Name: מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: למד סקר מולקולות קטנות ידני בעוברי דג הזברה באמצעות הכלאה מבוקרת וטיפול בתרכובות בפלטות 96 בארגז. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים בביטוי גנים ומורפוגנזה של רקמות לגילוי תרופות פוטנציאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון למעבדת מחקר Wingert מבין האפשרויות הבאות: המכון הלאומי לבריאות מעניק K01 DK083512, DP2 OD008470, וR01 DK100237; מרץ # ענק הפרס 5-FY12-75 הפרוטות הזיל אוקונור Starter Scholar; להתחיל את הכספים מאוניברסיטת נוטר דאם המכללה למדעים והמחלקה למדעים ביולוגיים; ומתנה נדיבה לאוניברסיטת נוטרדאם מאליזבת ומייקל גלאגר מטעם משפחת גלאגר לטפח מחקר בתאי גזע. היו הממנים לא היה תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם, או ההכנה של כתב היד. אנו מודים פול ט &#39;Kroeger, ג&#39; וניור למתן משוב ביקורתי על כתב היד. אנו מודים לצוות מהמחלקה למדעי ביולוגיה על תמיכתם, והמרכז לחקר דג הזברה בנוטר דאם על מסירותם היוצאת מן הכלל בטיפול והרווחה של המושבה דג הזברה שלנו. לבסוף, אנו מודים לחברי researהמעבדה ch להערות, הדיונים שלהם ותובנות על עבודה זו.

יש לי המחברים אין לחשוף.

