Name: דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: למד שיטות לדגימת קרקע ובידוד נמטודות Entomopathogenic באמצעות פיתיון חרקים ומלכודת White מותאמת. הטכניקות מאפשרות הקמת תרביות מעבדה לבקרה ביולוגית בחקלאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לחברים בעבר במעבדה המלאי: סם-קיו קים, קתרין Plichta וויקטוריה מירנדה-תומפסון על תרומתם לשיפור של רבים מהפרוטוקולים הללו. אנו מכירים את תמיכת הקרן הלאומית למדע (מענקי IOS-0,840,932 וIOS-0,724,978) לבורסת SP.

1. אוסף דוגמאות קרקע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקול המשתרע על שטח מינימאלי של 2 - 4 מ &#39;2 עבור כל אתר דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות קרקע בעומק של לפחות 15 סנטימטר (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח לפחות 5 דגימות אקראיות בתוך תחום זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3 subsamples לדגימה. בהתאם למטרת המחקר, או לשלב את subsamples או לשמור אותם בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כל דגימה בשקית ניילון. שקול כפול לצוד, כדי למנוע דליפה של דגימות (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות לייבל עם סמן עמיד למים. כלול את המידע הבא מכל אתר דגימה: מידע באתר (כולל יישוב / אזור / שם אתר ולתאם מידע GPS), תאריך, בית גידול, צמחייה קשורה, טמפרטורה, גובה, וכו &#39; הערה: במידת צורך, לאסוף ו / או להקליט את נוכחותם של חרקים או חסרי חוליות אחרות שנאספו במדגם לזיהוי שלאחר מכן. הם עשויים לייצג נאטור פוטנציאלמארחים אל EPN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי איסוף נקיים בין דגימות על ידי שטיפה ביסודיות עם מים ו / או חיטוים עם 70% אתנול או 0.5% פתרון אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות בצידנית (8-15 מעלות צלזיוס) במהלך הובלה למעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את חלק של דגימת הקרקע לניתוח כדי להשיג מידע על הרכב קרקע, מרקם, לחות, מוליכות חשמליות או פרמטרים אדמה רצויים אחרים. </li></ol> . 2 בידוד נמטודות מדגימות קרקע: טכניקת חרקים מתגרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל פסולת (כלומר., סלעים, חתיכות עץ או קליפה, עלים, וכו &#39;.) שנאסף בדגימות שלך כדי למנוע זיהום עם מיקרואורגניזמים saprobic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף מים כדי ללחלח את הקרקע ולהקל על התנועה של נמטודות. הערה: השתמש בבקבוק ספריי כדי להגדיל את רמת הלחות של הקרקע באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כ 200-250 מיליליטר של אדמה לחה במכל פלסטיק נקי עם מכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פיתיונות חרקים. שקול 5-10 חרקים על פני הקרקע של כל דגימה (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את המכל עם מכסה ולהפוך את מכולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על מכולות בחושך ועל RT (בדרך כלל 22-25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מכולות כל 2 - 3 ימים ולהסיר חרקים מתים. הערה: להוסיף חרקים בריאים נוספים לכל מכולה למתגרה נוסף של דגימת הקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החרקים מתים מהמכולות. הערה: גוויות עם חום או צבע אוקר בדרך כלל parasitized ידי steinernematids, בעוד הלבנים האדומים לגופות סגולות כהות parasitized ידי heterorhabditids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף גופות במים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים גופות במלכודת לבנה הותאם להתאוששות של צאצאי נמטודות (ראה הליך בהמשך). </li></ol> מלכודת לבנה השתנה:. 3 נמטודות שחזור מגוויות נגועות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את החלק העליון של קוטר 50 (או 60) מ&quot;מ. צלחת פטרי בתוך צלחת גדולה יותר (100 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת חטא אחדנייר GLE מעגלי מסנן (# Whatman 1) בתוך הצלחת קטנה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גופות מניחים על נייר הסינון של המנה קטנה יותר מה שהופך את גופות בטוחים לא נוגעות זה בזה, כדי למנוע כל זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צלחת פטרי החיצונית (גדולה יותר) עם CA. 20 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים. אל תוסיפו מים בצלחת שמחזיקה את הגופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת פטרי הגדולה ואת התוכן שלה עם המכסה (איור 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית מנות בהתאם. הוסף את הפרטים הבאים: שם נמטודות (מינים / לבודד), תאריך זיהום (זיהום נקבע מועד) ותאריך מלכודת (זה תאריך המלכודת מוגדרת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מלכודת ב RT עד הופעתה של התולעת שלבים לנוער (IJS) מתרחשת. תהליך זה יכול לקחת בין 10-25 ימים בהתאם למין נמטודות ו / או המאמץ הנחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים קציר עם IJS על ידי הסרת הצלחת הגדולה יותר של המלכודת ולשפוך מים עם נמטודות לתוך מבחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לנמטודות למזוג לתחתית בתייקר. תהליך זה עשוי לקחת כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מים בזהירות, מה שהופך נמטודות בטוחה תישאר בתחתית הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף נמטודות על ידי הוספה יותר מים ומאפשרים לנמטודות למזוג. צעד זה יכול להיות חוזר ונשנה 2 - 3 פעמים עד שהמים נקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח השעיה נמטודות בבקבוק תרבית רקמה (250 מיליליטר). שמור על ריכוז של ההשעיה ל1,000 - 3,000 מיליליטר / נמטודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוק חנות עם תליוני נמטודות בחדר קר או בחממה בין 10-20 ° C. הערה: לבדוק צלוחיות מאוחסנות מעת לעת כפי שחיי מדף של EPN הוא משתנה. בדרך כלל ניתן לאחסן steinernematids ל6-12 חודשים ללא הצורך בsubculturing, ואילו heterorhabditids עשוי לדרוש בדיקות תקופתיות יותר. </li></ol>

