מורין באלקטרופורציה ברחם
ב אלקטרופורציה ברחם היא טכניקה חשובה לחקר המנגנונים המולקולריים המנחים את ההתפשטות, ההבחנה, ההגירה וההבשלה של תאים במהלך התפתחות עצבית. אלקטרופורציה מ…
ב אלקטרופורציה ברחם היא טכניקה מרכזית לחקר המנגנונים המולקולריים המנחים את פיתוח עצבי. על ידי הזרקת DNA כדי לשנות ביטוי גנים באזורים ספציפיים של מוח מכרסם מתפתח, חוקרים יכולים לחקור את ההתפשטות, בידול, הגירה, וההתבגרות של תאים עצביים בהקשר של הסביבה הטבעית שלהם.
וידאו זה יציג את העקרונות העיקריים מאחור באלקטרופורציה ברחם, סקירה בסיסית על אופן ביצוע הטכניקה, ואת היישומים שלה במחקר נוירוביולוגי.
לפני שאנו מתעמקים כיצד לבצע הליך זה, מאפשר תחילה לעבור על כמה עקרונות של אלקטרופורציה. הליך זה משתמש בפולסים חשמליים היוצרים נקבוביות חולפות בקרומי התא, ומאפשר ל- DNA להיכנס לתא. מכיוון שהדנ"א הטעון שלילית יעבור לכיוון האלקטרודה החיובית, אוכלוסיות תאים שונות יכולות להיות ממוקדות בהתאם למיקום השדה החשמלי.
למרות אלקטרופורציה שימש באופן מסורתי במחקרים במבחנה, התקדמות מדעית הרחיבה את השימוש שלה לאיברים שלמים, כולל אלה שנמצאו עוברי עכבר המתפתחים ברחם.
באלקטרופורציה ברחם, שלא כמו תרבית התאים או טכניקות ex vivo, יש את היתרון כי תאים transfected ימשיכו להיות חשופים לכל רמזים פיזיולוגיים המנחים התפתחות נורמלית. זה חשוב במיוחד במוח, שבו מבנים כגון אקסונים דורשים רמזי הדרכה מסוגי תאים אחרים על מנת להתפתח כראוי.
התפתחות המוח בפרט כוללת סדרה מתוכנתת של אירועי התפשטות והגירה, כלומר שכבות רקמות שונות יכולות להיות ממוקדות בהתבסס על תזמון האלקטרופורציה.
לבסוף, הזמינות של סוגים שונים של אלקטרודות מאפשרת לחוקרים לגשת לשני האזורים ליד פני השטח של המוח, כמו גם אזורים עמוקים יותר. אלקטרודות משוטים משמשות בעת מיקוד חלקים שטחיים של המוח, כגון קליפת המוח וההיפוקמפוס, בעוד אלקטרודות מחט קטנות יותר משמשות בעת מיקוד מבנים עמוקים כמו התלמוס וההיפותלמוס.
עכשיו כשדיברנו על כמה עקרונות בסיסיים מאחורי הטכניקה, בואו נוציא את ההכנות שלנו מהדרך כדי שנוכל להתעמק בהליך הכירורגי ובאלקטרופורציה ברחם.
ראשית, לחטא את כל המכשירים ולנגב את האזור הכירורגי עם 70% אתנול. לאחר מכן, הפוך פתרון הזרקה על ידי המסת DNA plasmid PBS סטרילי המכיל 0.1% מהיר ירוק. הירוק המהיר נוסף כדי לאפשר הדמיה של פתרון הזרקה בעובר. לבסוף, באמצעות מושך מחט, מחט דקה במיוחד חייבת להיווצר כדי להפחית את אובדן מי השפיר ואת התמותה העוברית לאחר מכן.
עכשיו שיש לנו הכל מוכן, בואו נעבור על השלבים הבסיסיים עבור אלקטרופוריאנט רקמת המוח בפיתוח מכרסמים. התחל על ידי להרדים סכר בהריון באמצעות 5% איזופלוראן ואז העברתו לצינור הנשמה המספק 2.25% איזופלוראן לכל ההליך. לאחר מכן, להקלה על כאבים לאחר הניתוח, לספק משכך כאבים כמו buprenorphine תת עורית. ואז לגלח את הבטן ולחטא את אתר החתכים.
כדי לחשוף בניתוח את הרחם, לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע בעור, באמצעות מספריים, לחתוך דרך הצפק. כדי למנוע מהעוברים להתייבש, מכסים את הפתח בגאזה סטרילית ספוגה מלוחה. לאחר מכן, בעדינות למשוך את השרשרת העוברית מתוך חלל הבטן להיות בטוח לשמור על העוברים רטובים על ידי כיסוי עם תמיסת מלח סטרילית מראש מחומם.
באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, לזהות עוברים ממוקמים כראוי לגישה קלה למוח. באמצעות האצבעות או המלקחיים לייצב את הראש של העובר ולהזריק את פתרון ה- DNA דרך דופן הרחם לתוך המוח. הנח אלקטרודה בכל צד של הראש, עם האלקטרודה החיובית בכיוון שאליו אתה רוצה אלקטרופורי ה- DNA. לאחר כל העוברים הממוקמים כראוי הם אלקטרופורציה, בזהירות למקם את קרן הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן.
לפני סגירת ההסתה, להוסיף 2- 3 מ"ל של תמיסת מלח חמה לחלל. תפרו את הצי יחד עם תפרים נספגים, ואז סגרו את העור בעזרת סיכות. לבסוף, להעביר את העכבר לכלוב עם כרית חימום וצג.
עכשיו שעברנו על איך לבצע אלקטרופורציה ברחם, מאפשר לבחון כמה יישומים במורד הזרם של טכניקה זו.
ב אלקטרופורציה ברחם הוא כלי שימושי לחקור כיצד גנים ספציפיים לתרום להתפתחות עצבית. מבנים אלקטרופוריים יכולים להנחות ביטוי יתר של סוג בר או חלבונים מוטנטיים או לחסום לחלוטין את ביטוי החלבון. פנוטיפים נוירולוגיים לאחר מכן ניתן להעריך ברמה מיקרוסקופית או אורגניזמית. לדוגמה, ניסויים אלה קבעו כי ביטוי יתר חולף של הגן הקשור לסכיזופרניה, DISC-1 במוח העכבר המתפתח, הביא לרגישות יתר לאאמפטמין בהמשך החיים.
ב אלקטרופורציה ברחם יכול גם להיות שימושי להדמיה אוכלוסיות תאים ספציפיות ואת הקשרים שהם עושים על ידי אספקת רצפים קידוד חלבונים פלואורסצנטיים לתוך רקמה עצבית. לדוגמה, ניסויים אלה אלקטרופורציה גן חלבון פלואורסצנטי ירוק לתוך E13.5 רשתיות לחקור תאי גנגליון רשתית, או RGCs, אשר מעבירים מידע חזותי מהעין למוח. בדיקת רשתיות ב- E18.5 מראה כיצד ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להתחקות אחר הנתיב של האקסון של RGC דרך עצב הראייה, כיאסם אופטי ודרכי ראייה.
לבסוף, אירועים חשובים רבים בהתפתחות העצבית מתרחשים לאחר הלידה, מעוררי השראה מדענים לפתח טכניקה שונה הנקראת אלקטרופורציה vivo. הליך זה עוקב אחר אותם שלבים בסיסיים כמו אלקטרופורציה ברחם, אבל זה מבוצע בדרך כלל בימים הראשונים לאחר הלידה. מניפולציה גנטית לאחר הלידה שימושית במיוחד לחקר סוגי תאים שנולדו מאוחר יותר, כגון אלה שנמצאו בתוך נורת הריח המוצגת כאן.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב ב"אלקטרופורציה ברחם". וידאו זה הכיל עקרונות מפתח וסקירה בסיסית על אופן הביצועים של אלקטרופורציה ברחם, כמו גם כמה יישומים במורד הזרם המאפשרים לחוקרים לחקור את המנגנונים המולקולריים המנחים את פיתוח עצבי.
תודה שצפיתם!
ב אלקטרופורציה ברחם היא טכניקה מרכזית לחקר המנגנונים המולקולריים המנחים את פיתוח עצבי. על ידי הזרקת DNA כדי לשנות ביטוי גנים באזורים ספציפיים של מוח מכרסם מתפתח, חוקרים יכולים לחקור את ההתפשטות, בידול, הגירה, וההתבגרות של תאים עצביים בהקשר של הסביבה הטבעית שלהם.
וידאו זה יציג את העקרונות העיקריים מאחור באלקטרופורציה ברחם, סקירה בסיסית על אופן ביצוע הטכניקה, ואת היישומים שלה במחקר נוירוביולוגי.
לפני שאנו מתעמקים כיצד לבצע הליך זה, מאפשר תחילה לעבור על כמה עקרונות של אלקטרופורציה. הליך זה משתמש בפולסים חשמליים היוצרים נקבוביות חולפות בקרומי התא, ומאפשר ל- DNA להיכנס לתא. מכיוון שהדנ"א הטעון שלילית יעבור לכיוון האלקטרודה החיובית, אוכלוסיות תאים שונות יכולות להיות ממוקדות בהתאם למיקום השדה החשמלי.
