מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה
November 8th, 2014
דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע סריקה כימית בעוברי דגי זברה באמצעות עיבוד דגימה ידני. זה מושג על ידי הכנסת דגי זברה בוגרים לתאי הזדווגות עם מחיצה למשך הלילה, ולאחר מכן הסרת המחלק למחרת בבוקר כדי לאסוף עוברים. לאחר מכן, קבוצות של עוברי דג הזברה מסודרות ב-96 צלחות באר, ולאחר מכן מטופלות בתרופה בשלב ההתפתחותי הרצוי.
לאחר מכן מותר לעוברים להתפתח קבוע עם 4% פרלדהיד ובדיקה כדי לאמוד את ההשפעות של מולקולות קטנות על תהליך ההתפתחות המעניין. התוצאות מראות שינויים התפתחותיים כגון רווח או אובדן של תחומי ביטוי גנים שיכולים להצביע על שינויים בסולפט או במורפוגנזה של רקמות שנגרמו על ידי המולקולות הקטנות שנחקרו. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול הקליני במגוון מחלות בגלל היכולת לזהות תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.
בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להתקשות מכיוון שהם צריכים לרכוש את המיומנות הדרושה לעבודה עם עוברים, כגון העברתם בין צלחות מרובות בארות ללא נזק. נדגים את ההליך אני ואריק דונהיו, חוקר לתואר ראשון במעבדה להקמת הזדווגות של דגי זברה. השתמש בתאי הזדווגות עם חוצצים הניח דגי זברה זכרים בוגרים בצד אחד של המפריד ודגי זברה נקבות בוגרים בצד השני.
על כל צלחת של 96 בארות של מולקולות קטנות שיש לבדוק. הקימו 25 מיכלי הזדווגות והשאירו אותם למשך הלילה. למחרת, הסר את התא המפריד בין כל זוג דגים ולאחר שעה, השתמש במסננת רשת דקה כדי לאסוף עוברים לפני הנחתם בצלחות פטרי המכילות E שלוש מדיום עם פיפטת העברה.
הסר פסולת מהצלחות ומתחת לסטריאוסקופ. התבונן בכל מצמד של עוברים והסר ביציות לא מופרות. רוקנים את ה-E שלוש בינוני ומחליפים ב-E שלוש טרי.
לאחר מכן מניחים כל צלחת עוברים באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. בדוק שוב את הצלחות והשליך ביצים לא מופרות נוספות. המשך לדגור על העוברים עד לשלב 40%eely.
הסר את לוחית הספרייה הכימית ממינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות אותו ולאפשר לו להפשיר בטמפרטורת החדר בעזרת פיפטה בעלת שמונה ערוצים. הוסף 99 מיקרוליטר של E שלוש לעמודות שתיים ל-12 של צלחת של 96 בארות.
לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של התרכובות המתאימות לבארות בעמודות 2 עד 11 כאן, המיועדות כדגימות הניסוי פיפטה מיקרוליטר אחד של DMSO לעמודת הבקרה כאן המיועדת להיות עמודה 12. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את צלחת הדילול ולהחזיר את ספריית הכימיקלים למקפיא. לאחר מכן, לאחר בחירת צלחת פטרי המכילה עוברים בשלב 40% אפי, השתמש בפיפטה העברה כדי למקם בזהירות כ-10 עוברים לבאר בעמודות שתיים עד 12 מתוך 96.
ובכן צלחת. השתמש בפיפטה להעברת זכוכית כדי להסיר עודפי E שלוש מכל באר ולהוציא למיכל פסולת נוזלית. כדי לטפל כימית בעוברים, העבירו 100 מיקרוליטר מכל דילול כימי מצלחת 96 הבאר לבאר העוברים המתאימה כדי ליצור תא לח עם מגבת נייר ולהניח אותו במיכל רגיש לאור.
גדול מספיק כדי להכיל צלחת 96 באר. לאחר מכן השתמש במחצלת תקרה כדי לאטום את הצלחת. הנח אותו במיכל הרגיש לאור ודגר אותו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.
כדי להסיר את הכימיקלים, הוסף 300 מיקרוליטר של E שלוש לכל שורה של בארות שטופלו בתרופות. לאחר מכן משוך את המדיום לפני השימוש ב-E שלוש כדי לשטוף את העוברים שלוש פעמים כדי לתקן עוברים, להעביר אותם לארבע צלחות מסומנות של 24 בארות ומניח את הפיפטה מול רקע כהה. לאחר כל העברת באר כדי לזהות עוברים שנותרו בפיפטה וכדי למנוע הצלבה, הסר את כל העוברים המתים.
משוך את ה-E 3 כך שהעוברים בקושי שקועים בנוזל. לאחר מכן השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להוסיף שתי טיפות של 50 מיליגרם למיליליטר פרונאז לכל אחת. ובכן דגרו על העוברים במשך חמש דקות לפני שתערבבו את הבארות כדי לגרום לקוריאן להתפרק.
לאחר שימוש ב-E שלוש כדי לשטוף את העוברים פעמיים, משוך והשליך את ה-E שלוש הנותר. הוסיפו 4% P-F-A-P-B-S לכל באר ודגרו על העוברים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן בצע מסך מעניין כגון הכלאה של חור באתר, או מבקש כמתואר בפרוטוקול הטקסט לדרג את העוברים מהמסך הכימי.
העבירו אותם ל-12 לוחות באר מסומנים לפני השימוש במיקרוסקופ סטריאו כדי להתבונן בהם כמתואר בתרשים זה. זה מעשי עבור אדם בודד לבצע בדיקה גנטית כימית על כ-600 תרכובות במהלך תשעה שבועות של מאמץ ייעודי, וניתן לקצר את הזמן הזה לשלושה שבועות אם מבוצע על ידי שלושה אנשים. לפיכך, זמן הספסל של אדם אחד או כמה אנשים יכול לעקוף את הצורך בציוד הדורש משאבים גבוהים כמו מערכות אוטומטיות.
