Name: התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח, Tribolium castaneum (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: למדו את שיטת ה-RNAi בזחלים של חיפושית הקמח האדומה Tribolium castaneum להשתקת גנים וחקר תפקודם. שיטה זו מאפשרת ניתוח פנוטיפים מהיר בביולוגיה התפתחותית של חרקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרכז לביואינפורמטיקה וגנומיקה פונקציונלית (CBFG) באוניברסיטת מיאמי לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת מיאמי מענק הזנק (יט), וקרן הלאומית למדע (יט: IOS 0,950,964).

<ol><li>Denell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Tribolium+as+a+genetic+model+system+and+its+early+contributions+to+evo-devo%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of Tribolium as a genetic model system and its early contributions to evo-devo.</a> Genetics. 180, 1779-1786 (2008).</li>
<li>Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tribolium.</a> Curr Biol. 14, R639-R640 (2004).</li>
<li>Richards, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+model+beetle+and+pest+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum.</a> Nature. 452, 949-955 (2008).</li>
<li>Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera).</a> Curr Biol. 12, 85-86 (2002).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Tribolium+%28Coleoptera%29+for+analyzing+adult+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Dev Genes Evol. 214, 575-578 (2004).</li>
<li>Tomoyasu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+systemic+RNA+interference+in+insects+a+genome-wide+survey+for+RNAi+genes+in+Tribolium%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Exploring systemic RNA interference in insects a genome-wide survey for RNAi genes in Tribolium.</a> Genome biology. 9, R10(2008).</li>
<li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum+parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PLoS ONE. 7, e47431(2012).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Arakane, Y., Kramer, K. J., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+co-options+of+exoskeleton+formation+during+wing-to-elytron+evolution+in+beetles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repeated co-options of exoskeleton formation during wing-to-elytron evolution in beetles.</a> Curr Biol. 19, 2057-2065 (2009).</li>
<li>Miller, S. C., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+RNAi+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Larval RNAi in Drosophila.</a> Dev Genes Evol. 218, 505-510 (2008).</li>
<li>Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNAi+to+investigate+orthologous+homeotic+gene+function+during+development+of+distantly+related+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutio.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects.</a> Evolutio., & development. 1, 11-15 (1999).</li>
<li>Philip, B. N., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+knockdown+analysis+by+double-stranded+RNA+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene knockdown analysis by double-stranded RNA injection.</a> Methods Mol Biol. 772, 471-497 (2011).</li>
<li>Clark-Hachtel, C. M., Linz, D. M., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+insect+wing+origin+provided+by+functional+analysis+of+vestigial+in+the+red+flour+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Tribolium+castaneum%2C+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Insights into insect wing origin provided by functional analysis of vestigial in the red flour beetle.</a> Tribolium castaneum, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 16951-16956 (2013).</li>
<li>Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+phenotypes+are+influenced+by+the+genetic+background+of+the+injected+strain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain.</a> BMC genomics. 14, 5(2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular cell. 6, 1077-1087 (2000).</li>
<li>Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+WM+%22Systemic+RNAi+in+C+elegans+requires+the+putative+transmembrane+protein+SID-1%22">Systemic RNAi in C elegans requires the putative transmembrane protein SID-1</a>. 295, Science. New York, NY. 2456-2459 (2002).</li>
<li>Tomoyasu, Y., Wheeler, S. R., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrabithorax+is+required+for+membranous+wing+identity+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrabithorax is required for membranous wing identity in the beetle Tribolium castaneum.</a> Nature. 433, 643-647 (2005).</li>
<li>Trauner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+insertional+mutagenesis+of+a+coleopteran+stored+grain+pest%2C+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%2C+identifies+embryonic+lethal+mutations+and+enhancer+traps%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps.</a> BMC Biol. 7, 73 (2009).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Drosophila+retinal+determination+gene+network+in+Tribolium+%28II%29+The+Pax6+genes+eyeless+and+twin+of+eyeless%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (II) The Pax6 genes eyeless and twin of eyeless.</a> Developmental biology. 333, 215-227 (2009).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">E-RNAi a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, 332-339 (2010).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