<ol><li>Bedding, R. A., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+the+detection+of+insect+parasitic+rhabditid+nematodes+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil.</a> Nematologica. 21, 109-110 (1975).</li>
<li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoemare%2C+NE+%22The+Genera+Photorhabdus+and+Xenorhabdus.+In+The+Prokaryotes%22">The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes</a>. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -H., Stackebrandt, E. , Springer. New York, N.Y. 473-488 (2007).</li>
<li>Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematology%22">Entomopathogenic Nematology</a>. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2002).</li>
<li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGaugler%2C+R+%22Entomopathogenic+Nematode+s+in+Biological+Control%22">Entomopathogenic Nematode s in Biological Control</a>. , CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida. (1990).</li>
<li>Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., Özcan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+distribution+of+entomopathogenic+nematodes+%28Rhabditida%3A+Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Biodiversit.%2C+%26+Conservation%22%5BJournal%5D)">Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey.</a> Biodiversit., & Conservation. 12, 375-386 (2003).</li>
<li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li>
<li>Kaya, H. K., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaya%2C+HK+%22Techniques+in+insect+nematology.+In+Manual+of+techniques+in+insect+pathology%22">Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology</a>. , Academic Press. London. 281-324 (1997).</li>
<li>Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLacey%2C+LA+%22Manual+of+techniques+in+invertebrate+pathology%22">Manual of techniques in invertebrate pathology</a>. , Academic Press. London. (2012).</li>
<li>McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+other+natural+enemies+as+mortality+factors+for+larvae+of+Diaprepes+abbreviatus+%28Coleoptera%3A+Curculionidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae).</a> Biological Control. 19, 182-190 (2000).</li>
<li>Meyling, N. V., Eilenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+and+distribution+of+soil+borne+entomopathogenic+fungi+within+a+single+organic+agroecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%2C+ecosystem.%2C+%26+environment%22%5BJournal%5D)">Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem.</a> Agriculture, ecosystem., & environment. 113, 336-341 (2006).</li>
<li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoinar%2C+GO+%22Taxonomy+and+biology+of+Steinernematidae+and+Heterorhabditidae.+In%3A+Entomopathogenic+Nemtaodes+in+Biological%22">Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological</a>. , CRC Press. Boca Raton. 23-61 (1990).</li>
<li>Stock, S. P., Gress, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+phylogenetic+relationships+of+entomopathogenic+nematodes+%28Steinernematidae+and+Heterorhabditidae%29+from+the+Sky+Islands+of+southern+Arizona%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+invertebrate+pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona.</a> Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).</li>
<li>Stock, S. P., Hunt, D. J. Nematode morphology and systematics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStock%2C+SP+%22Nematodes+as+biological+control+agents.+CAB+International+Publishing%22">Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing</a>. Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. , CAB International Publishing. Wallingford, UK. 3-43 (2005).</li>
<li>Stock, S. P., Goodrich–Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts%3A+The+inside+out+of+a+mutualistic+association%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li>
<li>Stuart, R. J., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patchiness+in+populations+of+entomopathogenic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).</li>
<li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

