גירוי optogenetic של עצב השמיעה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעורר אופטית את עצב השמיעה של בעלי חיים עם נוירונים גנגליונים ספירליים שעברו שינוי אופטוגנטי. זה מושג על ידי הכנה תחילה של ממריץ מיקרו LED כחול או סיב אופטי המחובר ללייזר כחול. השלב הבא בהליך הוא הערכת השבלול באמצעות גישה מיקרו-כירורגית רטרו אפרכסת.

השלב השלישי הוא למקם את הממריץ האופטי כדי להקליט תגובות גזע מוח מעוררות אופטית. השלב האחרון הוא לגשת לקולוס התחתון כדי לתעד פעילות מעוררת אופטית. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות גירוי מוצלח של מערכת השמיעה באמצעות הקלטות של תגובות גזע המוח השמיעתי ופוטנציאל השדה המקומי.

בקוליקולוס התחתון גירוי אופטוגנטי של עצב השמיעה. כחלופה לחשמל, שתלי שבלול מבטיחים רזולוציית תדר ועוצמה טובה יותר. זה מעניין מאוד למחקר אודיטורים, אבל ההשלכות של הטכניקה הזאת מתרחבות לשיפור שיקום השמיעה אצל חירשים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר שמיעתי, כגון תפקיד פעילות הדפוס לחידוד ההתפתחות האורתופדית, הדרישה לאינטגרציה ספקטרלית בלוקליזציה של תאים, ומידת האינטראקציה בין הקרנות מסגרת ספציפיות לתדר. במערכת השמיעה המרכזית, הדגמה חזותית של ההליך היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את המיקום והכיוון המתאימים של המיקרו LED או הסיב האופטי. ממריץ המיקרו LED משתמש בנורת LED כחולה עם משטח פעיל של 200 מיקרון מרובע חוטי הלחמה ראשונים למיקרו LED.

לאחר מכן, בעזרת אפוקסי עוטפים את הנורית ואת החיבור שלה, מאפשרים לה להתייבש למשך הלילה. לאחר הריפוי, הזינו את החוטים דרך קוטר חיצוני של מילימטר אחד. לשאול נימי זכוכית סיליקט.

הזכוכית מספקת יציבות מכנית ובידוד חשמלי. אטום את צומת הנימים והנורית המצופה אפוקסי עם יותר אפוקסי מקם את הנימים כך שניתן יהיה להרכיב אותו על מניפולטור. כעת בדוק את חיבורי החשמל.

ראשית, הכינו שלושה חוטי נחושת. טבלו קצה אחד של כל אחד מהם באמבט נתרן כלורי 0.9%. לאחר מכן חבר את הקצוות האחרים שלהם למגבר A BR.

עקוב אחר האות באמצעות אוסצילוסקופ. לאחר מכן, חבר את המיקרו LED לממריץ המותאם אישית לבדיקה. טבלו את המיקרו LED המחובר לסטימולטור באמבטיה והפעילו את הנורית למשך 20 דקות לפחות.

תוך כדי גירוי ה-LED צג את האוסילוסקופ לאיתור חפצים. השלך את כל נוריות ה-LED הפגומות. להרדים עכבר בן ארבעה עד 10 שבועות.

עכבר זה מבטא אופסין ערוץ שניים מתחת למקדם הירך 1.2 10 דקות. לאחר הזרקת חומרי ההרדמה, בדוק את רפלקס הגמילה של בעלי החיים כדי לאשר מישור כירורגי של הרדמה. לאחר מכן מרחו משחה על העיניים והתחילו בניתוח.

ראשית, גלחו בזהירות את אזור האפרכסת הרטרו כדי להתקרב לבולה, חלל האוזן התיכונה המלא באוויר. הנח את העכבר על כרית חימום בצד הניתוח באמצעות מיקרו מלקחיים. נתח בזהירות את שרירי הצוואר, כלומר הפלטיזמה, הסטרנוקלידומסטואיד והקשקשים.

עכשיו חשפו את הבולה. זהו מבנה כדורי וגרמי עם טבעת על פני השטח בו נמצא קרום התוף. בעזרת מחט אינסולין, תקעו חור ממש מתחת לטבעת מהחור.

הסר את העצם המכסה את הבולה. השתמש ב-Rons עדינים ובמיקרו מלקחיים כדי לחשוף את האודיטוריום המקצועי של השבלול בתהליך. לאחר מכן, התחל את השבלול. אוסטומיה.

ראשית יש לגלח את הקפסולה הגרמית מבלי להפריע למבוך הקרומי. כעת פתחו חלון קטן של 500 עד 800 מיקרון בסיבוב השבלול השני הרחק מהעורק הקבוע ופתח הקודקוד. הקודקוד עלול לקרוע את השבלול ולשבור את המודיס.

התכוננו למדוד תגובות אופטוגנטיות של גזע המוח השמיעתי או OABR. ראשית, הכנס אלקטרודות מחט במיקומים הבאים מתחת לאפרכסת, על הקודקוד ובגב ליד הרגליים כשהאלקטרודות מחוברות למגבר. להגביר את פוטנציאל ההבדל בין הקודקוד למחטים התת-עוריות של המסטואיד.