<html> ישנן מספר הסוגיות החשובות שצריכים להילקח בחשבון על מנת להבטיח את ההצלחה של RNAi, כולל האורך והריכוז של מולקולות dsRNA, תחרות בין מולקולות dsRNA שונות (בעת ניסיון מרובה להפיל), וכן את האפשרות של Off-יעד אפקטים (OTE). אורך dsRNA האורך של מולקולות dsRNA משפיע על היעילות של תגובת RNAi המערכתית, עם dsRNA יותר להיות יעיל יותר כדי לעורר RNAi 7,14,15 (אם כי הגבול הארוך של dsRNA אינו ידוע כרגע). אורך dsRNA צריך להיות ארוך יותר מ50 נ&quot;ב לגרום RNAi היעיל בט castaneum 7. dsRNA בין 150 נ&quot;ב ו500 נ&quot;ב נראה אידיאלי עבור ניסויי RNAi. גם למרות שניתן להשתמש במולקולות dsRNA יותר, תהיה להם סיכוי מוגבר של OTE וצעד שיבוט הגנים יהפוך קשה יותר ויותר. ריכוז dsRNA ve_content &quot;&gt; דרגות שונות של מציאה גן ניתן להשיג בהתאם לריכוז של dsRNA. 1 מיקרוגרם / μl מופיע להיות ריכוז התחלה סביר, אשר לעתים קרובות מייצר פנוטיפ כמעט ריק (עשוי להשתנות תלוי בגן (ים) של עניין ). ניתן לבצע RNAi עם ריכוז גבוה יותר (לדוגמא, 7-8 מיקרוגרם / μl) כדי לקבל פנוטיפ חזק RNAi. RNAi עם דילול סדרתי של dsRNA לפעמים יכול להיות מועיל כדי לייצר סדרה של פנוטיפים hypomorphic (משלימה נתונים של Tomoyasu et al. 2009 8, ונתונים שלא פורסמו Borràs-Castells). RNAi תחרות מציאה גן מרובה יכולה להיות מושלמת בט castaneum על ידי הזרקה כמה מולקולות dsRNA שונות בו זמנית. עם זאת, הוא ידוע גם שיש כמה מולקולות dsRNA שונות קיימים בתוך האורגניזם לעתים קרובות תוצאות תחרות בין dsRNAs לגישה לרכיבי RNAi <sעד&gt; 7,14. חשוב להשתמש באותו אורך ואותו ריכוז לכל dsRNA כאשר מנסה מציאה גן רב כדי להימנע מאחד dsRNA מחוץ מתחרה האחרים (אם כי, התאמות נוספות של אורך dsRNA והריכוז עשויים להידרש כאשר רמות הביטוי שונות מאוד בין גני המטרה). אנחנו, כמו גם לאחרים, ביצענו בהצלחה מציאה כפולה ומשולשת (לדוגמא, Tomoyasu et al., 2005 16, Tomoyasu et al. 2009 17, ויאנג et al. 2009 18). למרות שאפשרי, RNAi המרובע (או יותר) יכול להיות מאתגר, כפי שהוא עלול לגרום לירידה משמעותית של יעילות RNAi לכל ארבעת גני המטרה. מיקוד-Off OTE הוא חשש מובנה לגישות מבוססות RNAi. אחת דרכים למזער OTE היא לזהות אזורים בגן המטרה שחולקים רצפים דומים עם גנים אחרים ולהימנע מאזורים אלה בעת תכנון dsRNA. ניתוח תפציץ פשוט נגד T. סט הגן חזה castaneum יכול לזהות אזורים כאלה. כמה כלים מקוונים מאפשרים גם הערכה של OTE הפוטנציאלי (למשל, E-RNAi 19). ביצוע RNAi לשני אזורים שאינם חופפים של גן המטרה הוא דרך קלה ויעילה כדי לשלול את האפשרות שנצפתה פנוטיפים נגרמים על ידי OTE. האפשרות של OTE ממוזערת אם RNAi לשני אזורים שאינם חופפים לייצר את אותו פנוטיפים (אלא אם כן שני אזורים שאינם חופפים לשתף רצף דומה). הערכת גן מציאה באמצעים אחרים מאשר פנוטיפי מנתח היא לעתים קרובות קריטית לנתונים הקשורים RNAi ביעילות נוכחי. שתי דרכים עיקריות להעריך מציאה גן הן qRT-PCR וניתוח כתם מערבי. qRT-PCR הוא דרך נוחה כדי למדוד את הרמה של mRNA היעד, ונעשה שימוש במחקרים הקשורים לRNAi רבים, כולל אלה בט castaneum (ראה אל מילר ואח. 2012 7 לדוגמא). Howevאה, יש לנקוט בזהירות, כפי שיש לנו לאחרונה ראו כמה מקרים שבי רמת mRNA היעד היא על ידי RNAi מוסדר עד (אם כי מוצר החלבון הוא למטה מוסדר) (נתונים שלא פורסמו Borràs-Castells). לא ידוע כרגע אם mRNA RNAi מושרה זה עד תקנה יכול להיות נפוץ או ייחודי לגנים מסוימים. ניתוח כתם מערבי הוא דרך נוספת כדי לאשר מציאה גן. שיטה זו היא די אמינה כפי שהוא מודד את כמות מוצר החלבון הסופי. הדרישה של נוגדן ספציפי נגד חלבון המוצר של גן המטרה היא חיסרון בגישה זו. ניצול מדידות עצמאיות רבות, בנוסף לניתוח פנוטיפי יגדיל את הביטחון של נתונים פנוטיפי המתקבלים על ידי ניתוח מבוסס RNAi. מאז ראשיתה בט castaneum, RNAi יש בעיקר נעשה שימוש כדי לחקור את תפקוד גן בפיתוח ויצירת תבנית. ט אלו מחקרים התפתחותיים castaneum היו מוצלחים ביותר בcharacterizing פונקציות אבולוציונית שימור והתפצלו של גנים (שנסקר בDenell 2008 1 וKlingler 2004 2). מחקרים עם זאת, מבוסס RNAi בט castaneum אינם מוגבל לביולוגיה התפתחותית. לדוגמא, יכול להיות מנוצל RNAi ללמוד תפקוד גן במגוון רחב של תגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות, כוללים סובלנות מתח, טריפה, תוקפנות, בחירת בן זוג, דפוסי פעילות, ומנגנוני הגנה. קושי אחד של יישום RNAi להקשרים אלה הוא את הסבירות לתופעות pleiotropic. לעתים קרובות, הגנים של עניין יהיו מגוון של תפקידים ברחבי ט מחזור החיים castaneum, ובכך להפוך את ההסרה של גנים ללא תופעות פנוטיפי לא מכוונות קשות. עם זאת, את היכולת לבצע בקלות RNAi במגוון רחב של שלבים לעתים קרובות יכולה להיות אסטרטגיה יעילה למניעת תופעות pleiotropic אלה. לדוגמא, ביצוע RNAi במבוגרים במקום זחלים או גלמים עשוי לאפשר לנו לעקוף uninנטה קטלני הנגרם על ידי מציאה גן במהלך ההתפתחות מוקדמת. הגמישות של תגובת RNAi בט castaneum כך הופך את המודל הזה לבחירה אטרקטיבית עבור התאמת RNAi לניסויים של תפקוד גן בתגובות פיסיולוגיות והתנהגותיות. ט מערכת castaneum היא גם אידיאלית לשימוש במעבדה הוראה. ט castaneum יכולה להיות בקלות בתרבית על קמח / תערובת שמרים בטמפרטורת חדר (C ° 25) ללא subculturing תכוף, וטכניקות RNAi בט castaneum פשוטים מספיק כדי להיות מותאמים למעבדה עם מדענים צעירים, לומדים. כRNAi הופך טכניקה חיונית במגוון רחב של תחומים ביולוגיים, זה קריטי, כי תלמידים נחשפים לטכניקה זו. הטבע ישר קדימה של טכניקת RNAi הזחל בט castaneum גם מעודד את תלמידים יותר להיות מעורבים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מועמד לכיתת אוריינטציה מערכת גנטית. &lt;/ P&gt;

