מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה
8 בנובמבר 2014
דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע סריקה כימית בעוברי דגי זברה באמצעות עיבוד דגימה ידני. זה מושג על ידי הכנסת דגי זברה בוגרים לתאי הזדווגות עם מחיצה למשך הלילה, ולאחר מכן הסרת המחלק למחרת בבוקר כדי לאסוף עוברים. לאחר מכן, קבוצות של עוברי דג הזברה מסודרות ב-96 צלחות באר, ולאחר מכן מטופלות בתרופה בשלב ההתפתחותי הרצוי.
לאחר מכן מותר לעוברים להתפתח קבוע עם 4% פרלדהיד ובדיקה כדי לאמוד את ההשפעות של מולקולות קטנות על תהליך ההתפתחות המעניין. התוצאות מראות שינויים התפתחותיים כגון רווח או אובדן של תחומי ביטוי גנים שיכולים להצביע על שינויים בסולפט או במורפוגנזה של רקמות שנגרמו על ידי המולקולות הקטנות שנחקרו. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול הקליני במגוון מחלות בגלל היכולת לזהות תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.
בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להתקשות מכיוון שהם צריכים לרכוש את המיומנות הדרושה לעבודה עם עוברים, כגון העברתם בין צלחות מרובות בארות ללא נזק. נדגים את ההליך אני ואריק דונהיו, חוקר לתואר ראשון במעבדה להקמת הזדווגות של דגי זברה. השתמש בתאי הזדווגות עם חוצצים הניח דגי זברה זכרים בוגרים בצד אחד של המפריד ודגי זברה נקבות בוגרים בצד השני.
על כל צלחת של 96 בארות של מולקולות קטנות שיש לבדוק. הקימו 25 מיכלי הזדווגות והשאירו אותם למשך הלילה. למחרת, הסר את התא המפריד בין כל זוג דגים ולאחר שעה, השתמש במסננת רשת דקה כדי לאסוף עוברים לפני הנחתם בצלחות פטרי המכילות E שלוש מדיום עם פיפטת העברה.
הסר פסולת מהצלחות ומתחת לסטריאוסקופ. התבונן בכל מצמד של עוברים והסר ביציות לא מופרות. רוקנים את ה-E שלוש בינוני ומחליפים ב-E שלוש טרי.
לאחר מכן מניחים כל צלחת עוברים באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. בדוק שוב את הצלחות והשליך ביצים לא מופרות נוספות. המשך לדגור על העוברים עד לשלב 40%eely.
הסר את לוחית הספרייה הכימית ממינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות אותו ולאפשר לו להפשיר בטמפרטורת החדר בעזרת פיפטה בעלת שמונה ערוצים. הוסף 99 מיקרוליטר של E שלוש לעמודות שתיים ל-12 של צלחת של 96 בארות.
לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של התרכובות המתאימות לבארות בעמודות 2 עד 11 כאן, המיועדות כדגימות הניסוי פיפטה מיקרוליטר אחד של DMSO לעמודת הבקרה כאן המיועדת להיות עמודה 12. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את צלחת הדילול ולהחזיר את ספריית הכימיקלים למקפיא. לאחר מכן, לאחר בחירת צלחת פטרי המכילה עוברים בשלב 40% אפי, השתמש בפיפטה העברה כדי למקם בזהירות כ-10 עוברים לבאר בעמודות שתיים עד 12 מתוך 96.
ובכן צלחת. השתמש בפיפטה להעברת זכוכית כדי להסיר עודפי E שלוש מכל באר ולהוציא למיכל פסולת נוזלית. כדי לטפל כימית בעוברים, העבירו 100 מיקרוליטר מכל דילול כימי מצלחת 96 הבאר לבאר העוברים המתאימה כדי ליצור תא לח עם מגבת נייר ולהניח אותו במיכל רגיש לאור.
גדול מספיק כדי להכיל צלחת 96 באר. לאחר מכן השתמש במחצלת תקרה כדי לאטום את הצלחת. הנח אותו במיכל הרגיש לאור ודגר אותו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.
כדי להסיר את הכימיקלים, הוסף 300 מיקרוליטר של E שלוש לכל שורה של בארות שטופלו בתרופות. לאחר מכן משוך את המדיום לפני השימוש ב-E שלוש כדי לשטוף את העוברים שלוש פעמים כדי לתקן עוברים, להעביר אותם לארבע צלחות מסומנות של 24 בארות ומניח את הפיפטה מול רקע כהה. לאחר כל העברת באר כדי לזהות עוברים שנותרו בפיפטה וכדי למנוע הצלבה, הסר את כל העוברים המתים.