הפגנה זו היא הראשונה מבין שתי מצגות המתארות את מספר הטכניקות המשמשות בדרך כלל ללימוד EPN והחיידקים סימביוטיים שלהם. טכניקות אלו מייצגות שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של תרבויות EPN במעבדה וגם יוצרות את הבסיס למבדקים אחרים שמעסיקים EPN כמו אורגניזמים מודל למחקר. סקרי קרקע שונים של EPN הראו כי השפע וההפצה שלהם יכולים להשתנות על פני עונות השנה, בתי גידול ואזורים גיאוגרפיים 4, 5,9,15. גורמים כגון מרקם קרקע, ...

נמטודות רבות הקשורים לחרקים, ואינטראקציות המארח שלהם נעות בין מועיל למזיק. במסמך זה, אנו מתמקדים בקבוצה של נמטודות, כי הם פתוגנים של חרקים, הידוע גם בנמטודות entomopathogenic (או EPN). שתי משפחות נמטודות שייכות לקבוצה זו של נמטודות: Steinernematidae וHeterorhabditidae 11,13. ההשפעה פתוגניים שלהם היא בעובדה שמעניקה את האינטראקציה שלהם עם חיידקים אנאירוביים פקולטטיביים enteric (חיידקי Xenorhabdus לקשר עם steinernematids וחיידקים Photorhabdus לקשר עם heterorhabditids) 2. החיידקים וקטורים ממארח ​​חרק אחד למשנהו על ידי את הבמה רק נמטודות חיים החופשית, לנוער בשלב השלישי התולעת (הידוע גם בנוער dauer, לנוער התולעת או IJ), שחיה בקרקע. ברגע שנכנס החרקים, נמטודות לשחרר את החיידקים לתוך hemolymph של החרקים, שהורג את מארח החרק על ידי הרעלת דם מסיבית. החיידקים גםבזות רקמות של החרקים ולהיות מקור המזון &#39;נמטודות, ומאפשר להם להגיע לבגרות ולהתרבות. בדרך כלל, דור אחד או שניים של נמטודות המבוגר מיוצר בתוך פגר החרקים. הצאצאים של reassociates הדור המבוגר שעבר עם כמה תאי חיידקיים במתמחים יותר בצורה מאשר היחסים התזונתיים הקודמים שלהם, ולטפח את התאים האלה במעיים שלהם, כאשר הם עוברים מ פגר החרקים לתוך האדמה שם הם ממתינים לחרקים אחר לparasitize 6,11,14 (איור 1). מאז הגילוי שלהם ב1927, EPN היה נחשב חלופות בעלות ערך לחומרי הדברה כימית כפי שהם יכולים parasitize מגוון רחב של חרקים, כי הם מזיקים חקלאיים 3,4,5. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, נמטודות אלה וחיידקים סימביוטיים הוכרו כמערכת מודל נזיל לחקר היבטים ביולוגיים, אקולוגיים והאבולוציוני של interactio מארח-חיידק14 NS. המטרה של מצגת זו היא להראות את השיטות וטכניקות הנפוצות ביותר לדגימת אדמה ובידוד של EPN. מגוון רחב של כלים זמין ויכול לשמש לאיסוף דגימות קרקע ובם: מקלפות אדמה, כפות סיידים, חופרי הודעה חור, מקדחים, צינורות דגימה, אתים שני, בין השאר (איור 2). בהתאם לצורך של המחקר, יכולות להיחשב שתי אסטרטגיות דגימה:) מרובדת, ב) דגימה אקראית (איור 3). הדגימה מרובדת משמשת בדרך כלל כחלק מלימוד אינטנסיבי באזור מסוים או demarked על פני תקופה נתונה של זמן. באופן כללי, חתך הוא demarked ודגימות קרקע נלקחות במרווחי זמן קבועים בחתך על פני תקופה של זמן (איור 3 א) 15. הדגימה האקראית היא בדרך כלל מועסק כאשר מתמקדים באזור נרחב. אסטרטגיית דגימה זו הייתה בשימוש ללימוד המגוון של EPN וrom שטח גדול גיאוגרפי או באזור (איור 3 ב) 12. מספר גורמים יכולים להיחשב בהתאם למיקוד של המחקר הכולל מגוון רחב של גבהים, מרקמי קרקע ובתי גידול (לדוגמא., שדות מעובדים, יערות, שטחי מרעה, פארקים, חופי ים, אזורי riparian, וכו &#39;). אנחנו מראים את הטכניקה מתגרה חרקים, שתוארה במקור על ידי מצעים ו1 Akhurst ומהווה חלופה פשוטה וסלקטיבית לשחזור EPN מדגימות קרקע. זהו הליך סלקטיבית המבוסס על ההנחה כי נמטודות (שלב IJ) יימשך למארח חרקים וparasitize זה. טכניקה זו יכולה להיחשב גם לבידוד של פתוגנים אחרים חרקים כגון פטריות, חיידקים ו8,10. אנחנו גם מדגימים את טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת לאחזור צאצאי נמטודות ממארחי חרקים נגועים 7,14. זה מאמץ נפגשהוד שמציע את היתרון של אחזור נמטודות צאצאים &quot;נקיים&quot; ללא פסולת מגוויות חרקים משפילות. לבסוף, הטכניקות המתוארות ומוצגות במאמר זה מתאימות לאלה שהגו ו / או שבוצעו במעבדה שלנו, כמו גם אלה שתוארו על ידי עמיתים ומשתפי פעולה שונים.