גנטיקה כימית בדג הזברה יכולה לעשות השפעה קריטית על ההתקדמות של גילוי תרופות. פרוטוקול זה מספק שיטת תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם רצון לקריאה החוצה, בצורה יעילה ומאפשר צוות בודד או קטן לנהל מסך מולקולה קטן. שיטה המינימלית של משאביי-זה מרחיבה את הכדאיות של גנטיקה כימית לקבוצות מחקר רבות. באופן ספציפי, אסטרטגית מסך זה מספקת אלטרנטיבה חשובה לשימוש במכשור רובוטי, כמו מערכות כאלה הן לא רחבה נגישות בכל מחלקות מחקר. מסך במדריך זה מאפשר לו אדם אחד כדי לבדוק את הצלחת גם אחד 96 של תרכובות עם קריאה רוצה בשבוע עבודה בן 6 ימים. מאז דג הזברה הם מֵטִיל בֵּיצִים, עם העוברים מתפתחים מחוץ להורה, ואת העוברים הם גדולים מספיק כדי לראות בעין בלתי מזוינת (בין 1-3 מ&quot;מ), הם נוחים לטיפול ידני במכשירים פשוטים והחוקר יכול דגימות מערך בצלחות רבות גם ללא שימוש במיקרוסקופ. יתר על כן, מאז דג הזברה מתפתחת במהירות, חשיפת מולקולה קטנה יכולה להיות יעילה בטיפול יחיד של מתחם, ולא במינונים חוזרים ונשנים, אשר ממזער עיבוד ידני נוסף. עוברי דג הזברה בקלות מתורבתים כי החלמון שלהם מספק מקור תזונה עד 5-6 ימים לאחר הפריה, אשר מבטלת את הסיבוך של דגיגי האכלה. בנוסף, הרוב המכריע של איברי הזחל פיתח והפך פונקציונלי בתקופה זו, המספקת ההזדמנות ללמוד מגוון רחב של שאלות מחקר. בנוסף הפשוט של מולקולות קטנות לתקשורת הדגירה העובר אינו פולשני ומאפשר לחוקר (ים) כדי לבחור למנת תרופה, זמן של בנוסף, ומשך זמן של מתן שליטה הדוקה על משתנים רבים ומאפשרת לתהליכים התפתחותיים ספציפיים ובכך-חשיפה של ריבית ששאל. כפי שתואר כאן, הפרודוקטיביות מחקר משמעותית יכולה להיות מושגת בtimefr קצרהame שימוש במתודולוגיה מסך במדריך זה. מניסיוננו, יש תשואה גבוהה על המאמץ שהושקע, שיכול להיות מודגשת על ידי שימוש בספרייה כימית ביו ידוע לנתח תהליך של עניין, כגון פילוח נפרון במהלך פיתוח כליות (איור 4; Poureetezadi וWingert, לא פורסם). המסך כימי הוראות שמתואר כאן הוא תכליתי במיוחד משום שהיא כוללת assay על דגימות דג הזברה קבועות. לדוגמא, אסטרטגיה זו יכולה להיות מתוקנת כדי לבדוק כמה צלחות של תרכובות בשבוע אחד ולאחר מכן להבקיע עוברים בשבוע הבא. מבחני חלופיים על דגימות דג הזברה קבועות, כגון הכנות אימונוהיסטוכימיה או צביעת רקמות אחרת, יכולים גם להיות תחליף לרצון קריאה החוצה. אסטרטגיות ניסיוניות לביצוע מבחני סלולריים בדג הזברה הם ישימים בשל הבהירות והשקיפות האופטית של שלבי התפתחות מוקדמים. יתר על כן, חוקרים יכולים לעכב פיגמנטציה בSTA מאוחר יותרGES שימוש בכימיקלים או להימנע מהסיבוך של פיתוח פיגמנט לגמרי באמצעות השימוש בקווים גנטיים פיגמנט-פחות כמו קספר או דג הזברה מוחלט 13. זה אפשרי לנהל באופן ידני מולקולות קטנות, לעבד את הכתם (ים) של עניין, ולהבקיע באופן ידני עובר באמצעות סטראו פשוט. עם זאת, חשוב לזכור כי ניתוח תמונה אוטומטי יכול להתבצע, ועשוי למעשה להיות נדרשים לניתוח פנוטיפ ברזולוציה גבוהה. לדוגמא, זה יכול להיות עדיף על מערכת ניתוח תמונה אוטומטית עם assay ישיר, שותף כגון כתב מהונדס, כמו זה מייעל את העיבוד הידני של דגימות, מכמת הבדלים לא בקלות ניתן להבחין בעין בלתי מזוינת, ומבטל הטיה חוקר 15. למרבה המזל, כמה מערכות הדמיה אוטומטיות שניהם ידידותי למשתמש וחסכוני במונחים של עלויות תוכנת 15. השימוש והיכולות של מערכות אוטומטיות אחרות במהירות התפתחו ויכוליםלהיות בשימוש לאורגניזמים אוריינט, לנהל טיפולים תרופתיים, ואפילו להעתיק את מקום מגורי אורגניזמים 12,15. מערכות אוטומטיות אלה בישרו עידן טכנולוגי חדש של מחקר וספקו פתרונות חדשניים כדי לתפעל כמויות גדולות של נבדקים ובכך לבצע HTS וHCS גישות באורגניזמים שלמים 12,15. בעוד מכונות כאלה הן ללא ספק כלים שימושיים, הם גם מאוד יקרים ונמצאים מחוץ להישג ידם של רבים מעבדות מחקר בסיסיות. ללא גישה ליכולות האוטומטיות אלה זה אולי נראה כי מסכי כימיים אינם אפשריים. עם זאת, פרוטוקול זה מתאר מדריך לכיצד לנהל מסך במדריך, שניתן להשתמש כדי להשלים את מסך גנטיקה כימית באופן מעשי על פרק זמן סביר. חסרונות לשתי הגנטיקה הקרנה וכימית המדריך באופן כללי קיימים, וצריכים להישמר בחשבון כאשר שוקלים מסך כימי. בפרט, השיטה הפגינה כאן מחייבת מידה מתונהשל מיומנות פיזית. חשש זה הוא מצומצם או בטל לגמרי דרך חזרה, כמו מיומנות תשפר עם תרגול. בנוסף, יש מקום מינימאלי לשגיאה גסה, שכן יש רק 10 עובר לכל גם לניתוח. מולקולות קטנות יכולות להשתנות בחדירות של פנוטיפ שנגרם, כך משטר ניקוד סביר לזהות תרכובות של עניין יש לדבוק. זה חיוני כי חוקרי ניצול פרוטוקול זה להמציא קריטריונים קפדניים כראוי למה שהם ישקלו להיט. כמו כן, חשוב לזכור שהטבע של צורה זו של מסך יהיה ככל הנראה להניב חלק מסוים של תוצאות חיוביות שגויות, אשר יכול להיות שמסומן באמצעות עבודה-עד כימית נוספת. יתר על כן, זה קריטי לשלב עוברים מדויקים ולאסוף מצמדים להקרנה זמן קצר לאחר הפריה, כמו פיתוח אסינכרוני יכול להוביל לסיבוכים באופן מדויק להעריך את ההשפעה של טיפולים תרופתיים. יתר על כן, בכל הקשור להקרנה כימית לשעבראסטרטגית perimental, יש שורה של מגבלות. מסיסות ורעילות של מולקולות נושאת מתחם (לדוגמא, sulfoxide דימתיל (DMSO)) יכולים גם להציג נושא ויכולים להיות מונע בבדיקת מולקולות רבות. סיסית יכול לשמש גם מחסום לחשיפה לסמים. לבסוף, למרות שדג זברה היא מודל רב עוצמה וtranslational לגנטיקה כימית, טיפול צריך תמיד לקחת בקביעה האם אסטרטגית מסך כימית חלופית, למשל, שימוש במערכת במבחנה כגון שורת תאים, ניתן להחליף לשימוש בכל בעלי חיים. עם זאת, טיפול כימי במערכת דג הזברה השלמה נחשב עדיף על ניהול גישות דומות ביונקים, כפי שהיא מספקת את היתרון של איסוף ההשפעות המערכתיות של התרכובות ויכולה לאפשר לחוקרים למיין את רשימת התרכובות להיבדק במודל של יונקים. עד כה, מסכי כימיים דג הזברה סיפקו לא כלי ניסיוני חזקo להתוות המנגנונים של פיתוח ולוודא סוכנים תרופתיים מועמד לשימוש ברפואה, כגון זיהוי של מולקולות מסוגלת למנוע פתולוגיות מחלה. לדוגמא, מחקר על ידי ברנס ועמיתיו פיתח assay מיקרו-ואוטומטי לקצב לב לשימוש בעוברי דג הזברה מהונדסים שהביעו GFP בשריר הלב 42. הם השתמשו בקו מהונדס זה כדי לנתח את קצב לב בפיתוח וכיצד הוא הושפע על טיפול