Name: גירוי optogenetic של עצב השמיעה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למד גירוי אופטוגנטי של עצב השמיעה בעכברים לחקר מערכת השמיעה. שיטה זו מאפשרת רזולוציה משופרת בתדר ובעוצמה לעומת שתלים קוכליאריים מסורתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (ברנשטיין הפוקוס לNeurotechnology להעניק 01GQ0810, לט מוזר, וMED-EL גרמניה); קרן המחקר הגרמנית באמצעות המרכז עבור ננו מיקרוסקופית ופיזיולוגיה המולקולרית של המוח (FZT 103, ט מוזר) ובאמצעות SFB889, לנ &#39;Strenzke וט&#39; מוזר).

כל הניסויים שהוצגו בעבודה זו נערכו עם הסטנדרטים האתיים שהוגדרו על ידי החוק הגרמני להגנה על חיות מעבדה. לוח אוניברסיטת גטינגן לרווחת בעלי החיים והמשרד לרווחת בעלי החיים של מדינת סקסוניה התחתונה אישרו את הניסויים. .1 הכנת μLED-ממריץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לμLEDs, להכין μLED-ממריץ ראשון. השתמש בנוריות כחולות עם 200 ידי 200 מיקרומטר משטח פעיל (μLED, לראות לוח חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוטי הלחמה לμLED. לאחר מכן, לתמצת μLED וחיבורים באמצעות דבק אפוקסי. השאר את לילה המכשיר כדי לאפשר ריפוי אפוקסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליציבות מכאנית ובידוד חשמלי לנתב את החוטים דרך נימי זכוכית דקות, להשתמש נימי ורוסיליקט קוטר חיצוני 1 מ&quot;מ ולאטום את הצומת עם אפוקסי (1D איור) באופן שהנימים יכולות להיות מותקנות על מניפולטור מכאני. הערה: Tכאן היא תחלופה של מה שהופך את הקפסולה עבה מספיק כדי לקבל בידוד חשמלי טוב (הימנעות חפצי גירוי), אבל דקה מספיק כדי לתת LED לנוע בחופשיות בתוך הבולה ולאתר אותו על cochleostomy. זה תרגול טוב כדי להכין LED יותר מפעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאשר את הבידוד חשמלי טוב, להכין ראשון צלחת פטרי עם 0.9% NaCl ו3 חוטי נחושת לטבול הסתיימו חשופים לתוך הנוזל. זה משמש כדי לדמות חיה עם אלקטרודות ABR. לחבר את החוטים לABR-המגבר ומשם לאוסצילוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, לחבר את LED לממריץ ולטבול אותו לתוך התמיסה עד שהוא מכוסה לחלוטין. כונן LED עם קטניות (ראה שלב 3.1.1) בשעה הנוכחית המרבי המוותרות לזמן רב יותר מאשר 20 דקות ולבדוק חפצי גירוי. אם הם מופיעים, לבטל את LED ולנסות אחד חדש. </li></ol> 2 נוהל כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 4-10 עכברי בן שבוע מהונדסים מבטא ChR2 תחת אמרגן Thy1.2 (קו 9ובואנג et al. 13). כדי לתפעל את בעלי החיים ולבצע את הניתוח, תמיד להשתמש בכלים כירורגיים נקיים ומזוהים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי חיות עם זריקת ip של תערובת של אורתן (1.32 מ&quot;ג / קילוגרם), xylazine (5 מ&quot;ג / קילוגרם), ו0.1 מיקרוגרם / g עצירות מדוללת ב0.9% פתרון NaCl סטרילי ולמקם את העכבר על גבי צלחת חימום לשמירה על גוף טמפרטורה על 37 C °. עם מינון זה, הרדמה בדרך כלל נמשך לכל פרוטוקול הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 10 דקות לאחר בדיקת אינדוקציה הרדמה ראשונית לסימנים של עוררות על ידי רפלקס נסיגת כפה. במקרה של תנועות, להחיל מנות אחזקה של אורתן (.66 מ&quot;ג / קילוגרם) ועצירות (0.05 מיקרוגרם / g) בדילול מלא ב0.9% פתרון NaCl סטרילי (בלי Xylazine). שוב לבדוק את רפלקס נסיגת הכפה ולהמשיך רק אם רפלקס נעדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח בזהירות את אזור retroauricular בהכנה של החתך. השתמש retroauricularלהתקרב כדי להגיע לבולה (חלל אוזן התיכון המכיל אוויר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים מיקרו לנתח בזהירות ו / או להסיר חלק משרירי הצוואר, למשל, platysma, sternocleidomastoid, וscalenes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא ולחשוף את הבולה (איור 1 א). זהה את הבולה כמבנה גרמי עם צורה כדורית אופיינית עם טבעת על פני השטח הבולה המציינת את הכניסה של עור התוף (איור 1 א). לעשות חור עם קצה מחט אינסולין ממש מתחת טבעת זו. להתחיל שם, להסיר את העצם שמכסה את הבולה עם Rongeur קנס (gnawer) או microforceps באופן כזה שpromontorium של השבלול נחשף (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לcochleostomy, בעדינות לגלח את הכמוסה הגרמית כדי לפתוח חלון קטן (cochleostomy: ~ 500-800 מיקרומטר), מקפיד להשאיר על כנה את המבוך הקרומי (איור 1). בצע cochleostomy על השבלול השנילהפוך כפי שהוא רחוק מספיק מעורק stapedial ומהשיא. פתיחת הקודקוד יכול לייצר קרע של השבלול כולל בר של modiolus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכניסת חלון עגולה של סיבים אופטיים או μLED-שתל להלמותו סקאלה, להגדיל את חלון הנישה העגולה בקפידה על ידי מגרד את הנישה הגרמית עם הקצה של סכין מנתחים חדים (מספר להב 11 הוא אפשרות טובה). השתמש תמיד בלהב או אזמל חדש. להיות מאוד זהיר לגבי עורק stapedial פועל קרוב מאוד לחלון העגול (איור 1). </li></ol> .3 אופטי גירוי באמצעות שתי גישות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגירוי transcochlear, μLEDs שימוש או סיב לייזר בשילוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר נימי ביצוע μLED על מניפולטור מכאני ובזהירות למקם את μLED על cochleostomy. השימוש oABR, שהושרו על ידי 3-10 גירוי ארוך אלפיות שני ממקור זרם (בדרך כלל 5-40 mA ב2.7 V) בשעה 1-5 הרץ, כאמצעי כדי לייעל את המיקום ואוientation של μLED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגירוי לייזר, להשתמש בליזר 473 ננומטר רציף גל וסיבים אופטיים 250 מיקרומטר (ראה חומרים). זוג הסיבים האופטיים למקור לייזר כחול שבאופן אידיאלי מציע שליטה אנלוגית מהירה של כוח (אחר להשתמש מכשיר acousto אופטי או תריס מהיר להגדיר הגירוי האופטי). באמצעות micromanipulator, לאתר את קצה הסיב ישירות על גבי cochleostomy ולתקן אותה לשם בעזרת מלט (גירוי transcochlear) שיניים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגירוי intracochlear, להכניס את הסיבים דרך החלון העגול לתוך הלמותו סקאלה. לאחר מכן, השתמש 3-10 פעימות לייזר אלפיות של 10-30 mW (כוחו של פלט סיבים) בשעה 1-5 הרץ לעורר oABR. משרעת הגדולה של oABR מאפשרת הנסיין להתבונן oABR עורר על ידי גירויים יחידים באוסצילוסקופ לייעול העמדה והכיוון של הפולט (μLED או סיבים) באמצעות משרעת oABR כקריאה החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שoABR הטוב הושג, לתקן את הסיבים עם cyanoacrדבק ylate או מלט שיניים ולחכות עד שהדבק הוא מוצק. הערה: זה נורמלי לראות כמה נוזל שיוצא מהשבלול. עם זאת, כדי למנוע בעיות עם פילמור של המלט, מומלץ לייבש את האזור באמצעות פתילות כותנה משובחות. </li></ol> .4 הקלטות של oABR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס אלקטרודות מחט מתחת לפינה, על הקודקוד ועל הגב ליד הרגליים ולחבר אותם למגבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את פוטנציאל ההבדל בין הקודקוד ופטם מחטי subdermal. לדוגמא בשיעור של 50 kHz ומסנן (1-10,000 Hz). דמיין את פוטנציאל ההבדל באוסצילוסקופ באופן אידיאלי ליד הגדרת ההקלטה לייעול העמדה של ממריץ האופטי. השתמש במיצוע אות (50-1,000x) ולאחסן את הנתונים במחשב לניתוח במצב לא מקוון. </li></ol> .5 הקלטות של פוטנציאלים אופטי עוררתי מקומי שדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה לתוך מסגרת stereotactic. שימוש באחוזי מלקחייםהעצרת למשוך את העור שמעל הגולגולת ולבצע חתך חציון עם מספריים הארכה בערך מבין העיניים לנקודה שבה שרירי הצוואר לצרף לגולגולת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקף את העור רוחבי. חותך את קרום העצם לאורך לאורך תפר sagittal ולהסיר אותו צידה בעדינות על ידי שפשוף עצם הגולגולת החשוף עם מקלון צמר גפן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם לוחית מתכת מותאמת אישית על הגולגולת החשופה משאירה כ 1 מרחב מ&quot;מ בין קצה הזנב של הצלחת ולמבדה. עם קוטר 0.7 מ&quot;מ לקדוח בזהירות לקדוח חור לתוך העצם הקודקודית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לדפוק בבורג בקוטר 0.85 מ&quot;מ - לשמש כהתייחסות לפוטנציאלים שנרשמו מcolliculus הנחות (IC) - מחזיק את הבורג עם מלקחיים עוד הבורג לא מהודק. להבטיח קשר טוב בין הבורג ודורה בלי לחדור למוח. מדביק את הבורג ולוחית המתכת על גבי הגולגולת עם דבק cyanoacrylate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את nשרירי Eck בעדינות מהגולגולת. משוך את שרירי צוואר caudally למ&quot;מ 1-2 בערך. זהה את הצומת של סינוס מעולה sagittal (SSS) וסינוס הרוחבי (TS). במידת צורך, להגביר את השקיפות של הגולגולת על ידי הרטבת העצם עם פתרון NaCl פיסיולוגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את IC בעכברים כשוכבים ישירות זנב לצומת SSS וTS. לאחר זיהוי של המיקום של IC לאט ובזהירות לבצע בערך בקידוח הארכה 0.5 מ&quot;מ rostrally 1.5 מ&quot;מ caudally לTS ובערך 3 מ&quot;מ רוחבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע מכל פגיעה בSSS וTS כמו אלה ימנעו ניסוי מוצלח. כאן, לבדוק אם העצם החלול שהפך רפוי על ידי ברכות דוחפים אותו. שימוש במלקחיים לאט להרים את העצם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מתאם מתאים לצרף מערך רב ערוצי וheadstage על micromanipulator. כדי למנוע הרס מערך הקלטה רבת ערוצים בעת ההכנסה לתוך IC, בזהירות להסיר את הדורהעם קצה מכופף של מחט מזרק קטנה מתחיל קרוב לקצה עצם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החיה מהמסגרת stereotaxic. לתקן את לוחית המתכת על הבר להישאר קיבעון stereotaxic. מקם את הבדיקה ההקלטה על IC ולהכניס אותו תחת שליטה מיקרוסקופית כאלה שברוב הערוץ העליון הוא רק גלוי על פני השטח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגביר את פוטנציאל ההבדל בין הערוצים הבודדים של מערך ההקלטה ובורג ההתייחסות בעצמות הקודקודית, מדגם בשיעור של 32 kHz, מסנן נמוך לעבור (300 הרץ) וחנות במחשב לניתוח במצב לא מקוון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל בעלי החיים צריכים להיות מורדמים באנושיות בסוף ההליך לפני התאוששות הרדמה בהתאם להנחיות המתת חסד רלוונטיות. שיטות מתאימות של המתת חסד עשויות לכלול נקע בצוואר הרחם או משאיפת CO 2. </li></ol>