<table><tbody><tr><td>Galleria mellonella</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>לטכניקת פיתיון חרקים</td></tr><tr><td>נייר סינון, 55 מ"מ דרגה 1 תאית</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-048</td><td>תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה</td></tr><tr><td>60 x 15 מ"מ צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה</td></tr><tr><td>100 x 15 מ"מ צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה</td></tr><tr><td>שקיות ניילון ZIPloc</td><td>Ace Hardware או חנות</td><td></td> לחומרי בניין <td>מקומית דגימת קרקע</td></tr><tr><td>פיפטור מכני P1000, P200 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89130-562; 89130-566&nbsp;</td><td>תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה</td></tr><tr><td>טיפים לפיפטור 1000 מ"ל, 200 מ"ל</td><td>VWR</td><td>16466-004 ; 53510</td><td>תא זיהום ומכלול מלכודת לבנה</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Ace Hardware או חנות</td><td></td> לחומרי בניין <td>מקומית דגימת קרקע, חיטוי</td></tr><tr><td>נתרן היפוכלוריט</td><td>Ace Hardware או חנות</td><td></td> לחומרי בניין <td>מקומית דגימת קרקע, חיטוי</td></tr><tr><td>70% אתיל alochol</td><td>AAPER</td><td>17212945</td><td>דגימת קרקע, חיטוי</td></tr><tr><td>אתים</td><td>Ace חומרה או חנות לחומרי בניין מקומית</td><td>N/A</td><td>דגימת קרקע</td></tr><tr><td>דגימת קרקע צינורית</td><td>Accuproducts</td><td></td><td>דגימת קרקע</td></tr> בדיקת <tr><td>קרקע, ידית ארוכה</td><td>Nupla&nbsp;</td><td>PRB4T 69401</td><td>דגימת קרקע</td>קלאסית</tr><tr><td>סרט מדידה</td><td>Ace Hardware או חנות</td><td></td> לחומרי בניין מקומית <td>דגימת קרקע</td></tr><tr><td>סרט דגל, צבעים שונים</td><td>Ace Hardware או חנות</td><td></td> לחומרי בניין <td>מקומית דגימת קרקע</td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית רקמות</td><td>VWR</td><td>Falcon, 29185-304&nbsp;</td><td>מלכודת לבנה, אוסף EPN</td></tr><tr><td>בקבוקי כביסה, פוליאתילן, פה רחב</td><td>VWR</td><td>16650-107</td><td>מלכודת לבנה, אוסף EPN</td></tr></tbody></table>