תרופתי 42. מחקר אחר, על ידי בדיקת צפיפות האוכלוסייה של תאי גזע hematopoietic בעובר דג הזברה, זיהה שE2 פרוסטגלנדין מסדיר את הנישה HSC 23. ממצא זה קבל תוקף בעכבר, ולאחר מכן בוצע לבדיקה קלינית בהשתלות טבורי אנושיות 23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). באמצעות מספר מחקרים שנעשה לאחרונה, גנטיקה כימית הוכיחה להיות שימושי בלימוד מחלת כליות באמצעות דג הזברה <sעד&gt; 43. כליות דג הזברה מספקת פרדיגמה מצוינת ללמוד nephrogenesis או התחדשות של נפרון, היחידה התפקודית המרכיבות את הכליות במהלך פציעת פיתוח וכליות חריפות 43. מבנה נפרון הוא שמור ביותר בין הכליה עוברית דג הזברה והמבוגרת בכליות יונקים 44-50. מספר מחקרים שבחנו את הכליה העוברית דג הזברה להדגים בבירור את פוטנציאל translational הטבוע בו כאשר יחד עם גנטיקה כימית. מסך גנטיקה כימית בוצע בשני מוטנטים דג הזברה שמופו לpkd2 גנים וift172, אשר ידוע להיות שחקני מפתח במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) 34. המסך הביא זיהוי deacetylase פאן-היסטון (HDAC) מעכב trichostatin (TSA) כמולקולה קטנה שיכול לבטל את הפגמים מורפולוגיים נראים בדרך כלל בעוברי המוטציה. גישה שונה ננקטה על ידי דה Groh ועמיתים הוקרנה תרכובות הinducבצקת ed בעוברי דג הזברה wild-type, דבר המצביעים הפרעה בתפקוד כליות 35. לאחר זיהוי PTBA כלהיט, הם הבחינו כי בנוסף לגרימת בצקת, PTBA גם הגדיל את הביטוי של pax2a, סמן לאבות כליות. חשוב לציין, נגזר ממוטב של PTBA אז הראה ירידת התמותה אחוזים של דג הזברה מבוגרת שעברה נזק לכליות הנגרם גנטמיצין ויתר על כן, האיץ את ההתאוששות של עכברים שסבלו מנזק כלייתי 27. יחדיו, תרומות אלה מגנטיקה כימית דג הזברה להציג הסוגים של תגליות שיכולים להתבצע תוך שימוש בשיטה שתוארה בפרוטוקול זה. למרות שמחקרי גנטיקה כימית נושאים הכשרון ניכר, זה לא בלי אתגרים מסוימים. אך ורק תוך שימוש בגישה גנטיקה כימית יכול לעשות את זה מסובך כדי לקבוע את הגן הספציפי או גנים המושפעים מתחם. גם אם יעד (ים) נמצא, siפער gnificant יכול להישאר בין הזדהות מתחם והבנת המנגנון (ים) של פעולה שבה המולקולה הקטנה מתנהגת. לדוגמא, זה יכול להיות קשה לקבוע את המנגנון שבו מולקולה קטנה פועלת כי מתחם אחד מסוגל לנהל מגוון של אפקטים שונים בתוך האורגניזם. עם זאת, עם כניסתו של טכנולוגיה חדשה והמסכים גנטיים כימיים יותר הושלמה בדג זברה, הבעיה של קביעת מנגנון מתכווצת. שיטה אחת כדי לקבוע את ההשפעות מולקולריות של תרכובות שזוהו היא לבחור ספריית תרופות של bioactives הידוע להקרנה, שבו מנגנונים ניתן להסיק שעלולה להיות מהנתונים מבואר בעבר. בנוסף, אלגוריתמי chemoinformatic, כמו שער גילוי, זמינים לשימוש שיכול להשוות דמיון מבני של מתחם מול מסד נתונים של תרכובות עם מנגנונים מיוחסים 14. דרך נוספת על מנת להבהיר את המנגנון של מתחם תהיה ליצור MICRoarray פרופיל לאחר טיפול ולאחר מכן לבצע שאילתא פרופיל זה באוסף של פרופילי תרופת microarray, כגון קישוריות מפה, מחפשת תרכובות מוגדרות באופן מכניסטי שתעוררנה אפקט דומה 14. גם גישה זו יכולה לשמש כדי לזהות מוטציות גנטיות שיש לו השפעה דומה לזו של תרכובת של עניין. מציאת קשר בין מתחם ומוטציה יכולה להציע שהמתחם פועל במעלה הזרם או במורד הזרם מולקולריים של הגן קשור, אשר יכול להיות שמסומן על ידי טיפול במוטציות עם המתחם וmorpholinos. אפשרות נוספת תהיה ספקטרומטריה, שממשיכה להיות אופטימלי יותר לדג זברה. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי להתוות שינויים ספציפיים חלבון או שלאחר translational שינויים לאחר טיפול תרופתי. לבסוף, מולקולות קטנות או אפילו ספריות שלמות הן לפעמים מסוגלים להיות מתויג לנפתח של שותפים המחייבים. זה גם ראוי לציין, כי בעוד שהמנגנון של איך פונקציות מולקולה קטנות אנישל יבוא משמעותי, יש תרופות שאושרו ע&quot;י ה- FDA שלמנגנונים אינם ידועים. למרות שדג זברה תערוכת קווי דמיון רב ליונקים שני גנטית ופיסיולוגי, יש עדיין בעיה של מוצלב התרופה 14. מחקר בדק את היכולת המוצלב של הלהיטים ממסך למעכבי מחזור התא בעוברי דג הזברה 50. המסך גרם לזיהויו של 14 להיטים שלא היו ידועים קודם לכן לבעלי פעילות מחזור התא. מתוך 14 תרכובות אלו, 6 נמצאו כבעלי פעילות מחזור תא בשני מבחני תרבית תאים אנושיים ודג זברה, 3 הוצגו להיות סרום מומת במבחני תרבית תאים, 1 היה פעיל רק בתאי דג הזברה, ו- 4 לא היו פעילות בכל אחד מ דג הזברה או מבחני תרבית תאי אדם, אבל רק בכל אורגניזם דג הזברה. יש לציין, 4 תרכובות שרק פעילות בדג הזברה מראות כי יש הבדלים בין דג הזברה ויונקים שעשויים prohiנשך את פוטנציאל translational של תרכובות מסוימות. זהו שיקול חשוב להיות מודע ל, עם זאת יש דוגמאות של מולקולות קטנות, כמו PGE 2 שמגביר את היכולת של HSCs לנקלט במקבלים אנושיים וPTBA נגזרים המשפרים את קצב התאוששות כליות אצל יונקים, ובכך לספק ההוכחה עיקרון מוצלב שאפשר 23,31-33. ללא קשר למלכודות הללו, גנטיקה כימית וגישה מינימאלי-משאב זה יש הרבה מה להציע לקהילת המחקר. גנטיקה כימית שימושית במיוחד בדג הזברה ותמשיך לשחק תפקיד קריטי בחקירת מסלול מולקולרית וגילוי סמים. מסכי כימיים המבוססים על מטרות מולקולריות בדידות שהיו בשיעור כישלון גבוה מבחינה היסטורית בשל מה שמכונה קבוצת הכוכבים של ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, ומאפיינים טוקסיקולוגית (ADMET) 51. מסכי כימיים ניצול דג הזברה ללהתמקד בתהליך, ולא יעד דיסקרטי, יכול לעקוף כמה בעיות ADMET ולזהות תרכובות שנמצאות יעילים בהקשר של האורגניזם כולו. עם הבריכה הולכת וגדל של משאבים זמינים למחקר דג הזברה, כוללים זנים מוטנטים הנוכחיים ואת היכולת להשתמש בעריכת הגנום ליצור מוטציות גנטיות ממוקדות וtransgenics, יש כמעט מספר בלתי מוגבל של מסכים גנטי כימי פוטנציאלי באמצעות דג הזברה. ספריות כימיות רבות כבר אצרו, ואוספי תוחלת עם bioactives הידוע, תרכובות רומן, מבחינה מבנית מגוונות ומבני דומות. ריאגנטים אלה מספקים שפע של הזדמנויות עבור שילובי מסך שכרגע זמינים וצפויים לגדול עוד יותר בשנים הקרובות. עם אפשרויות אלה ביד, פרוטוקול ידני ותפוקה גבוהה זה מספק דרך מעשית וידידותי למשתמש כדי להגדיל את היכולת של קבוצות מחקר לבצע מסכי גנטיים כימיים באמצעות דג הזברה.