<ol><li>Rubinstein, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paediatric+cochlear+implantation%3A+prosthetic+hearing+and+language+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development.</a> Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).</li>
<li>Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+the+view+from+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: the view from the brain.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).</li>
<li>Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple-channel+cochlear+implant%3A+the+interface+between+sound+and+the+central+nervous+system+for+hearing%2C+speech%2C+and+language+in+deaf+people-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+sciences%22%5BJournal%5D)">The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).</li>
<li>Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+system+design%2C+integration%2C+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+reviews+in+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: system design, integration, and evaluation.</a> IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).</li>
<li>Wilson, B. S., Dorman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+a+remarkable+past+and+a+brilliant+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future.</a> Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).</li>
<li>Moore, D. R., Shannon, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+cochlear+implants%3A+awakening+the+deafened+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain.</a> Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).</li>
<li>Shannon, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+electrical+stimulation+of+the+auditory+nerve+in+man.+II.+Channel+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction.</a> Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).</li>
<li>Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+as+a+function+of+the+number+of+electrodes+used+in+the+SPEAK+cochlear+implant+speech+processor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+speech%2C+language%2C+and+hearing+research%3A+JSLHR%22%5BJournal%5D)">Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor.</a> Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).</li>
<li>Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+resolution+of+cochlear+implants%3A+the+electrical+field+and+excitation+of+auditory+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents.</a> Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).</li>
<li>Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system%3A+a+comparison+of+optic+and+electric+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli.</a> Journal of biomedical. 12 (2), 021008(2007).</li>
<li>Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+cochlear+excitation+during+stimulation+with+pulsed+infrared+radiation%3A+inferior+colliculus+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements.</a> Journal of neural engineering. 8 (5), 056006(2011).</li>
<li>Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+events+and+%E2%80%9Coptophonic%E2%80%9D+cochlear+responses+induced+by+pulsed+near-infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+bio-medical+engineering%22%5BJournal%5D)">Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser.</a> IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li>
<li>Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca2%2B-permeable+channelrhodopsin+CatCh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+in+noise+as+a+function+of+the+number+of+spectral+channels%3A+comparison+of+acoustic+hearing+and+cochlear+implants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).</li>
<li>Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place-pitch+discrimination+of+single-+versus+dual-electrode+stimuli+by+cochlear+implant+users+%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L).</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).</li>
<li>Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+virtual+channel+discrimination+in+a+multi-channel+context%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context.</a> Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).</li>
<li>Zeng, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+dynamic+range+and+its+effect+on+cochlear+implant+performance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).</li>
<li>Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+extent+of+cochlear+infrared+neural+stimulation+determined+by+tone-on-light+masking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking.</a> Journal of biomedical. 16 (11), 118002(2011).</li>
<li>Verma, R., Guex, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+responses+to+electric+and+infrared+neural+stimulation+of+the+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus.</a> Hearing research. 310, 69-75 (2014).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Hegemann, P., Nagel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+channelrhodopsins+to+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">From channelrhodopsins to optogenetics.</a> EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsins%3A+directly+light-gated+cation+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels.</a> Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).</li>
<li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+characteristics+of+the+photocycle+of+channelrhodopsin-2+and+its+implication+for+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function.</a> Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).</li>
<li>Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+light-induced+structural+changes+of+Channelrhodopsin-2+by+UV-visible+and+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).</li>
<li>Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+open+states+with+progressive+proton+selectivities+in+the+branched+channelrhodopsin-2+photocycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle.</a> Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).</li>
<li>Hegemann, P., Möglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin+engineering+and+exploration+of+new+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools.</a> Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).</li>
<li>Mattis, J., Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Transgenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li>
<li>Tomita, H., Sugano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Properties+of+Transgenic+Rats+Harboring+the+Channelrhodopsin-2+Gene+Regulated+by+the+Thy-1.2+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter.</a> PLoS ONE. 4 (11), e7679(2009).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הניסויים שתוארו להפגין גירוי optogenetic של SGNs, ויכולים, בעיקרון, לשמש גם כדי לעורר תאי שיער פנימיים ו / או חיצוניים, הניתנים הביטוי לopsins. ניסויים אלה דורשים סבלנות וטיפול הרבה. כפי שהוזכר קודם, השלבים הקריטיים ביותר הם cochleostomy / הכנסה טובה עגולה חלון, כמו גם מיקום מתאים וכיוון של מקור האור. יש מגבלות עם גירוי optogenetic בעת שימוש ChR2. במקרה העליות משרעת oABR שלנו עם עוצמת אור ומשך דופק אבל יורד כאשר ...