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>. There was a typo in the settings for Sutter P-87 in step 4.1.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52059">Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum</a>.

Erratum: Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, הוא צוברת פופולרי בתחומים שונים של ביולוגיה נובעת בחלקו את הקלות של ביצוע התערבות RNA (RNAi) 1-3. טכניקות גן מציאה מבוססת RNAi לאפשר למדענים לבצע פסד של פונקצית ניתוחים ללא שימוש בשיטות גנטיות מורכבות. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב באמצעות הזרקה פשוטה של פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית 4-6. מציאה בו זמנית של מספר רב של גנים היא גם אפשרית בט castaneum על ידי הזרקת שתיים או יותר מולקולות dsRNA שונות באותו הזמן 7,8. בנוסף, סדרה של פנוטיפים hypomorphic יכולה להיות שנוצרה על ידי הפחתת הריכוז של הזריק dsRNA 8. תכונות אלו הופכות את החלופות אטרקטיביות טכניקות גנטיות הפוכים מבוסס RNAi לגנטיקה קדימה מסורתית בט castaneum. מאז כמעטכל ט רקמות castaneum רגישות למולקולות dsRNA תאיים 9, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים. בנוסף, למרות שדו&quot;ח זה מתמקד בביצוע RNAi בט castaneum, נהלים רבים המתוארים כאן חלים על חרקים אחרים. לכן, פרוטוקול זה שימושי למי שרוצה לבצע פסד של פונקצית הניתוח בהקשרי עניין שלהם בט castaneum, כמו גם עבור חוקרים המבקשים להחיל טכניקה מבוססת RNAi לחרקים אחרים. הזרקה לתוך dsRNA זחלים מאפשרת אנליזה פונקציונלית במגוון שלבי חיי חיפושית, כוללים זחל, הגולם, ומבוגר בשלבים 4,5,10. יש לנו שדווחו בעבר הפרוטוקול שלנו כולל זחל RNAi לרבות נהלי ביולוגיה מולקולרית 11. בדו&quot;ח הנוכחי, אנו מתמקדים הבמתארים את נהלי הזרקת dsRNA, אשר הסבירו הטובים ביותר עם עוזרים חזותיים. אנו מספקיםנהלים מפורטים צעד אחר צעד הזרקה, כמו גם דוגמאות הזרקה טובות ורעות. פרוטוקול חזותי זו משלים הפרוטוקול הקודם שלנו, וכאשר בשילוב, הם מספקים תמונה מקיפה יותר של נהלי RNAi זחל בט castaneum. בנוסף, אנו דנים פרמטרים למולקולות dsRNA שיכול להשפיע על ההצלחה של RNAi, יישום של מבחני מבוססי RNAi למחקר פיסיולוגי, כמו גם תחולתו של פרוטוקול RNAi זחל במעבדה הוראה.