זיהוי של סמי מרפא יעילים לטיפול במחלה אנושית הוא סוף המשחק להרבה חוקרים ביו-רפואיים. בעוד זיהוי והאפיון של סוכנים תרופתיים פוטנציאל ליישומים קליניים יש ערך ברור לבריאות, היא נותרה אתגר משמעותי. סופו של דבר, את הפיתוח של תרכובות רבות טיפוליות מגיע מהידע של איך סוגי תאים מסוימים או לפתח או פונקציה. דג הזברה, Danio rerio, היא חוליות מים מתוקים של משפחת Cyprinidae שהפכה לאורגניזם מודל הזרם המרכזי בביולוגיה התפתחותית 1. דג הזברה הן גנטי חוליות צייתניות כי הם קל לשמור ולטפל במחקרים מדעיים 2,3. עוברים דג הזברה הוא שקוף, מופרה חיצוני, ויכול להיות מיוצר על ידי מאות מזוג הזדווגות מבוגר יחיד בשבוע 2,3 בלבד. יתר על כן, מערכות דג הזברה מניות עיקריות באיברים ויש ד גדולegree של דמיון גנטי ליונקים, כולל בני אדם 4. באופן מפתיע, 70% מהגנים באדם יש orthologue דג הזברה 4. בשל דמיון זה, דג הזברה הייתה מערכת ניסיונית רלוונטית ביותר לחקר המנגנונים של התפתחות חוליות ופיזיולוגיה, והיית מועסק לשחזר מספר רב של מחלות בבני אדם 5-7. מסיבות אלה, בין השאר, הפכו את המועמד אידיאלי דג הזברה להמשך חקירות גנטיות והביאה לייסוף במגמת עלייה מתמדת לשירות של דג הזברה במחקר ביו-רפואי 6,7. במהלך העשורים האחרונים, שפע של כלים גנטיים פותחו בדג הזברה. הגנום דג הזברה ניתן לmutagenesis וtransgenesis 3. עד כה, שפע של קדימה לאחור מחקרים גנטיים בוצעו, הוביל לדור של מעל 9,000 מוטציות 3. יתר על כן, קווים מהונדסים רבים יש להיותen יצר, אשר איפשר התיוג ובידוד של סוגי תאים מסוימים 3. היו מאמצים מתמשכים משמעותיים לרכז ולחלק את המשאבים הללו לקהילת המחקר, אשר נגישים למעבדות בעלות נמוכה למדי באמצעות מרכז דג הזברה הבינלאומי המשאבים (Zirc) 8. יתר על כן, מאגר נרחב של מידע ביולוגי וכלים מולקולריים, הנעים בין דפוסי ביטוי גנים לMorpholino רצפים ופרוטוקולים, כבר מבואר בהדרגה ברשת הזברה המידע (ZFIN) 9-11. תשתיות מחקר דג הזברה אלה מתאפשרות באמצעות תמיכת NIH משמעותית וסנגור של מודל זה חי 8. מטמון זה של מוטנטים דג הזברה, קווים מהונדסים, ומידע רלוונטי ממשיך להיות של ערך יוצא דופן לקהילת המחקר הביולוגית בכללותו. עם זאת, בזמן שדג זברה היא עכשיו אורגניזם מודל מבוסס היטב ומראש יחסנים, הם מייצגים להrgely מאגר שלא נוצל ללמוד ביולוגיה ומחלות התפתחותיות באמצעות השימוש במסכים גנטיים כימיים. גנטיקה כימית היא השימוש במולקולות קטנות, כגון תרופות או חומרים אחרים, כדי להשפיע על תהליך ביולוגי בתוך מערכת חיים 12. יכולה להיות מיושמת גנטיקה כימית כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של תפקוד גן, כגון לזהות סוכני הצלה שאו להחמיר פגם גנטי ספציפי 12. יתר על כן, גנטיקה כימית מייצגת שדרת אחת גדולה בכדי לבצע מחקר translational 12. בעוד מסכי גנטיים קדימה מסורתיים במודלים של בעלי חיים היו מאוד חזקים בקישור גנים ספציפיים למחלות, שאין להם ממד זמן, ולכן קשה או לפעמים אי אפשר לצפות פנוטיפים שיקומו לאחר עובר מוקדם. בנוסף, יתירות גן יכולה להפוך את התוצאות שנצפו מגנטיקה קדימה קשה לפרש. לחלופין, מסכי גנטיים כימייםלאפשר לשליטה זמנית בסדר ובו זמנית מספק נקודת התחלה רבת ערך לגילוי סמים 12,13. ניתן לבצע גנטיקה כימית באמצעות במערכות חוץ גופית (לדוגמא, שורות תאים, חלבונים) או באמצעות מערכת in vivo, כגון האורגניזם כולו. שימוש במערכת במבחנה לגנטיקה כימית יכולה להיות מועילה, כי זה פשוט יותר מאשר מערכת האורגניזם שלמה, קל יותר לעבוד עם בקנה מידה גדול, פחות יקר, ופחות זמן רב. כתוצאה מכך, במבחנה מערכות מאפשרות לשניהם תפוקה גבוהה הקרנה (HTS) וגבוהה הקרנת תוכן (HCS). יש מספר היתרונות לשימוש במערכת במבחנה שיש לשקול בעת התקרבות גנטיקה כימית, אלא גם מגבלות משמעותיות. מגבלה עיקרית אחת לשימוש בשורת תאים היא שמולקולות קטנות יכולות להיות יעילות ולא רעילים בשורת תאים ספציפית, עדיין להיות רעיל כאשר הציגו את האורגניזם כולו. כך, עיקרמהעניין הוא שבמבחנת מערכות אינן ממצות את ההקשר הרחב של האורגניזם ובשל כך אינן תמיד מסוגל לחקות במדויק את מה שקורה באורגניזם שלם. בעוד בדיקת מתחם בכל האורגניזמים יכולה לעקוף בעיות אלה, השימוש במודלי האורגניזם שלמים יונקים מציב מספר המגבלות פיזיות ומוסריות. לדוגמא, הקרנת סמים בעכבר מתעכבת מבחינה לוגיסטית על ידי המרחב וההוצאות הדרושים כדי לבדוק גודל מדגם הולם. בנוסף, שאלות התפתחותיות