דגימת קרקע ובידוד של entomopathogenic נמטודות (steinernematidae, heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

נמטודות Entomopathogenic (aka EPN) מייצגות קבוצה של נמטודות מאכלסת-האדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. נמטודות אלה שייכות לשתי משפחות: Steinernematidae וHeterorhabditidae. עד כה, יותר מ -70 מינים תוארו בSteinernematidae ויש כ 20 מינים בHeterorhabditidae. יש לי נמטודות שותפות mutualistic עם חיידקי Enterobacteriaceae ויחד הם פועלים כמתחם קוטלי חרקים רב עוצמה שהורג מגוון רחב של מיני חרקים. במסמך זה, אנו מתמקדים בטכניקות הנפוצות ביותר נחשבות לאיסוף EPN מהקרקע. החלק השני של מצגת זו מתמקד בטכניקה מתגרה חרקים, גישה בשימוש נרחבת עבור הבידוד של EPN מדגימות קרקע, ואת טכניקת מלכודת לבנה שונה המשמשת להתאוששות של נמטודות אלו מחרקים נגועים. שיטות וטכניקות אלה הן שלבים עיקריים להקמה המוצלחת של כת EPNures במעבדה וגם יוצר את הבסיס למבדקים אחרים, כי רואים נמטודות אלה כאורגניזמים מודל למחקר בתחומים ביולוגיים אחרים. הטכניקות שמוצגים במצגת זו מתאימות לאלו שבוצעו ו / או שעוצבו על ידי חברי המעבדה בורסת SP, כמו גם אלה שתוארו על ידי מחברים שונים.

אוסף דוגמאות קרקע קטינים התולעת שלישי בשלב של EPN השלבים רק בחינם החיים במעגל החיים 'נמטודות אלה אשר מתגוררים באדמה (איור 1). לכן, איסוף דגימות קרקע היא שיטה יעילה מאוד להתאושש מנמטודות אלו. איור 4 מראה פרופיל קרקע המציין את העומק שבו צריכים לקחת דגימות. שמירה על הלחות של מדגם היא גורם מפתח להישרדות של נמטודות. כתוצאה מכך, חשוב לשמור על דגימות קרקע בשקיות ניילון ולשמור אותם בטמפר...

נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

מטרת הליך זה היא להדגים את השיטות והטכניקות המשמשות בדרך כלל לדגימת קרקע ובידוד של נמטודות פתוגניות אנטרו. זה מושג על ידי איסוף דגימות קרקע תחילה בגישת רוחב, או כפי שהודגם גישת דגימה אקראית. לאחר מכן, דגימות האדמה פחתו עם חרקים כדי לשחזר באופן סלקטיבי נמטודות פתוגניות אנטרו.השלב האחרון הוא לאסוף את הנמטודות מחרקים נגועים באמצעות מלכודת לבנה שונה. בסופו של דבר, טכניקות אלו מייצגות צעדי מפתח להקמה מוצלחת של תרביות נמטודות פתוגניות אנטרו במעבדה, ומהוות את הבסיס לבדיקות ביולוגיות במורד הזרם. היתרון בטכניקת דגימת הקרקע הוא שאנו יכולים לצאת לשטח ולאסוף שלבים בוגרים של נמטודות פתוגניות.במקום לדגום חרקים הנגועים בנמטודות אלה, שלעתים רחוקות נתקלים בהן. אסטרטגיית הדגימה האקראית שאנו משתמשים בה משמשת בדרך כלל להערכת המגוון של נמטודות פתוגניות מאזור או אזור גיאוגרפי גדול. טכניקה זו תוארה לראשונה על ידי הימורים ב-Accur בשנת 1975.זהו הליך סלקטיבי המבוסס על ההנחה ששלבי חיים חופשיים יימשכו למארחי חרקים ויטפילו אותם. הדגמה הנהלים יהיו סטודנט לתואר שני ברחוב אורוסקו, וטכנאי מחקר מינג מינגל במעבדה שלי. מעבדה. האתר לאיסוף דגימות צריך להיות בשטח מינימלי של שני מטרים רבועים, ואם אפשר, להיות גדול מארבעה מטרים רבועים.עבור כל דגימת אדמה, קח לפחות שלוש תת-דגימות קטנות יותר באזור הדגימה DM a C. ניתן לשלב את

soil-sampling-isolation-entomopathogenic-nematodes-steinernematidae

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.

In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחילוץ יעיל של נמטודות חיות ממצעים טבעיים בשטח.

בידוד מהיר של נמטודות פראיות על ידי משפך ברמן

מושבות פטרייתיות אנטומופתוגניות מבודדות מדגימות קרקע טרופיות באמצעות פיתיון טנבריו , פיתיון גלריה , כמו גם מדיום מלאכותי סלקטיבי, כלומר, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה מועשר בתמצית שמרים בתוספת כלוראמפניקול, תיאבנדזול וציקלוהקסימיד (מדיום CTC).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

פרוטוקול זה יכול לשמש לביצוע סקרים אקולוגיים בקנה מידה גדול של נמטודות Caenorhabditis עצמית. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא ארגון יעיל וניתוח של נתונים אקולוגיים ומולקולריים הקשורים לנמטודות שנאספו מהטבע.

גישה מדרגית מאוד לביצוע סקרים אקולוגיים של נמטודות קאנורהבדיטיס Selfing

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

אנו מציגים שתי שיטות לחקלאים להתרבות המונית של נמטודות אנטומופתוגניות כקוטלי חרקים ביולוגיים. השיטה הראשונה משתמשת בג'ל פוליאקרילאמיד כמצע גידול הנמטודות, בעוד שהשנייה משתמשת בצמר גפן מצופה פולימר כמצע הגידול. שתי השיטות מתבססות על התרבות נמטודות בתוך גופות חרקים.

רבייה מבוססת גידול בחיים של נמטודות אנטומופתוגניות

שיטה זו מסבירה כיצד לבנות ולהפעיל C 13 רציף ו15 N קאמרי תיוג איזוטופ למדים או תיוג רקמות צמח ההפרש. נציג תוצאות מטבולים וסימון מבני של gerardii Andropogon הם דנו.

עיצוב והפעלה של רציף<sup&gt; 13</sup&gt; C ו<sup&gt; 15</sup&gt; N תיוג הלשכה לאחיד או דיפרנציאלי, מטבולית ומבנית, צמח איזוטופ תיוג

lysimetry שדה ודגימת porewater מאפשרים לחוקרים להעריך את גורלם של חומרים כימיים מוחלים על קרקעות וצמחייה שהוקמה. המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להתקין מכשור הנדרש ולאסוף דגימות לאנליזה כימית בlysimetry שדה המשולב וניסויים דגימת porewater.

משולב שדה Lysimetry וPorewater דגימה להערכת כימית ניידות בקרקעות וצמחייה הוקמה

למד שיטות לדגימת קרקע ובידוד נמטודות Entomopathogenic באמצעות פיתיון חרקים ומלכודת White מותאמת. הטכניקות מאפשרות הקמת תרביות מעבדה לבקרה ביולוגית בחקלאות.

דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

גלה סרטונים נוספים