על פי ארגון הבריאות העולמי, 360 מיליון אנשים ברחבי העולם סובלים מאובדן שמיעה. בנושאים חירשים, גירוי חשמלי ישיר של SGNs על ידי חבר העמים לאפשר הבנת דיבור פתוחה ברובם 1,2,4,5. למרות שחבר עמים כבר מושתלים בלמעלה מ -200,000 בני אדם, ולכן להיות neuroprosthesis המוצלח ביותר, קידוד קול מונע על ידי שתלי השבלול הנוכחיים הוא מוגבל. חבר העמים מבוססים על גירוי חשמלי על ידי מספר מסוים של אלקטרודות שבו כל אחד מפעיל אזור tonotopic של עצב השמיעה ובכך עוקף את איבר החישה מתפקד של קורטי שבשבלול האוזן. מאזיני שמיעה נורמלים יכולים להפלות יותר מ 2,000 תדרים, אך חבר העמים של היום להשתמש רק עד 12-22 ערוצי תדר 4. זאת בשל זרימה נוכחית נפוצה מכל אלקטרודה מגרה 7,9, הפעלה מספר רב של SGNs המייצגים תדרי קול שונים 8,15. זההגבלה ניתן לשפר באמצעות גירוי קוטבי אבל על חשבון צריכת חשמל גבוה יותר 16,17. הטווח הדינמי התפוקה שלהם לעוצמת קול הוא גם מוגבל, בדרך כלל מתחת ל6-20 dB 4,18. מסיבות אלה, תדירות שיפור ורזולוציה עוצמה הן מטרות חשובות להגדלת ביצועים של CI לשיפור זיהוי דיבור בסביבה רועשת, הבנת הפרוזודיה ותפיסת מוסיקה. אפשרות אחרת כדי לעורר את עצב השמיעה היא גירוי אופטי. אור יכול להיות ממוקד במקום נוח למקד אוכלוסיית SGN קטנה, מבטיח כליאת מרחבית טובה יותר, להגדיל את הרזולוציה בתדר וגם הרחבת טווח דינמי, וכתוצאה מכך רזולוציה עוצמה טובה יותר. ואכן, גירוי שבלול עם אור אינפרא אדום הראה רזולוציה תדר מצוינת במודלים של בעלי חיים 10,11,19. חסרון אחד של גירוי מסוג זה הוא שהיא דורשת אנרגיות גבוהות יותר מאשר גירוי חשמלי <sup&gt; 10,11. יתר על כן, חששות לגבי יכולתה של השיטה כדי לעורר ישירות נוירונים שמיעתיים הועלו 12,20. כחלופה לגירוי אינפרא אדום, אנחנו מעסיקים optogenetics כדי להבהיר SGNs רגיש לאור. Optogenetics היא גישה חדשנית המשלבת טכניקות גנטיות ואופטיות להלא פולשני ובמיוחד לשלוט תאים עם דיוק גבוה זמני (ביקורות 21- 23). השיטה כיום הנפוצה ביותר בשימוש מעסיקה הביטוי של גן חיידקי channelrhodopsin 2 (ChR2) של Chlamydomonas reinhardtii וגרסותיהם, קידוד ערוץ קטיון מגודרת אור 24. ChR2 הוא חלבון 7-הטרנסממברני סליל ש, כאשר transduced לתוך הנוירונים ומופעלים על ידי אור הכחול, פועל ערוץ קטיון כהלא סלקטיבי, ובכך depolarizing התאים 24- 27. ChR2 התאפיין גם ביום 31 ב24,28- וריאנטים רבים פותחו כדי לשנות actioספקטרום n, תכונות gating וחדירות 32,33. מטרת העבודה שלנו היא להקים optogenetics שבלול להפעלה של מסלול השמיעה. נציין כי גישת optogenetic כדי לעורר את עצב השמיעה דורשת מניפולציה גנטית של הגנגליון הספירלה לביטוי של channelrhodopsin. עבודה עם עכברים וחולדות מאפשרת שימוש בבעלי החיים מהונדסים זמינים 13,34,35, המספקים ביטוי של channelrhodopsin עם שונות קטנות לאורך ציר tonotopic ועל פני בעלי חיים 36. שילוב אללים מותנים 37 עם Cre-קווים מתאימים מספק לביטוי תא ספציפי. העברת גנים לתוך הגנגליון הספירלה של בעלי חיים אחרים, דורשת שימוש בוירוס כגון וירוס adeno הקשורים שהיא גישה סטנדרטית בoptogenetics 38 ושאנחנו הראו לעבוד גם בעכברים 36. מניפולציה וביטוי של גנים מושתלים של קידוד חלבונים זרים סיכוני דוב לתופעות לוואי כגון אימונוגלובולינ גנטיתגובות ne ו / או הפצה, מצב התפשר ואפילו למוות של תאי מניפולציות גנטיים. לצורך הדגמה זו אנו משתמשים בעכברים מהונדסים מבטא ChR2 בנוירונים הגנגליון ספירלה תחת promotor Thy-1 13 כדי לעורר את המסלול השמיעתי אופטי. נציין, כי גרסאות channelrhodopsin אחרות יכולות לשמש לאותה המטרה כפי שהראינו באמצעות העברת וירוס בתיווך של לתפוס גרסת 14 לSGNs 39. בעוד optogenetics שבלול דורש מניפולציה גנטית, היא מציעה כוונון מולקולרי לגירוי SGN מותאם והבטחות השתפרו תדר ורזולוציה עוצמה בהשוואה לגירוי חשמלי. גירוי optogenetic של מסלול השמיעה הוא רלוונטי ביותר לדיון מחקר. לדוגמא, היא מבטיחה התקדמות במחקרים של עידון הפעילות תלויה של tonotopy במהלך פיתוח, בניתוח של הדרישה לשילוב של רוח רפאים בlocalizat קוליון ועל מידת האינטראקציה בין תחזיות מביא תדר ספציפי במערכת השמיעה המרכזית.