יכולות להיות קשות ללמוד, בשל העובדה שהיונקים להתפתח ברחם. לבסוף, בעוד שההתנהלות של מחקר הביו-רפואי יש ערך חברתי עצום, יש בכל זאת צרכי משמעותיים כדי להגן על רווחת בעלי חיים על ידי הגבלת לימודים אינטנסיביים והקלת הכאב וסבל של בעלי חיים המשמשים למחקר. דג הזברה תהווה תחליף בר-קיימא לעבודה עם חוליות גבוהות כמו יונקים, ויתר על כן, ניתן ללמוד נושאים רבים באמצעות גנטיקה כימית בהשלבים העובריים וזחל כאשר עיבוד נוירולוגיות נעדר או אופרטיבי ברמה נמוכה 12,13. עד כה, מספר עצום של מסכי גנטיים כימיים בוצעו שימוש בעוברי דג הזברה בפרט, כמסירת מתחם יכולה להיות מושלמת על ידי שיקוע של עוברים בתקשורת המכילים את התרופה של העניין 12-15. יתר על כן, הייתה התקדמות מדעית וטכנולוגית רבות כדי להפוך את המסך גנטי כימי אפשרי והניהול 16-20. פיטרסון ועמיתיו היו הראשון שהשתמש בדג זברה במסך גנטי כימי בשנת 2000, ומאוחר יותר בשנת 2004 זוהה תרכובת שדוכאה מוטציה קוארקטציה של אב העורקים ב21,22 דג הזברה. מסכי כימיים מאז יושמו ללמוד כמה רקמות מתפתחות (לדוגמא, לב, דם, כלי) 23-25, פונקציות פיסיולוגיות (למשל, בסיס הנוירולוגי להתנהגות) 26, התחדשות מבוגרת 27,28, וdiseas<html> מודלים דואר (לדוגמא, מחלת ניוון שרירים וסרטן) 29,30. מבין המסכים כימי דג הזברה אלה, הגילוי שפרוסטגלנדינים להסדיר בתאי גזע hematopoietic נלקח לניסויים קליניים בבני אדם, הממחיש את הכח לעבור מ&quot; טנק למיטה &quot;23,31-33 (NIH, Trials.gov הקליני, NCT00890500; NCT01627314). לאחרונה, תרופות מועמד מבטיחים צמחו לאיברים מורכבים כמו הכליות, שתקנו פתולוגיה הסלולרית במחלת כליות פוליציסטיות (PKD) 34 וניזק כלייתי חריף 27,35, אם כי אלה עדיין לא לעבור לניסויים קליניים. מסכי גנטיים הכימיים אלה באופן רחב להדגים את התועלת של בדיקת תרכובות קטנות של דג הזברה פיתוח והיכולת ליישם את גנטיקה כימית לחקור תפקוד רקמות בוגר. יתר על כן, יש רשימה הולכת וגדלה של אוספי פרמקולוגיה זמינים מסחרי הניתנים ללימודים אקדמיים 19. ove_content &quot;&gt; בשנים האחרונות, חל התקדמות בולטת בטכנולוגית סינון גנטית כימית, כוללים השימוש במערכות אוטומטיות של רובוטים מחלק סמים וטיפול, יחד עם מערכות הדמיה אוטומטיות 36-38. מערכות כאלה מאפשרות לאפשרות של בדיקת אלפים רבים של תרכובות להשיג שני HTS וHCS 36-38. למרבה הצער, ההתחייבות של מסכי גנטיים כימיים עם ארגונים רובוטית החדשניים אלה בדרך כלל דורשות משאבים רבים. משאבים אלו סוגי מכשול משמעותי למוסדות רבים שאין להן ההון כדי לרכוש , תתפעל, תתחזק ומכשור כזה. בזמן הקמת התשתית לטיפול רובוטית של ספריות כימיות, ובכלל זה העברת עוברים לערוכות צלחות, נשאר עלותו למעבדות רבות, הדמיה ממוחשבת, ובניתוח היא בדרך כלל נגישה יותר 12. הקרנת תמונה אוטומטית מאפשרת כימות מחדש מהונדס ניאוןסבלים ומאפשרים ניתוח פנוטיפי הספציפי 12,15. למרות שמערכות אוטומטיות מייצגות התקדמות טכנולוגית שימושית, ניתן לטפל שאלות רבות על ידי מסכי מדריך לממוקדים יותר, כגון השאילתה של כמה אלף תרכובות פעילות ביולוגית על תהליך התפתחותי עם כל הר הכלאה באתר קריאה (רוצה) 39. יתר על כן, בעוד שמספר הולך וגדל של מעבדות לגייס לעזרתם מסכי כימי דג הזברה לחקור שאלת מחקר, כמה הרוויה ונושאים רבים (אם בכלל) מאמצים הגיעו טרם נפרצו בעזרת גנטיקה כימית. ניתן לבצע מסכי כימיים באמצעות מושבה דג הזברה קטנה המכילה רק כמה סוג בר או טנקים מהונדסים. לכן, זה סוג של חקירה גנטית צריך להיות בר-השגה על ידי רוב קבוצות מחקר דג הזברה מעוניינת להרחיב / גיוון לזירה זו. ספריות כימיות בגדלים שונים יכולות להיות רכש ממפיץ ו / או col מסחרייםlaborators. מסיבות אלה, גנטיקה כימית יכולה להיות כדאי מבחינה כלכלית גם באקלים מימון קשה. עם זאת, ישנם מכשולים למתחילים מסך גנטיקה כימית, כגון איך לתכנן היבטים לוגיסטיים של המסך: למשל, באופן ידני דגימות תהליך של מצבת כוח האדם הדרוש למסך מוצלח, הקצאת הזמן הייעודי ולצרף יחד פרוטוקול פיזי מספר שממאה לכמה אלף. כאן, אנו פרטנו פרוטוקול תפוקה גבוהה מדריך לכדי לבצע גנטיקה כימית בעובר דג הזברה עם רצון כמו קריאה מתוך. שיטה זו כרוכה טיפול תרופתי של עוברי דג הזברה, ואחריו זיהוי riboprobe של תעתיקי mRNA. שימוש בפרוטוקול זה, צוות קטן או אפילו אדם אחד יכול להקרין באופן סביר ולנתח ספרייה כימית צנועה כ -600 תרכובות בפרק הזמן של 9 שבועות.