<table><tbody><tr><td>קמח מלא אורגני&nbsp;</td><td>הרטלנד מיל בע"מ קנזס</td><td>G1</td><td></td></tr><tr><td>ברואר' s שמרים</td><td>MP Biomedicals</td><td>2903312</td><td>לנפות שמרים עם מסננת אל חלד #35 לפני השימוש. ללבוש מסכת מגן ולכסות את המסננת בניילון, מכיוון שהשמרים המנופים הם חלקיק דק ומפגע נשימתי.</td></tr><tr><td>6 גרם פלסטיק Drosophila בקבוקי מלאי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-888</td><td></td></tr><tr><td>מסננת</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>04-881N</td><td>8 אינץ' קוטר x 2 אינץ' השתמש #25 (פתיחה נומינלית 710 ומיקרו; m) לזחלים, גלמים ובוגרים.&nbsp;</td></tr><tr><td>מסננת</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>04 881 10P</td><td>8 אינץ' קוטר #35 (פתיחת סייב נומינלית: 600 ומיקרו; m)&nbsp; מסננות נירוסטה, 8 אינץ'. קוטר x 2 אינץ' מסננת זו אידיאלית להסרת גושים מאבקת שמרים.</td></tr><tr><td>מקלט מסננת</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>04-866B</td><td>8 אינץ' קוטר</td></tr><tr><td>1.5 ליטר זרבובית דגימה מחבת&nbsp;</td><td>סידבורו ציוד ושות'</td><td>דגם 33</td><td>מחבת איסוף</td></tr><tr><td>חממה</td><td>BioCold Environmental Inc</td><td>BC26-IN</td><td>שמור על זה 30 מעלות; C עם 70% לחות.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>S374500</tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>צבע מאכל&nbsp;</td>שקופית זכוכית מיקרוסקופ <td>ירוקה, כחולה או אדומה עדיפה</td>של <td>קרוגר</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Tack-It Over& מעל</td><td>הדבק הניתן למיקום מחדש של</td><td></td> Aleene <td>לשקופיות דביקות. סרט דו צדדי יכול לשמש כחלופה, אולם מצאנו כי ההדבקה משתנה.</td></tr><tr><td>מארז תקליטורים מפלסטיק</td><td>אמזון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסליקט</td><td>מכשיר סאטר</td><td>BF100-50-15</td><td>OD 1 מ"מ, תעודת זהות 0.5 מ"מ, 15 ס"מ. ללא נימה</td></tr><tr><td>מושך מחט</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-87 או P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שפכטל הרכבה נשלף&nbsp;</td><td>Loctite Fun-Tak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אבק גז דחוס</td><td>OfficeMax</td><td>OM96091</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כלי מדע עדין</td><td>11231-30</td><td>Dumoxel #3 (למניפולציה של חיפושיות)</td></tr><tr><td>כלי מדע עדין</td> <td>מלקחיים</td><td>11252-20</td><td>INOX #5 (לשבירת קצות מחטים)</td></tr><tr><td>אתיל אתר, נטול מים&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>רשת ניילון</td><td>Flystuff/Genessee Scientific</td><td>57-102</td><td>120 ומיקרו; m גודל נקבוביות/49% שטח פתוח</td></tr><tr><td>בקבוק מדיה, 100 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89000-926</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Discovery V12. מיקרוסקופ הזרקה.</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>פישר/צייס</td><td>12-070-513&nbsp;</td><td>סטמי2000. השתמש כדי לשבור את המחט ולהניח זחלים על המגלשה הדביקה.</td></tr><tr><td>שלב מכני X-Y&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>4354600000000000000</td><td></td></tr><tr><td>XY שלב מכני&nbsp;</td><td>Microscopenet.com</td><td>A512</td><td>מניפולטור אלטרנטיבי זול</td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Narishige</td><td>GJ-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק נימי זכוכית</td><td>Narishige</td><td>IM-H1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>30 מ"ל מזרק חד פעמי</td><td>BD</td><td>309650</td><td>BD Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td>Stopcock לארבעה כיוונים&nbsp;</td><td>קול-פארמר אינסטרומנט ושות'</td><td>EW-30600-03</td><td>Stopcocks עם חיבורי Luer; 4 כיוונים; מברשת צבע אמנותית להחליק זכר</td></tr><tr><td></td><td>Amazon</td><td>Art Advantage סט מברשות שמן ואקריליק, 24 חלקים</td><td>כל מברשת צבע כללית תעבוד.</td></tr></tbody></table>

התערבות rna הזחל בחיפושית האדומה הקמח, tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