למרות אלקטרופורציה שימש באופן מסורתי במחקרים במבחנה, התקדמות מדעית הרחיבה את השימוש שלה לאיברים שלמים, כולל אלה שנמצאו עוברי עכבר המתפתחים ברחם.
באלקטרופורציה ברחם, שלא כמו תרבית התאים או טכניקות ex vivo, יש את היתרון כי תאים transfected ימשיכו להיות חשופים לכל רמזים פיזיולוגיים המנחים התפתחות נורמלית. זה חשוב במיוחד במוח, שבו מבנים כגון אקסונים דורשים רמזי הדרכה מסוגי תאים אחרים על מנת להתפתח כראוי.
התפתחות המוח בפרט כוללת סדרה מתוכנתת של אירועי התפשטות והגירה, כלומר שכבות רקמות שונות יכולות להיות ממוקדות בהתבסס על תזמון האלקטרופורציה.
לבסוף, הזמינות של סוגים שונים של אלקטרודות מאפשרת לחוקרים לגשת לשני האזורים ליד פני השטח של המוח, כמו גם אזורים עמוקים יותר. אלקטרודות משוטים משמשות בעת מיקוד חלקים שטחיים של המוח, כגון קליפת המוח וההיפוקמפוס, בעוד אלקטרודות מחט קטנות יותר משמשות בעת מיקוד מבנים עמוקים כמו התלמוס וההיפותלמוס.
עכשיו כשדיברנו על כמה עקרונות בסיסיים מאחורי הטכניקה, בואו נוציא את ההכנות שלנו מהדרך כדי שנוכל להתעמק בהליך הכירורגי ובאלקטרופורציה ברחם.
ראשית, לחטא את כל המכשירים ולנגב את האזור הכירורגי עם 70% אתנול. לאחר מכן, הפוך פתרון הזרקה על ידי המסת DNA plasmid PBS סטרילי המכיל 0.1% מהיר ירוק. הירוק המהיר נוסף כדי לאפשר הדמיה של פתרון הזרקה בעובר. לבסוף, באמצעות מושך מחט, מחט דקה במיוחד חייבת להיווצר כדי להפחית את אובדן מי השפיר ואת התמותה העוברית לאחר מכן.
עכשיו שיש לנו הכל מוכן, בואו נעבור על השלבים הבסיסיים עבור אלקטרופוריאנט רקמת המוח בפיתוח מכרסמים. התחל על ידי להרדים סכר בהריון באמצעות 5% איזופלוראן ואז העברתו לצינור הנשמה המספק 2.25% איזופלוראן לכל ההליך. לאחר מכן, להקלה על כאבים לאחר הניתוח, לספק משכך כאבים כמו buprenorphine תת עורית. ואז לגלח את הבטן ולחטא את אתר החתכים.
כדי לחשוף בניתוח את הרחם, לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע בעור, באמצעות מספריים, לחתוך דרך הצפק. כדי למנוע מהעוברים להתייבש, מכסים את הפתח בגאזה סטרילית ספוגה מלוחה. לאחר מכן, בעדינות למשוך את השרשרת העוברית מתוך חלל הבטן להיות בטוח לשמור על העוברים רטובים על ידי כיסוי עם תמיסת מלח סטרילית מראש מחומם.
באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, לזהות עוברים ממוקמים כראוי לגישה קלה למוח. באמצעות האצבעות או המלקחיים לייצב את הראש של העובר ולהזריק את פתרון ה- DNA דרך דופן הרחם לתוך המוח. הנח אלקטרודה בכל צד של הראש, עם האלקטרודה החיובית בכיוון שאליו אתה רוצה אלקטרופורי ה- DNA. לאחר כל העוברים הממוקמים כראוי הם אלקטרופורציה, בזהירות למקם את קרן הרחם בחזרה לתוך חלל הבטן.
לפני סגירת ההסתה, להוסיף 2- 3 מ"ל של תמיסת מלח חמה לחלל. תפרו את הצי יחד עם תפרים נספגים, ואז סגרו את העור בעזרת סיכות. לבסוף, להעביר את העכבר לכלוב עם כרית חימום וצג.
עכשיו שעברנו על איך לבצע אלקטרופורציה ברחם, מאפשר לבחון כמה יישומים במורד הזרם של טכניקה זו.