משוך את ה-E 3 כך שהעוברים בקושי שקועים בנוזל. לאחר מכן השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להוסיף שתי טיפות של 50 מיליגרם למיליליטר פרונאז לכל אחת. ובכן דגרו על העוברים במשך חמש דקות לפני שתערבבו את הבארות כדי לגרום לקוריאן להתפרק.
לאחר שימוש ב-E שלוש כדי לשטוף את העוברים פעמיים, משוך והשליך את ה-E שלוש הנותר. הוסיפו 4% P-F-A-P-B-S לכל באר ודגרו על העוברים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן בצע מסך מעניין כגון הכלאה של חור באתר, או מבקש כמתואר בפרוטוקול הטקסט לדרג את העוברים מהמסך הכימי.
העבירו אותם ל-12 לוחות באר מסומנים לפני השימוש במיקרוסקופ סטריאו כדי להתבונן בהם כמתואר בתרשים זה. זה מעשי עבור אדם בודד לבצע בדיקה גנטית כימית על כ-600 תרכובות במהלך תשעה שבועות של מאמץ ייעודי, וניתן לקצר את הזמן הזה לשלושה שבועות אם מבוצע על ידי שלושה אנשים. לפיכך, זמן הספסל של אדם אחד או כמה אנשים יכול לעקוף את הצורך בציוד הדורש משאבים גבוהים כמו מערכות אוטומטיות.
כפי שמוצג כאן, עוברי דגי זברה נחשפו לתרכובות בודדות מספרייה ביו-אקטיבית מ-50% מהאנשים ל-24 HPF, ולאחר מכן נבדקו על ידי משאלה, תוך שימוש בקוקטייל של שלוש בדיקות ריבו כדי לזהות מקטעי נפרון. כדוגמה, מערכת דירוג, תרכובת שהביאה לצינורית מפותלת פרוקסימלית מוגדלת באופן דרמטי או PCT תסווג כמחלקה אחת, המייצגת את המחלקה הקשורה לפגם החמור ביותר ורמת הביטחון הגבוהה ביותר בפנוטיפ שנצפה. לאחר מכן התרכובת תסומן כ-PCT מסוג 1.
בנוסף, סיווג זה מספק דרך פשוטה ומהירה לתאר מולקולה קטנה מעניינת, כולל חומרת השפעתה על האורגניזם, האזור המושפע מהתרופה והאופן שבו האזור מושפע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשלב את העוברים שלך בנקודת הזמן ההתפתחותית הנכונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקה כימית ידנית עם עוברי דג הזברה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע סריקה כימית ידנית בתפוקה גבוהה בעוברי דג הזברה, תוך שימוש בהיברידיזציה באתר (WISH) של דגימה שלמה לאנליזה. דג הזברה משמש כמודל בעל ערך לחקר התפתחות חולייתנים ומחלות אנוש.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- פרמקולוגיה
רקע
- דגי זברה נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית בשל העובריים השקופים שלהם.
- סריקה בשקיפות גבוהה מאפשרת הערכה יעילה של תרכובות רבות.
- הibridiזציה in situ של דגימה שלמה (Whole-mount) היא טכניקה המשמשת להדמיית ביטוי גנים.
- מחקר זה נועד לזהות מולקולות קטנות המשפיעות על תהליכי התפתחות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ידנית לסריקה כימית בעוברים של zebrafish.
- הערכת ההשפעות של מולקולות קטנות על ביטוי גנים ועל מורפוגנזה של רקמות.
- אספקת פרוטוקול שיוכל לשמש חוקרים המכירים לראשונה טכניקה זו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקמת תאי הרבעה לדגי zebrafish לצורך איסוף עוברים.
- סידור העוברים בפלטות של 96 בארות לצורך טיפול בתרופות.
- שימוש בהיברידיזציה in situ של דגימות שלמות להערכת שינויים בביטוי גנים.
- סיווג תרכובות על בסיס השפעתן על פנוטיפים התפתחותיים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי שינויים התפתחותיים בעוברי Zebrafish כתוצאה מטיפולים כימיים.
- סיווג תרכובות על בסיס חומרת הפגמים שנצפו.