החיפושית האדומה הקמח, castaneum Tribolium, מציעה רפרטואר של כלים ניסיוניים למחקרים גנטיים והתפתחותיים, כולל רצף מבואר באופן מלא הגנום, transgenesis מבוסס transposon, והתערבות יעילה RNA (RNAi). בין יתרונות אלה, טכניקות גן מציאה RNAi מבוססות נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. ט castaneum להראות תגובת RNAi מערכתית חזקה, כך שניתן לבצע RNAi בכל שלב חיים פשוט על ידי הזרקת פעמיים תקועים RNA (dsRNA) לתוך חלל הגוף של החיפושית. בדו&quot;ח זה, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בט castaneum. הפרוטוקול כולל בידוד (i) של השלב הנכון של ט זחלי castaneum להזרקה, (ii) הכנה להגדרת ההזרקה, וכן (iii) הזרקת dsRNA. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה שמספקת לנו גישה מהירה לphenotyp אובדן של הפונקציהes, כולל פנוטיפים מרובים גן מציאה, כמו גם סדרה של פנוטיפים hypomorphic. מאז כמעט כל ט רקמות castaneum רגישות לdsRNA תאי, טכניקת RNAi הזחל מאפשרת לחוקרים ללמוד מגוון רחב של רקמות בהקשרים מגוונים, כולל את הבסיס הגנטי של תגובות האורגניזם לסביבה החיצונית. בנוסף, הפשטות של טכניקה זו מעוררת יותר מעורבות סטודנטים במחקר, מה שהופך את ט castaneum מערכת גנטית אידיאלית לשימוש בסביבה בכיתה.

אחד הצעדים המרכזיים לזריקה מוצלחת הוא להפוך את מחט טובה. כפי שתואר בשלב 6, קצה המחט צריך להיות שבור לפני הזרקת ט castaneum. דוגמאות למחטים טובות ורעות מוצגות באיור 1. יש מחט טובה קצה חד ונוקשה, עם פתיחת קוטר כ 0.05 מ"מ (איור 1). איור 2 מציג את זריקה מוצלחת (2A דמויות ו2B), כמו גם כמה מקרים של זריקות לא מוצלחות (איורים 2C-2F). עם מחט זריקה בגודל כראוי, קצה המחט חודר את ציפורן הזחל עם התנגדות מינימאלית (איור 2 א), ופתרון dsRNA (הירוק) זורם לתוך הזחלים ללא כל דליפה (איור 2). אל, כפי שהוא יגרום יתר להזריק הצפה של פתרון dsRNA אפילו עם מחט זריקה בגודל כראוי (איור2C). אם קצה המחט דק מדי, קצה המחט לעתים קרובות לא מצליח לחדור לציפורן ועיקולי הזחל, מה שהופך את הזריקה הקשה (איור 2 ד). אם זה יקרה, זמירה קצה המחט לפעמים עוזר. מחטים גדולות יותר הן לעתים קרובות עדיין אפשריים לשימוש, אם כי בכמה קשיים בחדירה לציפורן הזחל (איור 2E). עם זאת, כמות גדולה של פתרון dsRNA נדחפה בקלות החוצה מהמחט אפילו עם לחץ קל על מזרק ההזרקה, לעתים קרובות וכתוצאה מכך גלישה של פתרון dsRNA (איור 2F). בעת ביצוע RNAi, זה חשוב שתהיה שליטה חיובית להעריך שRNAi פועל כראוי, וביקורת שלילית כדי לוודא שההשפעה שנצפתה היא לא השפעה הלא ספציפית של dsRNA או תוצאה של נהלי הזרקה (כגון פגיעה על ידי הזרקה, או חריגות מetherization). הזרקה של EYFP מיקוד dsRNA יכולה לשמש כטוב ביקורת חיובית בעת השימוש ב5,7 זן pu-11. כאשר EYFP dsRNA מוזרק בשלב הזחל האחרון, לירידה משמעותית באות EYFP בprimordia אגף העתיד ניתן לצפות כבר בהודעת יום זריקה אחת (איור 3 א). מציאה של EYFP הושלמה יומיים לאחר ההזרקה של EYFP dsRNA (איור 3 ב) ומציאה זו נמשכת דרך (3C הדמויות ו3D) שלב גלמים וכל אורך חיי החיפושית אם ריכוז dsRNA הוא גבוה מספיק (כגון 1 מיקרוגרם / μl) 7. גם EYFP dsRNA יכול לשמש כביקורת שלילית כפי שהוא רצף גן שאינו ממקור פנימי ולא צריך לגרום לשיבושים מורפולוגיים או פיסיולוגיים (ציורים A3-3D). אנחנו סיפקנו תמונות של RNAi זחל לשריד (טוב מאוד), גן אגף קריטי 12, כדוגמא נוספת לאופן EFfective טכניקת RNAi מבוסס הזרקה זה בט castaneum. כאשר dsRNA לVG מוזרק לתוך זחלי שלב הלפני אחרון (שלב אחד לפני שלב הזחל האחרון), אובדן של מבני האגף שלם ניתן לצפות בשלב גלמים (3E דמויות ו3F). מבוגרים וכתוצאה מכך גם חסרים לחלוטין מבני אגף (איורים 3G ו 3H). תוצאת RNAi לVG מדגימה הן את החוסן ואת האופי המערכתי של RNAi בט castaneum. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" width="500"> איור 1: דוגמאות (א) למחטים רצופים, טובות, ורעות (ב) קצה מחט טובה שבורה היטב (C) קצה מחט שבורה, כי הוא גדול ובוטה מדי (D) הקצה... של כל הקופה מחט n דקה מדי. ברים סולם (אדום) הם 0.05 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg" width="500"> איור 2:... () מחט זריקה בגודל כראוי מוכנסת לתוך זחל instar האחרון (B) זחל הזריק כראוי עם פתרון dsRNA הירוק (C) הצפה של פתרון dsRNA בנקודת ההזרקה נגרמת על ידי יתר ההזרקה (D ) מחט דקה שלא הצליחה לחדור לציפורן הזחל. (מחט זריקה גדולה מוכנסת לתוך זחל instar האחרון E). (F) זחל דקירה ממחט גדולה, וכתוצאה מכך הגלישה והדליפה של פתרון dsRNA. חצים מצביעים על המחטים."Target =" ove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig2highres.jpg _blank "&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" width="500"> איור 3: דוגמאות של RNAi המוצלח בט castaneum. הזרקת זחל האחרונה של תוצאות EYFP dsRNA בהפחתה של ביטוי EYFP (AD). גלמים () זחלי יום אחד לאחר הזרקה. (B) זחלי יומיים לאחר הזרקה. גלמים (C) בקרה. (ד ') כתוצאה מ הזרקת הזחל EYFP dsRNA. הבקרות השליליות הן הזרקת חיץ (A, B) והזרקת dsRed dsRNA (C, D). ראשי החץ וחצים מצביעים על ביטוי EYFP או היעדרה בprimordia הכנף ועיניים, בהתאמה. (EH) פןהאולטימטיבי זחל RNAi לVG. (E) גולם Wild-type. (F) VG גולם RNAi. חוסר מבני אגף הוא כבר נראה לעין בשלב גלמים (חץ). G) מבוגר Wild-type. (H) VG מבוגר RNAi. מבני אגף הקשורים חסרים לחלוטין (חץ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52059/52059fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