<table><tbody><tr><td>0.1 - 10 & #956; l טיפים טבעיים לפיפט</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1111-3800</td><td></td></tr><tr><td>1x E3</td><td></td><td></td><td>צור באמצעות 50x E3 ו-DI מים.</td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>צור 0.1% Tween-20 ב-1x PBS.</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>צלחת צביעה 12 בארות</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3226</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA / 1x PBS</td><td></td><td></td><td>צור 4% PFA (w/v) ב-1x PBS - מרתיחים ואז מקפיאים ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>48 צלחת</td><td>באר CytoOne</td><td>CC7672-7548</td><td></td></tr><tr><td>50x E3</td><td></td><td></td><td>מייצרים 16.5 מ"מ CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl ו-8.5 mM KCl במי DI.</td></tr><tr><td>96 צלחת באר עמוקה</td><td>VWR</td><td>100-11-940</td><td></td></tr><tr><td>96 מחצלת איטום צלחת באר</td><td>VWR</td><td>10011-946</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד דיגוקסיגנין</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>שמור על -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מלאי BCIP</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>לייצר 50 מ"ג/מ"ל באמצעות 100% DMF - להקפיא ואז לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> בלוק <td>צור 50 מ"ל באמצעות 10 מ"ל BSA (10%), 5 מ"ל FCS ו-35 מ"ל MABT. (הפשרה של BSA ו-FCS ב-37 מעלות צלזיוס.)</td></tr><tr><td>מלאי BSA (אלבומין סרום בקר)</td><td>AB00448 ביואנליטי אמריקאי</td><td></td><td>לייצר 10% BSA על ידי ערבוב פתיתי BSA ב-MAB בטמפרטורת החדר ואז להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>DIG/FLU שכותרתו ריבופרוב ריאגנטים לתגובת שעתוק במבחנה</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>התייעץ עם נוהל היצרן.</td></tr><tr><td>DMF (דימתילפורמלדהיד)</td><td></td>מעכב DNase 1 AB00450 <td></td><td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>, 10x DNase 1 מאגר Roche</td><td></td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>צלחת דגירה עוברית</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>epT.I.P.S 20-300 &#956; l</td><td>Eppendorf</td><td>22492284</td><td></td></tr><tr><td>אתנול (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>לייצר 50 מ"ל של 70% EtOH בדרגה מולקולרית H2O ו-100% EtOH ואז לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מלאי FCS (סרום עגל עוברי)</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>לשמור על -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>יחידת עיקור מסנן</td><td>קורנינג</td><td>430516</td><td>0.45 & # 956; m CA / 1 ליטר נפח</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה תחתון שטוח</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>AB00600 ביואנליטי אמריקאי</td><td></td><td>לשמור על -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>כיור זכוכית 90 x 50</td><td>Kimax Kimble</td><td>23000</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת זכוכית</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>לייצר 50% פורממיד, 0.1% Tween-20, 5x SSC, 5 מ"ג/מ"ל RNA טורולה שמרים, ו-50 &#956; l/&#956; l מלאי הפרין</td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>לייצר 55 מ"ג/מ"ל באמצעות 70% DMF ו-30% H2O - להקפיא ואז לאחסן ב-20&0C.</td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>Generate על ידי הוספת 55.0 גרם בסיס Trisma, 8 מ"ל של 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 גרם חומצה מאלית ו-17.5 גרם NaCl ל-1.5 ליטר של H2O נטול יונים. לאחר מכן מלאו ב-H2O נטול יונים עד 2 ליטר וחיטוי.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>לייצר 0.1% Tween-20 במסננת תה רשת MAB</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr> חנות <tr><td></td><td>תה אנגלית</td><td>מק"ט #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>מים מזוקקים בדרגה מולקולרית</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב 8 ערוצים 0.5 - 10 & #956; l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.019</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב 8 ערוצים 30 - 300 & # 956; l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>מלאי NBT</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>לייצר 50 מ"ג/מ"ל באמצעות 70% DMF ו-20% H2O - להקפיא ואז לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> <td>paraformaldehyde</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>דבק PCR-Film</td><td>Eppendorf</td><td>30127.48</td><td></td></tr><tr><td>מיכל צלחת (קופסת עיפרון)</td> <td>סטריליט</td><td>1722</td><td></td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> צביעה מראש <td>צור 0.1% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl ו-100 mM Tris pH 9.5. (הכינו טרי לשימוש בכל פעם.)</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche</td><td>11459643001</td><td>לייצר 50 מ"ג/מ"ל באמצעות E3, להקפיא ואז לאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>רוש</td><td>03-115-879-001</td><td>לייצר 10 מ"ג/מ"ל במי DI ואז להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>מעכב RNase 1</td><td></td> נורת גומי <td>Roche</td> 3335399001 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand Fisher Scientific</td><td>03-448-22</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת צביעה-סגול</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>צור באמצעות 45 & #956; l של NBT ו-35 &#956; l של BCIP לכל 10 מ"ל הדרושים במאגר לפני צביעה.</td></tr><tr><td>תמיסת מכתים-אדום</td><td></td><td></td><td>צור באמצעות 31.5 & #956; l של INT ו-35 &#956; l של BCIP לכל 10 מ"ל הדרושים במאגר לפני צביעה.</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA פולימראז</td><td>רוש</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>רוש</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>צינור העברה</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>מלאי Tween-20 אמריקאי</td><td>ביואנליטי</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>תרמו</td><td>51221073</td><td>( דגם # 2831)</td></tr></tbody></table>

