RNA הכלאה באתר (דגים) עם immunofluorescence (חיסוני דגים) יוצר בטכניקה שיכולה להיות מועסק ברמת התא הבודד כדי לזהות את הדינמיקה המרחבית של לוקליזציה RNA עם תובנה סימולטני ללוקליזציה של חלבונים, שינויים אפיגנטיים ופרטים נוספים אשר יכול להיות מודגש על ידי immunofluorescence. איון כרומוזום X הוא פרדיגמה להשתקת גנים ארוכה RNA קידוד שאינו (lncRNA) בתיווך. הצטברות X-פעיל תמליל ספציפי (Xist) lncRNA (נקראת Xist ענן) באחת משני כרומוזומים X-בנקבות יונקים היא שלב קריטי ליזום איון כרומוזום X. RNA Xist במישרין או בעקיפין אינטראקציה עם אנזימי שינוי הכרומטין שונים ומציג נופים אפיגנטיים ברורים לכרומוזום X פעיל (Xi). סימן היכר ידוע אפיגנטיים אחד Xi הוא trimethyl ליזין היסטון H3 27 שינוי (H3K27me3). כאן אנו מתארים חיסוני FISH פשוט ומהירפרוטוקול לאיתור Xist RNA באמצעות RNA FISH עם בדיקות oligonucleotide מרובות בשילוב עם immunofluorescence של H3K27me3 לבחון את הלוקליזציה של Xist RNA ושינויים אפיגנטיים הקשורים. שימוש בתוצאות בדיקות oligonucleotide בזמן דגירה קצר יותר וגילוי רגיש יותר של Xist RNA בהשוואה לבדיקות RNA במבחנה עיבד (riboprobes). פרוטוקול זה מספק כלי רב עוצמה להבנת הדינמיקה של lncRNAs והשינוי אפיגנטיים הקשורים אליו, מבנה הכרומטין, ארגון גרעיני ורגולצית תעתיק.

נציג תמונות של חיסוני FISH מהיר מוצגות באיור 1 א. שיתוף לוקליזציה של אות הענן וH3K27me3 Xist RNA על Xi התגלתה בהבחנת תאים נקביים. ביום 12 על בידול, יותר מ -90% מתאי EB היו ענן Xist (איור 1). בדיקות oligonucleotide הקצר חדרו יעילות לתוך הגרעינים, שמובילות להדמיה של כמעט כל אותות H3K27me3 שיתוף מקומי עם Xist RNA (איור 1 ג; 97%, n = 150). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direc...

פיתחנו פרוטוקול פלואורסצנטי ספציפי לגדיל (FISH) המותאם אישית בקלות בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות. זה מאפשר בחינה מפורטת של דינמיקת RNA עם תובנה בו-זמנית לגבי מבנה הכרומטין, הארגון הגרעיני וויסות השעתוק ברמת התא הבודד.

המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את הדינמיקה של קיים ארוך שאינו מקודד, RNA, והשינוי האפיגנטי הקשור אליו במהלך השבתת כרומוזום X על ידי שימוש בהכלאה פלואורסצנטית מהירה באתרה בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות. פרוטוקול זה דורש הכנת ציטוזין של שקופיות עם תאי גוף עובריים מבדילים, אשר מחלחלים ולאחר מכן מקובעים לצביעה. סמן פלואורסצנטי הבא הממוקם על ידי נוגדן להיסטון H שלושה טרימתיל ליזין 27 מצטבר על כרומוזום X הלא פעיל.השלב האחרון משתמש בבדיקות אוליגונוקלאוטידים המכילות שינוי אמינו של חמישה ראשוניים ומסומנות בפלואורופור תגובתי ממוצע AM לביצוע קיים. דג RNA. בסופו של דבר נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להראות את הלוקליזציה של שינוי ענן RNA והיסטון קיים במהלך התמיינות תאי E E.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שאנו משתמשים במספר אוליגונוקלאוטידים ייחודיים, המסומנים בארבע פלואורו יחיד. זה מספק לנו זיהוי ספציפי טרנס, שמקטין את הרקע, וזה גם מגביר את החדירה לגרעין וזה מגביר או משפר את עוצמת האותות. נוסף על כך, כאשר אנו מגדילים את ריכוז הבדיקות, אנו יכולים להפחית משמעותית את הזמן הנדרש להשלמת הניסוי הזה בדגים חיסוניים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי לוקליזציה של RA קיים על כרומוזום האקס הלא פעיל ושינוי הכרומו הקשור אליו. ניתן ליישם אותו גם על מערכות ביולוגיות אחרות לאיתור RAs והשינוי האפיגנטי הקשור אליו, לוקליזציה גרעינית וויסות בין-דורי. כדי להכין את הבדיקות תחילה, השג מספר אוליגואים באורך 20 עד 30 נוקלאוטידים עם טמפרטורת התכה של 63 עד 65 מעלות צלזיוס, ואשר מכילים רצף אנטי-סנס ייחודי לשינוי קיים של RNA ו-A חמישה אמינו ראשוניים.השעו את האוליגוס הללו בכמויות שוות ערך של בריכת מים טהורים של האוליגו השונים בסך הכל 4.5 מיקרוגרם של DNA. לאחר מכן, בהתאם להוראות היצרן, סמן את האוליגו בצבע פלואורסצנטי תגובתי ממוצע לאחר תיוג האוליגוס. העבירו אותם דרך עמודה G 25.ואז בעזרת אתנול ונתרן אצטט, זרז את האוליגוס. זה דורש פרק זמן של חצי שעה במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני סיבוב של 21,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הגלולה פעם אחת עם אתנול 70% לאחר הכביסה.Resus משהה את האוליגוס ב-50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז או tris EDTA לריכוז סופי של 10 מיקרו-מולרי DNA. זה גורם לתמיסת מלאי הגשושית להשתמש בבדיקה לרכז אותה מחדש ל-250 ננו מולרית במאגר הכלאה. בתור התחלה, יש תאים ממיינים של ES או EB הגדלים בשש צלחות באר, שואבים את מדיום התרבות מהבארות ואז שוטפים את התאים בטמפרטורת החדר.PBS שואפים ביסודיות את ה-PBS. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר תמיסת טריפסין לכל באר ודגרו על הצלחת למשך חמש עד 10 דקות. עצור את תגובת הטריפסין על ידי הוספת חמישה מיליליטר מדיה לכל באר ופיפטינג עדין שלהם.לאחר מכן העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר. כעת סובב את התאים למשך חמש דקות ב-200 גרם בטמפרטורת החדר, הסר את כל הסופרנטנט והשהה מחדש את משטח התאים בשני מיליליטר PBS. לאחר מכן ספרו את התאים ודללו את התרחיף ל -400,000 תאים למיליליטר ב- PBS.כעת, הרכיבו כל שקופית עם כרטיס פילטר, תא וקליפס. הכינו כמה שצריך ומקמו אותם ברוטור של סיבוב ציטו. הוסף 250 מיקרוליטר של מתלה תאים לכל שקופית וסובב את המגלשות ב-1500 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.ואז סלסול ותקן. ראשית, העבירו במהירות את המגלשות ל-PBS קר כקרח למשך חמש דקות כשלב שטיפה. שנית, העבירו את השקופיות למאגר CSK קר כקרח למשך דקה אחת כדי לנפח את השלישית, העבירו את השקופיות למאגר CSKT למשך חמש דקות כדי לחלחל לתאים.רביעית, שטפו את התאים במאגר CSK קר כקרח למשך דקה. ולבסוף, תקן אותם בטמפרטורת החדר 4% אלדהיד פרפורם ב- PBS למשך 10 דקות. ראשית, הסר את השקופיות מפתרון ה-PFA.לאחר מכן העבירו אותם לצנצנת קופלן עם PBST למשך מספר שניות, ולאחר מכן הניחו אותם על שיפוע לניקוז. לאחר מכן, טען קופסת קצה פיפטה ריקה עם מים מתחת לתוספת מחזיק הקצה. לאחר מכן נגב את הצדדים האחוריים של השקופיות והעבר אותם לתיבה זו.כעת כסו כל שקופית ב-40 מיקרוליטר של תמיסת חסימה וכסו בעדינות את השקופיות בהחלקות כיסוי. תנו להם לדגור בקופסה למשך 10 דקות על הספסל. לאחר מכן הסר את החלקות הכיסוי והניח את המגלשות על שיפוע.כעת הוסיפו 40 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים העיקרית. החזר את החלקות הכיסוי ותן לשקופיות לדגור על הספסל למשך 30 דקות לאחר חצי שעה. הסר את הנוגדנים הלא קשורים על ידי שטיפת השקופיות פעמיים ב-PBST בצנצנות קופלן.השתמשו בניעור עדין והניחו לכל שטיפה למשך חמש דקות. לאחר מכן החזר את השקופיות לשיפוע ותן ל- PBST להתנקז. לאחר מכן ניגוב התמיסה העודפת מהצד האחורי של המגלשה ולאחר מכן החזרת השקופיות לקופסה.כעת יש למרוח 40 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית אחת עד 500 על כל שקופית. כסו את המגלשות בפתקי כיסוי ותנו להן לדגור על הספסל למשך 15 דקות מוגנות מפני אור קדימה. יש להגן תמיד על המגלשות מפני אור.הסר את הנוגדנים באמצעות PBST כמו קודם, ולאחר מכן הנח את השקופיות על שיפוע כדי להתנקז. בעת ביצוע אימונופלואורסצנטי, יש לחמם מראש קופסה המכילה מים ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר ניגוב מאגר הכביסה מהצד האחורי של המגלשה, הניחו אותם בקופסת קצה פיפטה עם מים בטמפרטורה ומרחו 500 מיקרוליטר של מאגר שטיפת דגים על כל מגלשה.תנו להם לדגור במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, שאפו את התמיסה מהשקופיות שליד כל שקופית בשמונה מיקרוליטר של הגשושית העובדת בטמפרטורת החדר ומרחו פתק כיסוי. כעת העבירו את השקופיות לקופסת השקופיות החמה מראש ודגרו עליהן למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, רחצו את המגלשות במאגר שטיפת דגים בצנצנת קופלן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר החלקות הכיסוי נופלות, מה שבדרך כלל לוקח מספר דקות, הסר את החלקות הכיסוי ואפשר לשקופיות לדגור למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את השקופיות לצנצנת המכילה מאגר שטיפת דגים עם 0.5 ננוגרם של כתם למיליליטר, גם הוא ב-37 מעלות צלזיוס.תן לשקופיות לדגור בתמיסה זו למשך חמש דקות. כעת שטפו את השקופית בשני XSSC חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לסיום, הנח את השקופיות על ניקוז משופע עודף שני XSSC.נגב אותם והרכיב אותם עם ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת אנטיפה המכילה dpi. דגים חיסוניים מהירים שימשו לצפייה בלוקליזציה של RNA קיים ושינוי היסטון. בתאי EB נקביים מתמיינים קיימים, RNA נראה כמו ענן ירוק המכסה את כל אורכו של כרומוזום X מושבת אחד בתאים אלה, שינוי ההיסטון H שלוש טרימתיל ליזין 27 מוצג באדום והגרעינים מוכתם נגדי על ידי DPI בכחול.תאי EB של עכברים נקבות עובדו ביום ה-12 של ההתמיינות. בשלב זה, יותר מ-90% מהתאים הראו ענן קיים בתאים שבדיקות אוליגונוקלאוטידים קצרות של גרעינים הצליחו לחדור ביעילות וכתוצאה מכך הצביעו כמעט את כל אותות ההיסטון H שלושת הטרימתיל ליזין 27 עם ענני RNA קיימים ב-150 גרעינים, 97% מאותות ה-RNA הקיימים נמצאו כמתמקמים יחד עם היסטונים מתיליים אלה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות מחמש שעות כדי להשלים הכנה קלה.פלואורסצנציה חיסונית חיסונית עבורו הוא שלושה שליש ב 27 וקיים RA. אם ביצענו כראוי, ניתן ליישם את פרוטוקול הדגים החיסוני הזה על שינויים אפיגנטיים אחרים של RNA וחלבונים מעניינים. על מנת ליישם פרוטוקול זה על מערכת ביולוגית אחרת, ייתכן שתזדקק לאופטימיזציה מסוימת. בהצלחה בניסויים שלך.