<table><tbody><tr><td>Urethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U2500-100G</td><td>חומר הרדמה</td></tr><tr><td>קסילזין HCl</td><td>RXV</td><td></td><td>הרגעה ומשכך כאבים</td></tr><tr><td>בופרנורפין</td><td>רקיט בנקיזר</td><td></td><td>משכך כאבים</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>הוא משמש להחזקת רקמות קשות, למשל עצם או חומרים. לעולם אל תשתמש בהם להחזקת רקמות עדינות רכות&nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont #5 - מלקחיים עדינים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11254-20</td><td>לשימוש רק להחזקת רקמות רכות</td></tr><tr><td>מספריים עדינים - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>לפתיחת העור ועזרה בדיסקציה של השרירים</td></tr><tr><td>Lempert Rongeurs&nbsp;</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>16004-16</td><td>הם שימושיים מאוד להסרת העצם בקלות מהלייזר בולה</td></tr><tr><td>473 ננומטר&nbsp;</td><td>צ'אנגצ'ון תעשיות חדשות</td><td>MLL-III473</td><td>100 mW מצב מוצק 473 ננומטר</td></tr><tr><td>לייזר דרייבר&nbsp;</td><td>צ'אנגצ'ון תעשיות חדשות</td><td>DPSSL MLL 100 mW</td><td>TTL מופעל דרייבר לייזר</td></tr><tr><td>250 ומיקרו; m סיבים אופטיים</td><td>כל מסחרי; למשל Thorlabs</td><td>M42L05</td><td></td></tr><tr><td>Acousto-optical modulator</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>PCAOM VIS</td><td>שלוט בכמות האור המשולבת לסיב מבקר הלייזר</td></tr><tr><td>עבור מודולטור Acousto-optical</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>160T1-8SAR-24-0.8</td><td>שלוט במודולטור האקוסטו-אופטי</td></tr><tr><td>Solo2 מד כוח ואנרגיה לייזר</td><td>Gentec-EO</td><td></td><td>משמש למדידת עוצמת האור של ה-LED והלייזר המשולב בסיבים</td></tr><tr><td>כחול ומיקרו; לד</td><td>קרי</td><td>C470UT200</td><td>יש צורך לבנות כמה &mu; מכשירי LED מכיוון שנפגעים בקלות או שהבידוד אינו מספיק טוב</td></tr><tr><td>מערכת TDT&nbsp;</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td>RZ6-A-P1</td><td>ניתן להשתמש בו בכל מערכת ליצירת גירויים&nbsp; הצגה ורכישת נתונים</td></tr><tr><td>שוק יחיד, בדיקת סיליקון 16 ערוצים</td><td>Neuronexus</td><td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&nbsp;</td><td>מדובר במכשירים שבירים, יש לטפל בהם בזהירות ולנקות אותם לאחר השימוש</td></tr><tr><td>Omnidrill</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>לבצע קרניוטומיה עבור הקלטות IC והשתלת בורג ייחוס</td></tr><tr><td>מיקרו מקדחה פלדה קוצים</td><td>כל פרסומת; למשל Fine Science</td><td>Tools 19007-07</td><td></td></tr><tr><td>בורג עצם הקשה עצמית</td><td>כל פרסומת; למשל Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>בורג ייחוס</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>כל פרסומת; e. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 ציר</td><td></td><td>מיקום של בדיקת הקלטה</td></tr></tbody></table>

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

גירוי חשמלי ישיר של תאי עצב הגנגליון ספירלה (SGNs) על ידי שתלי שבלול (CIS) מאפשר הבנת דיבור פתוחה ברוב המכריע של נושאים חירשים מושתלים 1 6. יחד עם זאת, קידוד קול עם חבר העמים הנוכחיים יש תדר עני ורזולוציה עוצמה בשל התפשטות נוכחית רחבה מכל מגע אלקטרודה הפעלת מספר רב של SGNs לאורך ציר tonotopic של השבלול 7- 9. גירוי אופטי מוצע כחלופה לגירוי חשמלי שמבטיחה מרחבית יותר מרותק הפעלה של SGNs ו, ומכאן, ברזולוציה תדר גבוהה יותר של קידוד. בשנים האחרונות, תאורת אינפרא אדום ישירה של השבלול נעשתה שימוש כדי לעורר תגובות בעצב השמיעה 10. אף על פי כן היא דורשת אנרגיות גבוהות יותר מאשר גירוי חשמלי 10,11 ועדיין אי ודאות לגבי המנגנון הבסיסי 12. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על optogenetics כדי לעורר SGNsעם אור כחול בעצימות נמוכות, תוך שימוש בעכברים מהונדסים עם ביטוי עצבי של channelrhodopsin 2 (ChR2) 13 או ביטוי וירוס בתיווך של לתפוס ChR2-גרסת 14. אנחנו השתמשנו מייקר דיודות פולטות אור (μLEDs) ולייזרים בשילוב סיבים כדי לעורר SGNs ChR2 להביע דרך פתח קטן מלאכותי (cochleostomy) או החלון העגול. אנו assayed התשובות על פי הקלטות קרקפת של פוטנציאלי אור עורר (תגובת optogenetic השמיעתית בגזע המוח: oABR) או על ידי הקלטות microelectrode מהמסלול השמיעתי והשוו אותם עם גירוי אקוסטי והחשמלי.