טכניקות גן מציאה מבוססות התערבות RNA (RNAi) נמצאות בליבה של מחקר Tribolium. כאן, אנו מספקים סקירה של טכניקת RNAi הזחל שלנו בcastaneum Tribolium. הזחל RNAi הוא טכניקה פשוטה, אך רבת עוצמה המספקת גישה מהירה לפנוטיפים פסד של פונקציה, המאפשר לחוקרים ללמוד פונקציות גן בהקשרים מגוונים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח, Tribolium castaneum

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיל גן מעניין באמצעות הפרעות RNA בחיפושית הפרח האדום trium cadium על ידי הזרקת תמיסת RNA דו-גדילית לחלל גוף הזחל. זה מושג על ידי בידוד השלב הנכון של הזחלים מהתרבית על ידי ניפוי פרח התרבות והפרדת הזחלים משלבים אחרים של חיפושיות על מחבת זרעים. השלב השני הוא הכנת מחט הזרקה על ידי שבירת קצה המחט, הנחתה על מחזיק מחט וטעינה קדמית, תמיסת RNA כפולה בריכוז הרצוי לתוך המחט.לאחר מכן, אשרו את הזחלים המבודדים והניחו את הזחלים על מגלשת זכוכית דביקה. השלב האחרון הוא להזריק לזחלים תמיסת RNA דו-גדילית תחת מיקרוסקופ מנתח. בסופו של דבר, פנוטיפים הקשורים ל-RNAi בשלב הרצוי מנותחים כדי לקבוע את תפקוד הגן הממוקד.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון נוירוגנזה או טרנסגנזה, הוא שרק הזרקה פשוטה של תמיסת RNA כפולה לחלל הגוף של החיפושיות יכולה לגרום להפלת גנים יעילה וארוכת טווח בכל שלב רצוי של התפתחות הבדו. למרות שהפרוטוקול המתואר כאן יתמקד בזחלי טריום קסטין עם שינוי מסוים, ניתן ליישם את הליכי ההזרקה על שלבים אחרים של טריום, קסטין וחרקים אחרים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו להכין מחט טובה ולהזריק את הכמות המתאימה של תמיסת RNA כפולה מבלי להרוג את הזחלים.הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית מכיוון שקשה לתאר את שלבי הזרקת ה-RNA והכנת המחט וניתן ללמוד אותם רק באמצעות תצפית ותרגול תרבות. התה יצק זן לבחירה כמפורט בפרוטוקול הטקסט הנלווה. רוקנו מיד בקבוק תרבית אחד של החיפושיות על מסננת מספר 25 ונפו באגרסיביות כדי לאסוף את הזחלים, הגולמים והבוגרים המבוגרים יותר.לאחר מכן העבירו את החיפושיות יחד עם היציאה לתבנית זרעים כדי למנוע מהחיפושיות לברוח. כעת, נשפו בעדינות מעל תבנית הזרעים כדי להסיר את האקסוס וחלקיקי הפרחים מפני השטח של החיפושיות. הקש על תבנית הזרעים כדי להתייצב.התוכן. המתן עד שהמבוגרים הניידים יותר ייצאו מהערימה והוציאו אותם כדי להפריד את זווית הגורם, המחבת מעט כלפי מטה. דופקים בעדינות כדי לגלגל ולהסיר את הגור, ומשאירים רק את הזחלים על תבנית הזרעים.כעת מניחים את הזחלים המבודדים בצלחת פטרי נקייה. בחר את שלב הזחל הרצוי להזרקה במיקרוסקופ, ושמור אותם בצלחת פטרי עד לאישור. שלב את שאר השלבים של החיפושיות והחזיר אותם לבקבוק תרבות.חבר מחט זכוכית משוכה למיקרוסקופ זכוכית. החלק מתחת למיקרוסקופ מנתח. אתר היכן הקצה מתכופף.תפוס את האזור מעט לכיוון צד הקצה וסובב כדי לשבור לחדירה אופטימלית של ציפורן הזחל, בחר מחט עם פתח זוויתי בקוטר של כ-0.05 מילימטרים. כעת פתח את קצה מחזיק המחט. הנח את הקצה האחורי של המחט לתוך קצה המחזיק ואת אטם הגומי מתחת לקצה המחזיק.לאחר מכן הכנס את החלק האחורי של המחט למחזיק, וודא שאטם הגומי מוכנס לפתח. הברג את הקצה בחזרה על המחזיק. כעת הנח את מחזיק המחט המורכב על מניפולטור המחט.התאם את המיקום כך שקצה המחט יהיה מרוכז מתחת לשדה הראייה של המיקרוסקופ. הכן את תמיסת ה-RNA הדו-גדילי ממש לפני ההזרקה. חותכים את קצה הפיפטה החד פעמית של 20 מיקרוליטר.כעת פיפטה 10 מיקרוליטר מהתמיסה לקצה הפיפטה הגזום. הסר בזהירות את קצה הפיפטה מהפיפטה תוך שמירה על הנוזל בקצה על ידי מתן לחץ אחורי. הנח את קצה הפיפטה עם תמיסת ה-RNA הכפולה על שלב המיקרוסקופ.