- הדגמה של ההיתכנות של סריקה ידנית עבור עד 600 תרכובות.
- השלכות פוטנציאליות לזיהוי תרכובות טיפוליות.
מסקנות
- שיטת הסריקה הכימית הידנית יעילה לחקר תהליכי התפתחות.
- גישה זו עשויה להקל על גילוי תרכובות בעלות פוטנציאל טיפולי.
- קביעה מדויקת של שלב ההתפתחות של העוברים היא קריטית להשגת תוצאות מדויקות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סריקה ידנית של מולקולות קטנות בתפוקה גבוהה בעוברים של דגיהידבון (zebrafish) מאפשרת תיקוף מטרות בשלב מוקדם והערכה פנוטיפית ללא צורך בפלטפורמות אוטומטיות. גישה זו תומכת בבדיקה מהירה של היפותזות ובצמצום סיכונים פונקציונליים בביולוגיה של גילוי, ובכך הופכת אותה לנגישה עבור מחקרים מגוונים.&צוותי פיתוח. השיטה מספקת נקודת כניסה ניתנת להרחבה לזיהוי תרכובות בעלות השפעות התפתחותיות או השפעות המשנות את מהלך המחלה, ובכך היא מספקת מידע ישיר למיון תיקי פיתוח ותיעדוף מובילים (leads).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח (R&D) בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בהקשר של אורגניזם של חולייתן שלם.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות ויזואליזציה של ביטוי גנים ושינויים במורפוגנזה של רקמות.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות תצפית ישירה על פנוטיפים המושרים על ידי תרכובות.
- מספק נתונים יישומיים לביטחון חיזוי בבחירת תרכובות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות מאושרות של עוברים של zebrafish עבור תהליכי סריקת פנוטיפ המשכיים.
- מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור באמצעות קריאות סטנדרטיות המבוססות על WISH.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה של עד מאות תרכובות בתשתית מינימלית.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על תהליכי התפתחות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים סריקה פנוטיפית למסלולים התפתחותיים הרלוונטיים למחלה.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי קישור שינויים בביטוי גנים לתוצאות ברמת האורגניזם.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים, בהסתמך על החומרה והספציפיות הנצפית של הפנוטיפים.
- מציע הפחתת סיכונים חזויה לזיהוי ביומרקרים תרגומיים כאשר הדבר נתמך על ידי נתוני ביטוי גנים.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול סריקה ידני זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי מובילים (lead identification) על ידי מתן אפשרות להערכה פונקציונלית של מולקולות קטנות במודל של בעלי חולייתים. הוא משתלב בתהורי עבודה הדורשים בדיקת השערות, סריקה פנוטיפית ואנליזה כמותית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקות מונחות-השערה של השפעות תרכובות על מסלולי התפתחות וביטוי גנים.
- סריקה: מספקת עוברי דג זברא (zebrafish) מוכנים לבדיקה ותוצרי WISH סטנדרטיים לסריקה הניתנת לשחזור.
- אנליטיקה: מאפשרת סיווג ודירוג כמותי של תוצאות פנוטיפיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים פנוטיפיים מוקדמים למודלים של מחלות ולפיתוח פוטנציאלי של סמנים ביולוגיים (biomarkers).
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ושימוש חוזר להערכה שוטפת של ספריות תרכובות ומחקרים מכניסטיים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בשלבי סינון מוקדמים.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות סטנדרטיות וניתנות לשחזור ללא הסתמכות על אוטומציה בעלות גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך התהליך (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תרכובות מבטיחות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית בטיפול בעוברים של דגי זברה ובניתוח WISH.
- נדרשת תשתית מעבדתית בסיסית, הכוללת פלטות רב-בארים, פיפטות ומיקרוסקופ סטריאו.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור שלבי התפתחות, דירוג ואנוטציה של נתונים.
- ניתן להתאמה לשלבי התפתחות שונים ולמטרות גנים שונות במודלים של דגי זברה.
- התפוקה הידנית מוגבלת על ידי זמינות כוח אדם ומיומנות בטיפול בעוברים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
Preparation of Zebrafish Mating Chambers and Collection of Embryos
2:41
Arraying and Chemically Treating Zebrafish Embryos
4:34
Embryo Fixation and Chemical Screening
5:52
Results: Zebrafish Embryonic High-throughput Chemical Screen
7:17
Conclusion