ב אלקטרופורציה ברחם הוא כלי שימושי לחקור כיצד גנים ספציפיים לתרום להתפתחות עצבית. מבנים אלקטרופוריים יכולים להנחות ביטוי יתר של סוג בר או חלבונים מוטנטיים או לחסום לחלוטין את ביטוי החלבון. פנוטיפים נוירולוגיים לאחר מכן ניתן להעריך ברמה מיקרוסקופית או אורגניזמית. לדוגמה, ניסויים אלה קבעו כי ביטוי יתר חולף של הגן הקשור לסכיזופרניה, DISC-1 במוח העכבר המתפתח, הביא לרגישות יתר לאאמפטמין בהמשך החיים.
ב אלקטרופורציה ברחם יכול גם להיות שימושי להדמיה אוכלוסיות תאים ספציפיות ואת הקשרים שהם עושים על ידי אספקת רצפים קידוד חלבונים פלואורסצנטיים לתוך רקמה עצבית. לדוגמה, ניסויים אלה אלקטרופורציה גן חלבון פלואורסצנטי ירוק לתוך E13.5 רשתיות לחקור תאי גנגליון רשתית, או RGCs, אשר מעבירים מידע חזותי מהעין למוח. בדיקת רשתיות ב- E18.5 מראה כיצד ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להתחקות אחר הנתיב של האקסון של RGC דרך עצב הראייה, כיאסם אופטי ודרכי ראייה.
לבסוף, אירועים חשובים רבים בהתפתחות העצבית מתרחשים לאחר הלידה, מעוררי השראה מדענים לפתח טכניקה שונה הנקראת אלקטרופורציה vivo. הליך זה עוקב אחר אותם שלבים בסיסיים כמו אלקטרופורציה ברחם, אבל זה מבוצע בדרך כלל בימים הראשונים לאחר הלידה. מניפולציה גנטית לאחר הלידה שימושית במיוחד לחקר סוגי תאים שנולדו מאוחר יותר, כגון אלה שנמצאו בתוך נורת הריח המוצגת כאן.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב ב"אלקטרופורציה ברחם". וידאו זה הכיל עקרונות מפתח וסקירה בסיסית על אופן הביצועים של אלקטרופורציה ברחם, כמו גם כמה יישומים במורד הזרם המאפשרים לחוקרים לחקור את המנגנונים המולקולריים המנחים את פיתוח עצבי.
תודה שצפיתם!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does electroporation create transient pores in cell membranes?
Electroporation uses electrical pulses to temporarily disrupt cell membranes, creating transient pores that allow DNA to enter cells. Since negatively charged DNA moves toward the positive electrode, researchers can target specific cell populations by positioning the electric field appropriately. This mechanism enables precise gene delivery to desired brain regions during development.
Q2: Why is in utero electroporation better than in vitro techniques for studying neural development?
In utero electroporation allows transfected cells to remain exposed to physiological cues that guide normal development, unlike cell culture or ex vivo techniques. This is particularly important in the brain, where structures such as axons require guidance cues from other cell types to develop properly. Studying cells in their natural environment provides more accurate insights into developmental mechanisms.
Q3: What is the purpose of Fast Green in the injection solution?
Fast Green is added to the plasmid DNA injection solution at 0.1% concentration to allow visualization of the injection solution within the embryo. This dye enables researchers to confirm accurate DNA delivery to the target brain region during the surgical procedure, ensuring successful transfection of the desired neural tissue.
Q4: How do paddle electrodes and needle electrodes differ in their applications?
Paddle electrodes target superficial brain regions such as the cortex and hippocampus, while smaller needle electrodes access deeper structures like the thalamus and hypothalamus. The choice of electrode type depends on the location of the target tissue within the developing brain, allowing researchers to deliver genes to specific neural populations based on their anatomical position.
Q5: What are the main applications of in utero electroporation in neurobiology research?
In utero electroporation enables investigation of how specific genes contribute to neural development by overexpressing wildtype or mutant proteins or blocking protein expression. Researchers can also visualize specific cell populations and their connections by delivering fluorescent protein sequences into neural tissue. Additionally, neurological phenotypes can be assessed at microscopic or organismal levels to understand gene function in development.
Q6: How does the timing of electroporation allow targeting of different neural cell populations?
Brain development involves a programmed series of proliferation and migration events, meaning different tissue layers can be targeted based on when electroporation is performed. By timing the procedure to coincide with specific developmental stages, researchers can selectively transfect neural progenitors, migrating neurons, or other cell types present at particular embryonic ages, enabling stage-specific genetic manipulation.
Q7: What is in vivo electroporation and how does it extend in utero electroporation research?
In vivo electroporation follows the same basic steps as in utero electroporation but is performed within the first few days after birth. This modified technique is particularly useful for studying later-born cell types, such as those found within the olfactory bulb, allowing researchers to investigate neural development events that occur after birth when in utero manipulation is no longer possible.