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

דג הזברה הפכה אורגניזם מודל בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס ביולוגיה התפתחותית ולמחקר של מחל מחלות של בני אדם בשל המידה הניכרת של שימור גנטי בבני אדם. גנטיקה כימית כרוכה בבדיקת ההשפעה שיש לי מולקולות קטנות בתהליך ביולוגי והופכת לשיטת מחקר translational פופולרית לזהות תרכובות טיפוליות. דג הזברה פונה באופן ספציפי לשימוש עבור גנטיקה כימית בגלל היכולת שלהם לייצר אחיזה גדולה של עוברים שקופים, שמופרים באופן חיצוני. יתר על כן, עוברי דג הזברה יכולים להיות בקלות בסמים מטופלים על ידי התוספת הפשוטה של ​​מתחם לתקשורת העובר. שימוש בכל הר הכלאה באתר (רוצה), ביטוי mRNA ניתן בבירור דמיין בתוך עוברי דג הזברה. יחד, בעזרת גנטיקה כימית ומאחלים, דג הזברה הופכת הקשר האורגניזם שלם חזק בו כדי לקבוע את סלולארי ופיזיולוגיהשפעות של מולקולות קטנות. התקדמות חדשנית נעשתה בטכנולוגיות שעושות שימוש בהליכי מיון המבוסס על מכונה, אך למעבדות רבות אפשרויות כגון אינן נגישות או להישאר עלות אוסרני. הפרוטוקול המתואר כאן מסביר כיצד לבצע מסך מדריך לתפוקה גבוהה כימי גנטי שדורש משאבים בסיסיים ויכולים להתבצע על ידי צוות בודד או קטן אחת בתקופה יעילה של זמן. כך, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה אפשרית שיכול להיות מיושמת על ידי קבוצות מחקר לבצע גנטיקה כימית בדג זברה, אשר יכולה להיות שימושית להשגת תובנות יסוד לתהליכים התפתחותיים, מנגנוני מחלה, ולזהות תרכובות חדשות ומסלולי איתות שיש לי יישומים רלוונטיים מבחינה רפואית .

הגישה הידנית המתוארת כאן מאפשרת לחוקר יחיד ביעילות ובהצלחה לנהל תפוקה גבוהה גנטיקה כימית מולקולה קטנה מסך באמצעות מודל דג הזברה עובר (איור 1). באמצעות שיטה זו, זה מעשי לאדם אחד לבצע מסך גנטיקה כימית, כך שבמשך 9 שבועות אדם אחד (מחויב לשבוע עבודה של 40 שעות) יכול לבצע את סקר של כ -600 תרכובות (איור 1) . כך, בפעם הספסל של אדם אחד יכולה לעקוף את הצורך בציוד בדרישה גבוה משאבים, מערכות אוטומטיות כמו. Trade-off הוא שמסך ידני דורש מספר שבועות של מאמץ ייעודי. בניגוד לכך, השימוש במערכות אוטומטיות יכול לדחוס את הזמן הכרוך ב1-2 שבועות של זמן רובוטית, ועלולים להיות כרוכה במאמץ חוקר יחסית מינימאלי כוללת. אחת דרכים להגדיל את היעילות ו / או היקף מסך במדריך היא לגייס 2-3 חוקרים בסך הכל, שתאפשר הקרנה מ 'תרכובות עפרות, ריכוז תרכובת שונה, ו / או הקרנה על פני תקופה קצרה של זמן. מעורבים בפרוטוקול כדי להשלים מסך גנטיקה כימית בעוברי דג הזברה עם קריאת משאלת הצעדים העיקריים מומחשים כתרשים זרימה (איור 2). ניתן לחלק את משימות הניסוי לשני סוגים של שבועות עבודה: (1) חשיפה לכימיקלים ותיוג עובר, ו- (2) ניתוח והדמיה. בשבוע עבודת חשיפה לכימיקלים, צעדים אלה כוללים הקמת מבוגרים דג הזברה (יום 1), אוסף עובר, עובר עֲרִיכָה וטיפול תרופתי (יום 2), הכנת עוברים לכלאה באתר (יום 3), וכלאה באתר (יום 4 -6). בשבוע ניתוח / הדמיה, חוקר מנתח ביטוי mRNA להבקיע עוברים ולהיטי תמונה (יום 7-11). חלק קריטי בביצוע מסך גנטיקה כימית הוא לתייג גם באופן עקבי ומדויק במקומות. כp מסך גנטיקה הכימיתrocess מפורט כאן כרוך בהעברת קבוצות של עוברים מהיטב בצלחת אחת לגם בצלחת שונה מספר פעמים, את הצורך בתיוג מדויק וברור הוא בעל חשיבות עליונה, כך שכאשר להיט כימי הוא הבקיע זה יכול להיות ליניארי ובקלות נעוצים לזהותה בתוך הספרייה הכימית (איור 3). דרך קלה כדי לוודא שזה היא תווית הצלחות בצורה כזאת, כי בכל עת את המיקום גם עבור קבוצה של עוברים שטופלו על ידי תרכובת ישירות מתאים למיקום הכימי ספריית צלחת תרופה גם של המתחם משמש לטיפול בעוברים אלה (איור 3). כאן, מערכת כפולה של תוויות צבע קידוד ומספריים היא מנוצלת כדי לארגן את הדגימות, שנוספו לצלחות המסך באמצעות סמנים קבע (איור 3). כאשר מנתחים את התוצאות של מסך תפוקה גבוהה, יש צורך קריטי לפתח שיטה לארגן בצורה נכונה, ביאורים, ולנתח את המולקולה קטנה פוטנציאליתלהיטים. לכן, מסך גנטיקה כימית חייב להיות מערכת לדירוג יסודית וברורה שתוכננה בקפידה וציית באופן קפדני ל. מערכת כזו צריכה בקלות ובאופן מוחלט להעביר את הדינמיקה החשובה של מתחם ולספק דרך תמציתית להציג את התוצאות של המסך המוגמר. אחת דרכים לבנות מערכת כזו היא עוברי כיתה באמצעות מערכת כיתה, מה שמסביר את החומרה מורפולוגיים כוללת וביטחון של להיט. יתר על כן, הקטגוריות המעמדיות יכולות להיות בשילוב עם (+) או (-), כדי לתאר השפעה מרחיבה או מצמצמת באזור (ים) של עניין. כאן, עוברי דג הזברה היו נתונים לתרכובות בודדות מספרייה ביו (אנזו כימיקלים) מepiboly 50% ל- 24 hpf, ולאחר מכן assayed ידי משאלה באמצעות קוקטייל של שלוש riboprobes לזהות פלחי נפרון (איור 4 א). כמערכת לדירוג דוגמא, גם שמכיל קבוצה של עוברים שהיו לי convolu הפרוקסימלי מוגדל באופן דרמטיאבובית טד (PCT) של כִּליַת רֵאשִׁית, הכליה העוברית דג הזברה, תגרום למתחם המשמש לטיפול שכן להיות מסווג כ( Class I), אשר במקרה זה היה לייצג את המעמד הקשורות לפגם החמור ביותר וברמה הגבוהה ביותר של אמון בפנוטיפ נצפה (איור 4). המתחם היה אז להיות מבואר ב( PCT) ו( +), להיות סימון המלא (Class I - + PCT) (איור 4). תפיסה זו של סיווג מספקת דרך פשוטה ומהירה כדי לתאר מידע רב הנוגע למולקולה קטנה של עניין, ובכלל זה את חומרת השפעת התרכובות על האורגניזם, האזור שמושפע מהסמים ואת האופן שבי האזור מושפע (איור 4). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig1highres.jpg" width="500"> איור 1. &amp; #160;. אסטרטגית מסך כימי עובר דג הזברה ידנית חוקר יתכן יכול לבדוק צלחת גם 96 של כימיקלים על עוברי דג הזברה ולבצע עיבוד המשאלה הבא במהלך שבוע אחד. ביצוע שבועיים של בדיקות כימיות (שבוע 1 (יום 1-6) ושבוע 2 (יום 7-12)) ניתן לשייך שבוע המוקדש ללדגום ניתוח שלישי. כ יכולות להיות הבקיע שתי צלחות 96 שווה של דגימות מסך וצלמו שבוע 3 (יום 13-17). תרחיש זה מסתכם בהקרנה של כ -200 תרכובות בתקופת זמן 3 שבוע, שהשוותה ל ספרייה קטנה של כ -600 תרכובות הוקרנו לחלוטין על ידי 9 שבועות. אסטרטגית מדריך זה יכול להיות שונה בהתאם למשאבים הזמינים. לדוגמא, שלושה חוקרים יכולים להפחית את הזמן כדי להשלים את המסך של כ -600 תרכובות עד 3 שבועות בהשוואה ל 9 השבועות זה ייקח עם חוקר אחד. ניתן להתאים אסטרטגיות סקירה על ידי הקצאת חוקרים להיבטים ספציפיים של המסך, כגון טיפול תרופתיment וכלאה באתר או מכוונים את החוקרים לבצע באופן עצמאי את תהליך המיון כולו בחלקים נפרדים של הספרייה הכימית. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig2highres.jpg" width="500"> תרשים זרימה 2. איור:. פירוט העבודה מסך 6 ימים תהליך המיון הכימי יכול להיות שבור למטה דיסקרטית ל -6 ימים. יום 1 מורכב של הקמת זוגות הזדווגות דג הזברה (= /&gt; 25) לספק עובר לכל צלחת גם 96 שיוקרה. היום 2 כרוך באיסוף עובר מן תאי ההזדווגות ועֲרִיכָה בצלחת גם עמוקה 96, ואחריו טיפול תרופתי. ביום 3, עובר מוכנים לתרצה, כולל dechorionation, קיבעון רקמות, והתייבשות עובר. לבסוף, רצון הוא מבוצע בעוברים דרך יום 4-6. אנא שים לב כי נהלי צביעה חלופיים על דגימות קבועות יכול להיות בקלות שלubstituted למשאלה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" width="500"> סכמטית איור 3. פלייט תיוג העברה. עוברי דג הזברה מפוזרים וסמים שטופלו בצלחת גם 96 ולאחר מכן עברה לצלחת גם 24 להסרת פסולת וחשיפת pronase. אז העוברים עברו 48 צלחות גם להכנת עובר, תרצה, וקיבוע רקמה. בשלב הבא, עוברים מועברים 12 צלחות גם לניקוד, הדמיה, ואחסון. עֲרִיכָה המדויקת של עוברים מושגת על ידי השימוש בשיטת קוד-צבעים, המאפשרת לחוקר לעקוב אחר כימי ממוצא עבור כל מדגם בדיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width='"5in"' src="/files/ftp_upload/52063/52063fig4highres.jpg" ftp_upload width='"500"'> מערכת איור 4. דוגמא לדירוג:. assay פילוח כליות ניסוי מאחלים מאפשר לחוקר להכתים סוגי תאים ספציפיים המבוססים על הזהות של הבדיקות שנבחרו, ומאפשר ההערכה של שינויים בפנוטיפים עובר בהתאם לשינויים במיקום שעתוק mRNA ו / או רמות. כדוגמא, שלושה מגזרים של הכליה העוברית דג הזברה, כִּליַת רֵאשִׁית, תויגו באמצעות מיקס מסך 1. מערבבים מסך 1 הוא קוקטייל של בדיקות מורכבות של wt1b, אשר דווקא localizes בpodocytes (P), slc20a1a אשר מסמן את הפרוקסימלי מפותל אבובית (PCT), וslc12a1 אשר תוויות המגזר המוקדם דיסטלי (DE) 47. סמל (+) לצד תווית אזור משמש כדי להוסיף הערות על ההתרחבות או שינוי חיובי של האזור, ואילו (-) שימוש בסמל למכתיב את ההתמעטות של אזור. הנה, אותםיש לי bryos סמים מטופלים עם RA 13-cis אבובית הפרוקסימלי מפותל מוגדלת והפסד של המגזר המוקדם דיסטלי ללא השפעה נראית לעין על podocytes מלא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52063/52063fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