quick-fluorescent-situ-hybridization-protocol-for-xist-rna-combined

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הר שלמים הכלאה באתרו היא אחת הטכניקות הנפוצה ביותר בביולוגיה התפתחותית. כאן, אנו מציגים ברזולוציה גבוהה פלורסנט כפול פרוטוקול הכלאה באתרו לניתוח דפוס הביטוי המדויק של גן יחיד לקביעת חפיפה של תחומים הביטוי של שני גנים. אנו כוללים propidium גרעיני יודיד נגד כתם להדגיש ארגון רקמות.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם...

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לביצוע הכלאה של DNA פלואורסצנטי באתרו (DNA ISH) כדי לדמיין רצפים הטרוכרומטיים חוזרים ונשנים על כרומוזומים המותקנים בשקופיות. השיטה דורשת ריאגנטים מינימליים והיא רב-תכליתית לשימוש עם בדיקות קצרות או ארוכות, רקמות שונות וזיהוי עם אותות פלואורסצנטיים או שאינם מבוססי פלואורסצנטיות.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

אנו מציגים פרוטוקול דו-חלקי המשלב הדמיה של סידן פלורסנט עם היברידיזציה באתרו, ומאפשר לניסויים לתאם דפוסים של פעילות הסידן עם פרופילי ביטוי גנים ברמה של תא אחד.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

מאמר זה מציג שתי שיטות המבוססות על הכלאה פלואורסצנטית באתרו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

למד את פרוטוקול ה-FISH המהיר המשולב עם immunofluorescence לחקירת דינמיקת RNA ארוך שאינו מקודד בתאי גזע עובריים מתמיינים. שיטה זו מאפשרת הדמיה של ענן Xist RNA לצד שינויי היסטון בכרומוזום X הלא פעיל.

המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X

גלה סרטונים נוספים