בהסתכלות דרך המיקרוסקופ הזיזו לאט את הקצה הטעון לכיוון המחט עד שקצה המחט נמצא ממש בתוך קצה הפיפטה הטעונה ולתוך התמיסה. לאחר מכן משוך בעדינות לאחור את הבוכנה של מזרק ההזרקה כדי למשוך לאט את התמיסה לתוך המחט מבלי להעמיס על המחט. כאשר קצה תמיסת ה-DS RNA מתקרב לקצה המחט, האט את קצב המשיכה והפסק להעמיס את התמיסה לפני שקצה המחט יגיע לאוויר כדי למנוע קליטה מהירה לתוך מחזיק המחט.פתח את זין העצירה כדי להסיר את הלחץ ממזרק ההזרקה ומחזיק המחט. לאחר מכן הרחק את קצה הפיפטה מקצה המחט. כעת הרם את המחט במעלה הבמה והסר את קצה הפיפטה המרוקן משלב המיקרוסקופ.הנח את הזחלים בסל ההרשאה האלקטרוני ולאחר מכן הנח את הסל בבקבוק האתר וסגור את המכסה. לאחר שלוש דקות, בדוק את תנועת הזחלים. אם הם עדיין בתנועה, החזירו אותם לבקבוק האתר למשך 30 שניות נוספות.העבירו את הזחלים המורשים E מהסל לקצה הנון-סטיק של מגלשת זכוכית דביקה. העבירו את הזחלים ברצף לשקופית. הניחו כל אחד לרוחב.הקש בעדינות על הגוף מהראש ועד הזנב בעזרת מלקחיים ומתח אותו מעט כדי לאבטח את הזחלים על המגלשה. כעת מקם את השקופית המוכנה על במת המיקרוסקופ. הכנס בעדינות את המחט העמוסה ב-RNA דו-גדילי לצד הגבי של הזחלים, והשתמש ב-Stage כדי להעביר את הזחלים למחט.לאחר מכן משוך את המחט מעט לאחור עבור ה-DS RNA. כדי להיכנס לחלל גוף הזחל, לחץ בעדינות על מזרק ההזרקה עד שהזחלים הופכים לירוקים ונראים מתוחים ומלאים. לאחר מכן, הסר את המחט מהזחלים תוך משיכה קלה לאחור של מזרק ההזרקה.הזרקו את כל הזחלים בשקופית. הקפד להסיר זחלים שלא הוזרקו בהצלחה. הניחו את הזחלים המוזרקים בצד עד שכל הזחלים יתאוששו מאישור E.כעת הרם בעדינות את הזחלים מכף רגל ועד ראש, העביר לצלחת פטרי נקייה והשאיר אותם לפחות 10 דקות כדי לאפשר לפצע ההזרקה להיקרש. לאחר מכן, הזחלים המוזרקים ב-30 מעלות צלזיוס עם 70% לחות. התבונן בזחלים עבור פנוטיפים של RNAI באופן קבוע.דוגמאות אלה מראות רמות הצלחה משתנות של הזרקות עם תמיסת RNA דו-גדילית ירוקה לזחל הכוכב האחרון עם מחט הזרקה בגודל מתאים. קצה המחט חודר לקוטיקולה של הזחל בהתנגדות מינימלית, ותמיסת ה-DS RNA הירוקה זורמת לזחלים ללא כל דליפה. בזן PU 11, החלבון הפלואורסצנטי הצהוב המשופר יכול לשמש כבקרה חיובית טובה לניסויי הזרקת RNA דו-גדיליים.כאשר EYFP DS RNA מוזרק בשלב הזחל האחרון, ניתן להבחין בהפחתה משמעותית באות EYFP בכנף הקדמונית העתידית כבר יום אחד לאחר ההזרקה. בדרך כלל ניתן להבחין בביטול ביטוי EYFP יומיים לאחר ההזרקה, ואם ריכוז ה-DS RNA גבוה מספיק הוא יימשך לאורך כל שלב האישון ולאורך כל חיי החיפושית. מכיוון ש-EYFP הוא רצף גנים לא אנדוגני, גן זה יכול לשמש גם כבקרה שלילית שאינה אמורה לגרום להפרעות מורפולוגיות או פיזיולוגיות.בניסוי זה, ה-RNA הדו-גדילי עבור שריד, גן כנף קריטי הוזרק לזחלי השלב הלפני אחרון. שימו לב שניתן לראות אובדן מוחלט של מבני הכנפיים בשלב האישון. הבוגר שנוצר גם חסר לחלוטין מבני כנפיים.לאחר מאסטר, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך פחות משעתיים אם היא מבוצעת כראוי בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון PCR כמותי בזמן אמת באתר, הכלאה או אימונוהיסטוכימיה על מנת לענות על שאלות נוספות כמו אילו גנים מווסתים על ידי הגן הממוקד לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לבצע ניתוח אובדן תפקוד ושלבים פוסט-עובריים בטרום קסטן מבלי להשתמש בטכניקות גנטיקה מורכבות.האופי הפשוט של שיטה זו הופך אותה גם לרלוונטית מאוד למסגרת הוראה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחור את שלב האהבה המתאים להזרקה, כיצד להכין מחט הזרקה ולבצע הזרקה מותרת של RNA כפול סטנדרטי בהצלחה. פרוטוקול זה יאפשר לך להעריך את תפקוד הגן באמצעות רמה RNI ב-Trium.