Cochleostomy אופטימלי הוא קריטי ומגדיל את ההסתברות של ניסוי מוצלח. משמעות דבר היא החלון הוא רגיל, קטן, ואין שום פציעתם של מבני שבלול הפנימיים. לדוגמא, דימום מצביע על נזק של vascularis stria. דוגמא טובה מוצגת באיור 1 ב. באמצעות עכברי ChR2-מהונדסים, ChR2 בא לידי הביטוי בSGNs בתוך שבלול האוזן (איור 1 ג). תאורת אור כחולה, או על ידי μLED או לייזר, מעוררת oABR הגדול, ש...

שתלי שבלול (CIS) לאפשר שמיעה על ידי גירוי חשמלי ישיר של עצב השמיעה. עם זאת, תדירות עניה ורזולוציה עוצמה מגבילה את איכות שמיעה עם מדינות חבר העמים. כאן אנו מתארים גירוי optogenetic של עצב השמיעה בעכברים כאסטרטגיה חלופית למחקר שמיעתי ופיתוח CIS עתיד.

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעורר אופטית את עצב השמיעה של בעלי חיים עם נוירונים גנגליונים ספירליים שעברו שינוי אופטוגנטי. זה מושג על ידי הכנה תחילה של ממריץ מיקרו LED כחול או סיב אופטי המחובר ללייזר כחול. השלב הבא בהליך הוא הערכת השבלול באמצעות גישה מיקרו-כירורגית רטרו אפרכסת.השלב השלישי הוא למקם את הממריץ האופטי כדי להקליט תגובות גזע מוח מעוררות אופטית. השלב האחרון הוא לגשת לקולוס התחתון כדי לתעד פעילות מעוררת אופטית. בסופו של דבר, התוצאות יכולות להראות גירוי מוצלח של מערכת השמיעה באמצעות הקלטות של תגובות גזע המוח השמיעתי ופוטנציאל השדה המקומי.בקוליקולוס התחתון גירוי אופטוגנטי של עצב השמיעה. כחלופה לחשמל, שתלי שבלול מבטיחים רזולוציית תדר ועוצמה טובה יותר. זה מעניין מאוד למחקר אודיטורים, אבל ההשלכות של הטכניקה הזאת מתרחבות לשיפור שיקום השמיעה אצל חירשים.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר שמיעתי, כגון תפקיד פעילות הדפוס לחידוד ההתפתחות האורתופדית, הדרישה לאינטגרציה ספקטרלית בלוקליזציה של תאים, ומידת האינטראקציה בין הקרנות מסגרת ספציפיות לתדר. במערכת השמיעה המרכזית, הדגמה חזותית של ההליך היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את המיקום והכיוון המתאימים של המיקרו LED או הסיב האופטי. ממריץ המיקרו LED משתמש בנורת LED כחולה עם משטח פעיל של 200 מיקרון מרובע חוטי הלחמה ראשונים למיקרו LED.לאחר מכן, בעזרת אפוקסי עוטפים את הנורית ואת החיבור שלה, מאפשרים לה להתייבש למשך הלילה. לאחר הריפוי, הזינו את החוטים דרך קוטר חיצוני של מילימטר אחד. לשאול נימי זכוכית סיליקט.הזכוכית מספקת יציבות מכנית ובידוד חשמלי. אטום את צומת הנימים והנורית המצופה אפוקסי עם יותר אפוקסי מקם את הנימים כך שניתן יהיה להרכיב אותו על מניפולטור. כעת בדוק את חיבורי החשמל.ראשית, הכינו שלושה חוטי נחושת. טבלו קצה אחד של כל אחד מהם באמבט נתרן כלורי 0.9%. לאחר מכן חבר את הקצוות האחרים שלהם למגבר A BR.עקוב אחר האות באמצעות אוסצילוסקופ. לאחר מכן, חבר את המיקרו LED לממריץ המותאם אישית לבדיקה. טבלו את המיקרו LED המחובר לסטימולטור באמבטיה והפעילו את הנורית למשך 20 דקות לפחות.תוך כדי גירוי ה-LED צג את האוסילוסקופ לאיתור חפצים. השלך את כל נוריות ה-LED הפגומות. להרדים עכבר בן ארבעה עד 10 שבועות.עכבר זה מבטא אופסין ערוץ שניים מתחת למקדם הירך 1.2 10 דקות. לאחר הזרקת חומרי ההרדמה, בדוק את רפלקס הגמילה של בעלי החיים כדי לאשר מישור כירורגי של הרדמה. לאחר מכן מרחו משחה על העיניים והתחילו בניתוח.ראשית, גלחו בזהירות את אזור האפרכסת הרטרו כדי להתקרב לבולה, חלל האוזן התיכונה המלא באוויר. הנח את העכבר על כרית חימום בצד הניתוח באמצעות מיקרו מלקחיים. נתח בזהירות את שרירי הצוואר, כלומר הפלטיזמה, הסטרנוקלידומסטואיד והקשקשים.עכשיו חשפו את הבולה. זהו מבנה כדורי וגרמי עם טבעת על פני השטח בו נמצא קרום התוף. בעזרת מחט אינסולין, תקעו חור ממש מתחת לטבעת מהחור.הסר את העצם המכסה את הבולה. השתמש ב-Rons עדינים ובמיקרו מלקחיים כדי לחשוף את האודיטוריום המקצועי של השבלול בתהליך. לאחר מכן, התחל את השבלול. אוסטומיה.