דגימה ב-50 קילו-הרץ וסנן את התגובות בין 1 ל-10,000 הרץ לגירוי טרנס שבלול. התקן מיקרו LED או סיב, יחד עם המיקרו LED הנאחז על ידי מניפולטור מכני. מקם אותו בזהירות במקומו.

דמיין את פוטנציאל ההבדל באוסילוסקופ. הנח אותו ליד מערך ההקלטה כך שיהיה קל לייעל את מיקום הממריץ האופטי. השתמש במיצוע אותות ואחסן את הנתונים במחשב לצורך ניתוח לא מקוון.

כעת מטב את המיקום והכיוון של המיקרו LED באמצעות תגובות לשלושה עד 10 פולסים של זרם של אלפיות השנייה ב-1 עד 5 הרץ. אפשרות נוספת היא גירוי לייזר על ידי לייזר גל רציף של 473 ננומטר המחובר לסיב אופטי של 250 מיקרומטר. זה דורש שליטה אנלוגית מהירה בכוח הלייזר או במכשיר אופטי.

עם תריס מהיר, מקמו את הסיב עם מיקרו מניפולטור ישירות על אוסטומיה של השבלול וקבעו אותו עם צמנט דנטלי לגירוי תוך השבלול. הכנס את הסיב דרך החלון העגול לתוך s Scala.Tempe. מטב את המיקום והכיוון של הסיב על ידי יצירת תגובות עם פולסים של שלושה עד 10 אלפיות השנייה של 10 עד 30 מילי-וואט ב-1 עד 5 הרץ.

מיקום הממריץ הוא השלב הקריטי ביותר לפרוטוקול. יש להעביר את המיקרו ED או את הסיב האופטי בסבלנות עד שה-OABR ניכר. ברגע שנוצרות תגובות אופטוגנטיות טובות בגזע המוח השמיעתי, תקן את הסיב עם דבק ציאנואקרילט או על ידי מלט דנטלי.

עבור פרוטוקול זה, השתמש במסגרת סטריאוטקסית והכן עכבר על ידי פתיחת הגולגולת מעל הקולוס התחתון. בעזרת מיקרוסקופ, מקם בדיקת הקלטה מעל הקולוס התחתון והכנס אותה כך שהתעלה העליונה ביותר נראית רק על פני השטח. כעת, הגבירו את פוטנציאל ההבדל בין הערוצים הבודדים של מערך ההקלטה לבין בורג הייחוס והעצם הקודקודית.

השתמש בקצב דגימה של 32 קילו-הרץ, מסנן מעביר נמוך של 300 הרץ ושמור את הנתונים. אוסטומיה אופטימלית של שבלול היא קריטית ומגדילה את ההסתברות לניסוי מוצלח. המשמעות היא שהחלון קטן באופן רגיל ואין פגיעה במבני השבלול הפנימיים.

לדוגמא, דימום מעיד על נזק ל-STR ssis באמצעות ערוץ רודן שני עכברים טרנסגניים. ערוץ רודן 2 מתבטא בתאי העצב של הכנופיה הספירלית בתוך השבלול אור כחול על ידי מיקרו LED או על ידי לייזר מעורר A BR אופטוגנטי גדול, השונה מ-A BR אקוסטי במשרעת ובצורת גל אופטוגנטית. ל-BR יש אמפליטודות גדולות יותר מאשר לאופטוגנטיקה אקוסטית של BR.

לפיכך, BR דומה יותר ל-A BR חשמלי. שניהם עשויים לגייס יותר נוירונים של גנגליון ספירלי או לעורר הפעלה מסונכרנת יותר של נוירוני הגנגליון הספירליים. התפשטות הפעילות דרך מסלול השמיעה אומתה על ידי הקלטות חוץ-תאיות במערכת השמיעה המרכזית. לדוגמה, גירוי אופטוגנטי של השבלול עורר פעילות עצבית במוח האמצעי השמיעתי.

יציבות מכנית ובידוד חשמלי בטוח של ממריצי מיקרו LED, כמו גם הימנעות מזרימת פחמן מוגזמת הם כולם גורמים קריטיים לשימוש מוצלח באופטוגנטיקה של שבלול. כשאתם מנסים את המקצוען הזה, חשוב לזכור להימנע מפגיעה בעורק ההפצה באבולה. לאחר שליטה, ניתן לבצע הקלטות מהקוליקולוס התחתון תוך כשלוש שעות אם מבוצעות כראוי.

בעקבות הליך זה א, ניתן לבצע שיטות כמו הקלטות יחידה בודדת בקוליקולוס התחתון. גירוי אופטוגנטי של מסלול השמיעה יסלול את הדרך לחוקרים במדעי המוח השמיעתי לשאול שאלות שלא ניתן היה לטפל בהן בעבר באמצעות גירוי אקוסטי או חשמלי. כמו כן, אנו מקווים שטכניקה זו תתורגם לשיקום קליני של לקות שמיעה.