larval-rna-interference-in-the-red-flour-beetle-tribolium-castaneum

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף...

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

סרטון זה מתאר את העקרונות מאחורי הטיפול ב-RNAi ב-C. elegans ומדגים פרוטוקול להשמדת lin-35 בזן תולעים מהונדס.

ציפוי RNAi עבור C. elegans Feeding: טכניקה להשראת ביטוי dsRNA מטרה ב- E. coli

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ"א סתר החיפושית, Dermestes maculatus

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר

הפרעות RNA היא טכניקה ישימה ורבת עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בשלבים התפתחותיים ספציפיים. כאן, אנו מתארים את הצעדים הדרושים ליישום טכניקה זו חיפושית הצלילה הימית תרמונקטוס מרמורטוס, מרכישת רצפי גנים ועד לחיסול גנים המשפיעים על מבנה או התנהגות.

הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

אנו מספקים פרוטוקול מפורט להפרעת רנ"א מתווכת אלקטרופורציה בחרקים מסדר אודונטה (שפיריות וסכרים) באמצעות הסכר הכחול זנב (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) ואתשפירית הרחפן pied (פסאודותמיס זונאטה: Libellulidae: אניסופטרה).

שיטת הפרעות RNA בתתיווך אלקטרופולציה באודונה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער ודרך חלופית להעריך את פעילותן האנטומופתוגנית באמצעות חרק מודל קולאופטרן. שיטה זו יעילה ונוחה לחקר משאבים פטרייתיים אנטומופתוגניים ממזיקים חרקים משעממי עץ ביערות טבעיים.

בידוד, זיהוי התנהגותי והערכת פתוגניות של פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער

המניפולציה של הפרעות RNA (RNAi) מהווה אתגר עצום במינים רבים של טפילים בעלי גודל זעיר, כגון צרעות טריכוגרמה . מחקר זה התווה שיטת RNAi יעילה ב - Trichogramma denrolimi. המתודולוגיה הנוכחית מספקת מודל חזק לחקר בקרת גנים בצרעות טריכוגרמה .

הפרעות RNA בפרזיטואיד ביצה, Trichogramma dendrolimi Matsumura

המאמצים לבודד את למקטע הקטליטית של telomerase, טרט, בכמויות מספיקות ללימודי מבניים, כבר נפגש עם הצלחה מוגבלת במשך יותר מעשור. כאן, אנו מציגים שיטות הבידוד של רקומביננטי Tribolium castaneum טרט...

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

למדו את שיטת ה-RNAi בזחלים של חיפושית הקמח האדומה Tribolium castaneum להשתקת גנים וחקר תפקודם. שיטה זו מאפשרת ניתוח פנוטיפים מהיר בביולוגיה התפתחותית של חרקים.

התערבות RNA הזחל בחיפושית האדומה הקמח, Tribolium castaneum

גלה סרטונים נוספים