כפי שמוצג כאן, עוברי דגי זברה נחשפו לתרכובות בודדות מספרייה ביו-אקטיבית מ-50% מהאנשים ל-24 HPF, ולאחר מכן נבדקו על ידי משאלה, תוך שימוש בקוקטייל של שלוש בדיקות ריבו כדי לזהות מקטעי נפרון. כדוגמה, מערכת דירוג, תרכובת שהביאה לצינורית מפותלת פרוקסימלית מוגדלת באופן דרמטי או PCT תסווג כמחלקה אחת, המייצגת את המחלקה הקשורה לפגם החמור ביותר ורמת הביטחון הגבוהה ביותר בפנוטיפ שנצפה. לאחר מכן התרכובת תסומן כ-PCT מסוג 1.
בנוסף, סיווג זה מספק דרך פשוטה ומהירה לתאר מולקולה קטנה מעניינת, כולל חומרת השפעתה על האורגניזם, האזור המושפע מהתרופה והאופן שבו האזור מושפע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשלב את העוברים שלך בנקודת הזמן ההתפתחותית הנכונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקה כימית ידנית עם עוברי דג הזברה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע סינון כימי ידני בתפוקה גבוהה בעובר דג הזברה, תוך שימוש בהכלאה סיטואה בכל הגוף (WISH) לניתוח. דג הזברה משמש כמודל חשוב לחקר התפתחות חיות חוליות ומחלות אנושיות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה התפתחותית
- פרמקולוגיה
רקע
- דגי זברה נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית בשל העובריות השקופות שלהם.
- סינון בתפוקה גבוהה מאפשר הערכה יעילה של תרכובות רבות.
- הכלאה סיטואה בכל הגוף היא טכניקה המשמשת לדמיית ביטוי גנים.
- מחקר זה נועד לזהות מולקולות קטנות המשפיעות על תהליכים התפתחותיים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה ידנית לסינון כימי בעובר דג זברה.
- להעריך את ההשפעות של מולקולות קטנות על ביטוי גנים ומורפוגנזה של רקמות.
- לספק פרוטוקול שניתן לנצל על ידי חוקרים חדשים בטכניקה זו.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הקמת תאי הזדווגות לדג זברה כדי לאסוף עוברים.
- סידור עוברים לצלחות 96 באר לטיפול תרופתי.
- שימוש בהכלאה סיטואה בכל הגוף כדי להעריך שינויים בביטוי גנים.
- סיווג תרכובות על פי השפעותיהן על פנוטיפים התפתחותיים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי שינויים התפתחותיים בעובר דג זברה כתוצאה מטיפולים כימיים.
- סיווג תרכובות על פי חומרת הפגמים שנצפו.
- הוכחת היתכנות של סינון ידני לעד 600 תרכובות.
- השלכות פוטנציאליות לזיהוי תרכובות טיפוליות.
מסקנות
- שיטת הסינון הכימי הידנית יעילה לחקר תהליכים התפתחותיים.
- גישה זו יכולה להקל על גילוי תרכובות עם פוטנציאל טיפולי.
- בימוי נכון של העוברים הוא קריטי לתוצאות מדויקות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Manual high-throughput small molecule screening in zebrafish embryos enables early-stage target validation and phenotypic assessment without the need for automated platforms. This approach supports rapid hypothesis testing and functional de-risking in discovery biology, making it accessible for diverse R&D teams. The method provides a scalable entry point for identifying compounds with developmental or disease-modifying effects, directly informing portfolio triage and lead prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a whole-organism vertebrate context.
- Supports functional target validation by visualizing gene expression and tissue morphogenesis changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of compound-induced phenotypes.
- Provides actionable data for predictive confidence in early-stage compound selection.
Screening & Assay Development
- Prepares validated zebrafish embryo systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative outputs via standardized WISH-based readouts.
- Enables scalable screening of up to hundreds of compounds with minimal infrastructure.
- Supports reliable evaluation of compound effects on developmental processes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic screening with disease-relevant developmental pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by linking gene expression changes to organismal outcomes.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on observed severity and specificity of phenotypes.
- Offers predictive de-risking for translational biomarker identification when supported by gene expression data.
Pipeline & Workflow Integration
This manual screening protocol bridges early discovery and lead identification by enabling functional assessment of small molecules in a vertebrate model. It integrates with workflows requiring hypothesis testing, phenotypic screening, and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of compound effects on developmental pathways and gene expression.
- Screening: Provides assay-ready zebrafish embryos and standardized WISH outputs for reproducible screening.
- Analytics: Enables classification and quantitative scoring of phenotypic outcomes for comparative analysis.
- Translational Research: Connects early phenotypic findings to disease models and potential biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for ongoing compound library evaluation and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage screening.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible results without reliance on high-cost automation.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of promising compounds.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in zebrafish embryo handling and WISH analysis.
- Needs basic laboratory infrastructure, including multi-well plates, pipettes, and stereomicroscopy.
- Demands cross-team standardization for staging, scoring, and data annotation.
- Adaptable to various developmental stages and gene targets within zebrafish models.
- Manual throughput is limited by personnel availability and dexterity with embryo manipulation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Preparation of Zebrafish Mating Chambers and Collection of Embryos
2:41
Arraying and Chemically Treating Zebrafish Embryos
4:34
Embryo Fixation and Chemical Screening
5:52
Results: Zebrafish Embryonic High-throughput Chemical Screen
7:17
Conclusion