ראשית יש לגלח את הקפסולה הגרמית מבלי להפריע למבוך הקרומי. כעת פתחו חלון קטן של 500 עד 800 מיקרון בסיבוב השבלול השני הרחק מהעורק הקבוע ופתח הקודקוד. הקודקוד עלול לקרוע את השבלול ולשבור את המודיס.התכוננו למדוד תגובות אופטוגנטיות של גזע המוח השמיעתי או OABR. ראשית, הכנס אלקטרודות מחט במיקומים הבאים מתחת לאפרכסת, על הקודקוד ובגב ליד הרגליים כשהאלקטרודות מחוברות למגבר. להגביר את פוטנציאל ההבדל בין הקודקוד למחטים התת-עוריות של המסטואיד.דגימה ב-50 קילו-הרץ וסנן את התגובות בין 1 ל-10,000 הרץ לגירוי טרנס שבלול. התקן מיקרו LED או סיב, יחד עם המיקרו LED הנאחז על ידי מניפולטור מכני. מקם אותו בזהירות במקומו.דמיין את פוטנציאל ההבדל באוסילוסקופ. הנח אותו ליד מערך ההקלטה כך שיהיה קל לייעל את מיקום הממריץ האופטי. השתמש במיצוע אותות ואחסן את הנתונים במחשב לצורך ניתוח לא מקוון.כעת מטב את המיקום והכיוון של המיקרו LED באמצעות תגובות לשלושה עד 10 פולסים של זרם של אלפיות השנייה ב-1 עד 5 הרץ. אפשרות נוספת היא גירוי לייזר על ידי לייזר גל רציף של 473 ננומטר המחובר לסיב אופטי של 250 מיקרומטר. זה דורש שליטה אנלוגית מהירה בכוח הלייזר או במכשיר אופטי.עם תריס מהיר, מקמו את הסיב עם מיקרו מניפולטור ישירות על אוסטומיה של השבלול וקבעו אותו עם צמנט דנטלי לגירוי תוך השבלול. הכנס את הסיב דרך החלון העגול לתוך s Scala.Tempe. מטב את המיקום והכיוון של הסיב על ידי יצירת תגובות עם פולסים של שלושה עד 10 אלפיות השנייה של 10 עד 30 מילי-וואט ב-1 עד 5 הרץ.מיקום הממריץ הוא השלב הקריטי ביותר לפרוטוקול. יש להעביר את המיקרו ED או את הסיב האופטי בסבלנות עד שה-OABR ניכר. ברגע שנוצרות תגובות אופטוגנטיות טובות בגזע המוח השמיעתי, תקן את הסיב עם דבק ציאנואקרילט או על ידי מלט דנטלי.עבור פרוטוקול זה, השתמש במסגרת סטריאוטקסית והכן עכבר על ידי פתיחת הגולגולת מעל הקולוס התחתון. בעזרת מיקרוסקופ, מקם בדיקת הקלטה מעל הקולוס התחתון והכנס אותה כך שהתעלה העליונה ביותר נראית רק על פני השטח. כעת, הגבירו את פוטנציאל ההבדל בין הערוצים הבודדים של מערך ההקלטה לבין בורג הייחוס והעצם הקודקודית.השתמש בקצב דגימה של 32 קילו-הרץ, מסנן מעביר נמוך של 300 הרץ ושמור את הנתונים. אוסטומיה אופטימלית של שבלול היא קריטית ומגדילה את ההסתברות לניסוי מוצלח. המשמעות היא שהחלון קטן באופן רגיל ואין פגיעה במבני השבלול הפנימיים.לדוגמא, דימום מעיד על נזק ל-STR ssis באמצעות ערוץ רודן שני עכברים טרנסגניים. ערוץ רודן 2 מתבטא בתאי העצב של הכנופיה הספירלית בתוך השבלול אור כחול על ידי מיקרו LED או על ידי לייזר מעורר A BR אופטוגנטי גדול, השונה מ-A BR אקוסטי במשרעת ובצורת גל אופטוגנטית. ל-BR יש אמפליטודות גדולות יותר מאשר לאופטוגנטיקה אקוסטית של BR.לפיכך, BR דומה יותר ל-A BR חשמלי. שניהם עשויים לגייס יותר נוירונים של גנגליון ספירלי או לעורר הפעלה מסונכרנת יותר של נוירוני הגנגליון הספירליים. התפשטות הפעילות דרך מסלול השמיעה אומתה על ידי הקלטות חוץ-תאיות במערכת השמיעה המרכזית. לדוגמה, גירוי אופטוגנטי של השבלול עורר פעילות עצבית במוח האמצעי השמיעתי.יציבות מכנית ובידוד חשמלי בטוח של ממריצי מיקרו LED, כמו גם הימנעות מזרימת פחמן מוגזמת הם כולם גורמים קריטיים לשימוש מוצלח באופטוגנטיקה של שבלול. כשאתם מנסים את המקצוען הזה, חשוב לזכור להימנע מפגיעה בעורק ההפצה באבולה. לאחר שליטה, ניתן לבצע הקלטות מהקוליקולוס התחתון תוך כשלוש שעות אם מבוצעות כראוי.בעקבות הליך זה א, ניתן לבצע שיטות כמו הקלטות יחידה בודדת בקוליקולוס התחתון. גירוי אופטוגנטי של מסלול השמיעה יסלול את הדרך לחוקרים במדעי המוח השמיעתי לשאול שאלות שלא ניתן היה לטפל בהן בעבר באמצעות גירוי אקוסטי או חשמלי. כמו כן, אנו מקווים שטכניקה זו תתורגם לשיקום קליני של לקות שמיעה.

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

היישום של הפרדיגמה התניה קלאסית פחד התנהגותי על השמיעה תותבת מחקר בחולדות מתואר. פרדיגמה זו מספקת מנגנון לזיהוי הן גילוי של, ואפליה בין, אקוסטית ברורים גירויים חשמליים באמצעות קצב הלב כמדד התוצאה.