דג הזברה הוא אורגניזם ניסיוני מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים חוליות ומחלות של בני אדם מודל. כאן, אנו מתארים פרוטוקול על אופן ביצוע מסך כימי תפוקה גבוהה מדריך לעוברי דג הזברה עם כל הר באתר הכלאה (רוצה) לקריאה החוצה.

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע סריקה כימית בעוברי דגי זברה באמצעות עיבוד דגימה ידני. זה מושג על ידי הכנסת דגי זברה בוגרים לתאי הזדווגות עם מחיצה למשך הלילה, ולאחר מכן הסרת המחלק למחרת בבוקר כדי לאסוף עוברים. לאחר מכן, קבוצות של עוברי דג הזברה מסודרות ב-96 צלחות באר, ולאחר מכן מטופלות בתרופה בשלב ההתפתחותי הרצוי.לאחר מכן מותר לעוברים להתפתח קבוע עם 4% פרלדהיד ובדיקה כדי לאמוד את ההשפעות של מולקולות קטנות על תהליך ההתפתחות המעניין. התוצאות מראות שינויים התפתחותיים כגון רווח או אובדן של תחומי ביטוי גנים שיכולים להצביע על שינויים בסולפט או במורפוגנזה של רקמות שנגרמו על ידי המולקולות הקטנות שנחקרו. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול הקליני במגוון מחלות בגלל היכולת לזהות תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להתקשות מכיוון שהם צריכים לרכוש את המיומנות הדרושה לעבודה עם עוברים, כגון העברתם בין צלחות מרובות בארות ללא נזק. נדגים את ההליך אני ואריק דונהיו, חוקר לתואר ראשון במעבדה להקמת הזדווגות של דגי זברה. השתמש בתאי הזדווגות עם חוצצים הניח דגי זברה זכרים בוגרים בצד אחד של המפריד ודגי זברה נקבות בוגרים בצד השני.על כל צלחת של 96 בארות של מולקולות קטנות שיש לבדוק. הקימו 25 מיכלי הזדווגות והשאירו אותם למשך הלילה. למחרת, הסר את התא המפריד בין כל זוג דגים ולאחר שעה, השתמש במסננת רשת דקה כדי לאסוף עוברים לפני הנחתם בצלחות פטרי המכילות E שלוש מדיום עם פיפטת העברה.הסר פסולת מהצלחות ומתחת לסטריאוסקופ. התבונן בכל מצמד של עוברים והסר ביציות לא מופרות. רוקנים את ה-E שלוש בינוני ומחליפים ב-E שלוש טרי.לאחר מכן מניחים כל צלחת עוברים באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. בדוק שוב את הצלחות והשליך ביצים לא מופרות נוספות. המשך לדגור על העוברים עד לשלב 40%eely.הסר את לוחית הספרייה הכימית ממינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות אותו ולאפשר לו להפשיר בטמפרטורת החדר בעזרת פיפטה בעלת שמונה ערוצים. הוסף 99 מיקרוליטר של E שלוש לעמודות שתיים ל-12 של צלחת של 96 בארות.לאחר מכן הוסף מיקרוליטר אחד של התרכובות המתאימות לבארות בעמודות 2 עד 11 כאן, המיועדות כדגימות הניסוי פיפטה מיקרוליטר אחד של DMSO לעמודת הבקרה כאן המיועדת להיות עמודה 12. השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות את צלחת הדילול ולהחזיר את ספריית הכימיקלים למקפיא. לאחר מכן, לאחר בחירת צלחת פטרי המכילה עוברים בשלב 40% אפי, השתמש בפיפטה העברה כדי למקם בזהירות כ-10 עוברים לבאר בעמודות שתיים עד 12 מתוך 96.ובכן צלחת. השתמש בפיפטה להעברת זכוכית כדי להסיר עודפי E שלוש מכל באר ולהוציא למיכל פסולת נוזלית. כדי לטפל כימית בעוברים, העבירו 100 מיקרוליטר מכל דילול כימי מצלחת 96 הבאר לבאר העוברים המתאימה כדי ליצור תא לח עם מגבת נייר ולהניח אותו במיכל רגיש לאור.גדול מספיק כדי להכיל צלחת 96 באר. לאחר מכן השתמש במחצלת תקרה כדי לאטום את הצלחת. הנח אותו במיכל הרגיש לאור ודגר אותו בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי.כדי להסיר את הכימיקלים, הוסף 300 מיקרוליטר של E שלוש לכל שורה של בארות שטופלו בתרופות. לאחר מכן משוך את המדיום לפני השימוש ב-E שלוש כדי לשטוף את העוברים שלוש פעמים כדי לתקן עוברים, להעביר אותם לארבע צלחות מסומנות של 24 בארות ומניח את הפיפטה מול רקע כהה. לאחר כל העברת באר כדי לזהות עוברים שנותרו בפיפטה וכדי למנוע הצלבה, הסר את כל העוברים המתים.משוך את ה-E 3 כך שהעוברים בקושי שקועים בנוזל. לאחר מכן השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להוסיף שתי טיפות של 50 מיליגרם למיליליטר פרונאז לכל אחת. ובכן דגרו על העוברים במשך חמש דקות לפני שתערבבו את הבארות כדי לגרום לקוריאן להתפרק.לאחר שימוש ב-E שלוש כדי לשטוף את העוברים פעמיים, משוך והשליך את ה-E שלוש הנותר. הוסיפו 4% P-F-A-P-B-S לכל באר ודגרו על העוברים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן בצע מסך מעניין כגון הכלאה של חור באתר, או מבקש כמתואר בפרוטוקול הטקסט לדרג את העוברים מהמסך הכימי.העבירו אותם ל-12 לוחות באר מסומנים לפני השימוש במיקרוסקופ סטריאו כדי להתבונן בהם כמתואר בתרשים זה. זה מעשי עבור אדם בודד לבצע בדיקה גנטית כימית על כ-600 תרכובות במהלך תשעה שבועות של מאמץ ייעודי, וניתן לקצר את הזמן הזה לשלושה שבועות אם מבוצע על ידי שלושה אנשים. לפיכך, זמן הספסל של אדם אחד או כמה אנשים יכול לעקוף את הצורך בציוד הדורש משאבים גבוהים כמו מערכות אוטומטיות.כפי שמוצג כאן, עוברי דגי זברה נחשפו לתרכובות בודדות מספרייה ביו-אקטיבית מ-50% מהאנשים ל-24 HPF, ולאחר מכן נבדקו על ידי משאלה, תוך שימוש בקוקטייל של שלוש בדיקות ריבו כדי לזהות מקטעי נפרון. כדוגמה, מערכת דירוג, תרכובת שהביאה לצינורית מפותלת פרוקסימלית מוגדלת באופן דרמטי או PCT תסווג כמחלקה אחת, המייצגת את המחלקה הקשורה לפגם החמור ביותר ורמת הביטחון הגבוהה ביותר בפנוטיפ שנצפה. לאחר מכן התרכובת תסומן כ-PCT מסוג 1.בנוסף, סיווג זה מספק דרך פשוטה ומהירה לתאר מולקולה קטנה מעניינת, כולל חומרת השפעתה על האורגניזם, האזור המושפע מהתרופה והאופן שבו האזור מושפע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשלב את העוברים שלך בנקודת הזמן ההתפתחותית הנכונה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקה כימית ידנית עם עוברי דג הזברה.

a-manual-small-molecule-screen-approaching-high-throughput-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדווחים על פיתוח של מערכת הדמיה ניתוח אוטומטי של העוברים מהונדס דג הזברה בצלחות multiwell. זה מדגים את היכולת לאמוד את ההשפעות תלויות במינון של מולקולה קטנה, BCI, על גדילה פיברובלסטים ביטוי פקטור כתב גנים לספק טכנולוגיה להקמת תפוקה גבוהה כימיים מסכי דג הזברה.

פיתוח הדמיה ניתוח אוטומטיות עבור מסכי דג הזברה כימיים.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

במאמר זה, עוברים של דגי זברה משמשים לבדיקת רעילות כימית. רעילות כימית מתואמת עם קריאות פנוטיפ. פרוטוקול הדגימה מציג גישה מתודולוגית לביצוע בדיקת רעילות כימית.

מסך רעילות כימית מבוסס עוברים: הערכת השפעות על התפתחות עוברים של דגי זברה

המעבדה שלנו פיתחה מערכת שהיא שימושית לצורך זיהוי של כמה התנהגויות שונות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה רומן. המערכת יכולה לשמש לאיתור שינויים עדינים בהתנהגות לאחר הזחלים שנחשפו לרעלים או תרופות סביבתיים.

ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

מאמר וידאו זה מתאר את צינור התפוקה הגבוה שכבר נקבע בהצלחה להדביק ולנתח מספר גדול של עוברי דג הזברה מתן כלי רב עוצמה חדש לבדיקת מתחם וגילוי סמים באמצעות האורגניזם חוליות בעלי החיים כולה.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

כאן, אנו מציגים לפרוטוקול תכנון, הרכיבו את העובר דג זברה סידור במערך תבנית, ולאחריו נוהל מפורט על השימוש של תבנית כזו עבור תפוקה גבוהה דג זברה סידור במערך העובר לתוך צלחת 96-ובכן.

תלת-ממדי (3D)-להדפיס תבנית עבור תפוקה גבוהה דג זברה העובר סידור במערך

עוברי דג משמשים להערכת הרעילות של תרכובות כימיות. הם מפתחים מבחוץ ורגישים לכימיקלים, ומאפשרים זיהוי של שינויי פנופאיות עדינים. הניסוי דורש רק כמות קטנה של תרכובת, אשר מתווסף ישירות לצלחת המכילה עוברים, מה שהופך את מערכת הבדיקה יעילה וחסכונית.

הערכה מהירה של רעילות של תרכובות כימיות באמצעות עוברי הדגים Zebrafish

Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

אנו מתארים את זרימת העבודה וניתוח הנתונים של מערכת סינון להערכת רעילות של תרכובות כימיות בהתבסס על תגובת הבהלה של רטט עובר דג הזברה. המערכת מתעדת את תנועותיהם של עוברי דגי זברה בחשיפה לגירוי רטט ומאפשרת הערכה משולבת של רעילות/קטלניות כללית ורעילות עצבית-שרירית.

הערכת רעילות של כימיקלים באמצעות מערכת סינון תגובת בהלה לרטט של דגי זברה

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

למד סקר מולקולות קטנות ידני בעוברי דג הזברה באמצעות הכלאה מבוקרת וטיפול בתרכובות בפלטות 96 בארגז. השיטה מאפשרת זיהוי שינויים בביטוי גנים ומורפוגנזה של רקמות לגילוי תרופות פוטנציאליות.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

גלה סרטונים נוספים