קביעת ההתנהגות של אפליה Stimulus זוג אקוסטית שמיעתית גירויים חשמליים באמצעות התניה קלאסית ואת קצב הלב גישה

מקור: Kozin, E. D., et.al. הדמיה ישירה של גרעין השבלול הגבי של העכברים לגירוי אופטוגנטי של מסלול השמיעה. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר (DCN) כדי לאפשר גירוי שמיעתי המושרה על ידי אור. וקטור ויראלי המקודד אופסין, תעלת יונים רגישה לאור, מוזרק לתוך ה-DCN לאחר קרניוטומיה ושאיפת מוח לגישה ישירה. האופסינים המבוטאים מאפשרים להפעיל נוירונים על ידי אור, ומספקים מודל לחקר תגובות מסלול השמיעה באמצעות אופטוגנטיקה.

העברת גנים בתיווך וירוס לגרעין השבלול הגבי של העכבר לגירוי שמיעתי המושרה על ידי אור

סרטון זה מדגים פרוטוקול לגירוי שורש עצב השמיעה ולרישום זרמים פוסט-סינפטיים בנוירונים אוליבוקוכלריים מדיאליים בפרוסות טריז במוח עכבר.

גירוי שורש עצב שמיעתי והקלטות זרם פוסט-סינפטי בפרוסת טריז במוח עכבר

מקור: Badran, B. W., et al. מתן מעבדה של גירוי עצב הואגוס דרך העור (taVNS): טכניקה, מיקוד ושיקולים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים גירוי עצב הואגוס האפרכסת דרך העור (taVNS), שיטה לא פולשנית לוויסות פעילות המוח. אלקטרודות ממוקמות על הדופן הקדמית של תעלת האוזן החיצונית והטראגוס, ומכוונות לענף האפרכסת של עצב הנרתיק (ABVN). כאשר הוא מגורה, הדחף העצבי שנוצר עובר לגזע המוח, שם הוא משפיע על אזורים רבים במוח ועל...

גירוי עצב הנרתיק האפרכסת דרך העור באוזן האנושית

מקור: Akil, O., et al., שיטה כירורגית להעברת גנים בתיווך ויראלי לאוזן הפנימית של העכבר דרך קרום החלון העגול. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את ההליך של העברת גן טיפולי לאוזן הפנימית של גור עכבר עם ליקוי שמיעה גנטי. באמצעות וקטור ויראלי הקשור לאדנו-(AAV), הגן מוזרק דרך קרום החלון העגול, ומאפשר לחלקיקים נגיפיים להיכנס לתאי השיער, לשחזר את ייצור טרנספורטר הגלוטמט ולבסס מחדש איתות קול למוח.

טיפול גנטי מבוסס וקטור ויראלי לשיקום שמיעה במודל עכבר

מטרת פרוטוקול זה היא להתוות גישה כירורגית כדי לספק גישה ישירה לגרעין השבלול הגבי במודל עכברי.

הדמיה ישירה של Murine הגבי שבלול Nucleus לoptogenetic גירוי של הנתיב השמיעתי

איבר השמיעה מתווך את השמיעה. כאן אנו מציגים שיטת מיקרו-אלקטרופורציה שונה בביצית המותאמת לחקר התפשטות והתמיינות של תאי אב שמיעתיים באיבר השמיעה המתפתח.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

אנו מציגים טכניקה לניהול מקומי של תרופות דרך המסלול טרנס-tympanic לתוך שבלול. משלוח סמים דרך מסלול זה לא להפריע נגד סרטן היעילות של תרופות כימותרפיות כגון ציספלטין.

משלוח סמים טרנס-Tympanic לטיפול Ototoxicity

מודלים חייתיים של שתלי שבלול יכול לקדם את הידע בסיסי טכנולוגיים לטיפול אובדן שמיעה sensorineural קבוע עם גירוי חשמלי. מחקר זה מציג פרוטוקול כירורגי מחריש אוזניים חריפה, שבלול השרשה של מערך אלקטרודה עכברים, כמו גם את הערכת תפקודי עם גזע המוח השמיעתית תגובה.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

שילוב של תשומות סינפטיות מגוונות לנוירונים נמדד בצורה הטובה ביותר בהכנה שמשמרת את כל הגרעין הטרום-סינפטי לתזמון טבעי ול פלסטיות מעגל, אבל פרוסות מוח בדרך כלל מנתקות חיבורים רבים. פיתחנו פרוסת מוח שונה כדי לחקות פעילות מעגל vivo תוך שמירה על יכולת ניסויים במבחנה.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

גירוי אקוסטי חשמלי (EAS) עם אלקטרודות ארוכות יותר יכול להציע כיסוי שבלול רחב יותר וסוגים שונים של מפות במקרים של אובדן שמיעה בתדר גבוה. שילוב של ניתוח פחות פולשני, אלקטרודות גמישות בדופן הצידית ומתן סטרואידים מאפשר החדרה עמוקה יותר עם מעט או ללא טראומה ניתוחית, וכתוצאה מכך שימור טוב של השמיעה.

כיסוי שבלול משופר ושימור שמיעה בליקוי שמיעה בתדרים גבוהים באמצעות גירוי אקוסטי חשמלי עם אלקטרודה ארוכה יותר

למד גירוי אופטוגנטי של עצב השמיעה בעכברים לחקר מערכת השמיעה. שיטה זו מאפשרת רזולוציה משופרת בתדר ובעוצמה לעומת שתלים קוכליאריים מסורתיים.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

גלה סרטונים נוספים