דגימת קרקע ובידוד של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae, Heterorhabditidae)
11 ביולי 2014
נמטודות Entomopathogenic הן תולעים עגולות המאכלסת-אדמה שparasitize מגוון רחב של חרקים. אנו מדגימים שיטות דגימה המשמשות לבידוד של נמטודות אלו מהאדמה באמצעות שתי טכניקות: מתגרה חרקים והמלכודת לבנה שונה, להחלמתם של נמטודות מדגימות קרקע וגופות חרקים נגועות, בהתאמה.
מטרת הליך זה היא להדגים את השיטות והטכניקות המשמשות בדרך כלל לדגימת קרקע ובידוד של נמטודות פתוגניות אנטרו. זה מושג על ידי איסוף דגימות קרקע תחילה בגישת רוחב, או כפי שהודגם גישת דגימה אקראית. לאחר מכן, דגימות האדמה פחתו עם חרקים כדי לשחזר באופן סלקטיבי נמטודות פתוגניות אנטרו.
השלב האחרון הוא לאסוף את הנמטודות מחרקים נגועים באמצעות מלכודת לבנה שונה. בסופו של דבר, טכניקות אלו מייצגות צעדי מפתח להקמה מוצלחת של תרביות נמטודות פתוגניות אנטרו במעבדה, ומהוות את הבסיס לבדיקות ביולוגיות במורד הזרם. היתרון בטכניקת דגימת הקרקע הוא שאנו יכולים לצאת לשטח ולאסוף שלבים בוגרים של נמטודות פתוגניות.
במקום לדגום חרקים הנגועים בנמטודות אלה, שלעתים רחוקות נתקלים בהן. אסטרטגיית הדגימה האקראית שאנו משתמשים בה משמשת בדרך כלל להערכת המגוון של נמטודות פתוגניות מאזור או אזור גיאוגרפי גדול. טכניקה זו תוארה לראשונה על ידי הימורים ב-Accur בשנת 1975.
זהו הליך סלקטיבי המבוסס על ההנחה ששלבי חיים חופשיים יימשכו למארחי חרקים ויטפילו אותם. הדגמה הנהלים יהיו סטודנט לתואר שני ברחוב אורוסקו, וטכנאי מחקר מינג מינגל במעבדה שלי. מעבדה. האתר לאיסוף דגימות צריך להיות בשטח מינימלי של שני מטרים רבועים, ואם אפשר, להיות גדול מארבעה מטרים רבועים.
עבור כל דגימת אדמה, קח לפחות שלוש תת-דגימות קטנות יותר באזור הדגימה DM a C. ניתן לשלב את תת-הדגימות אם הוא עומד ביעדי המחקר. אוספים את דגימות האדמה בעומק של אפס עד 15 סנטימטרים.
כל דגימה צריכה להיות 250 גרם עד קילוגרם אחד. השתמש ב-CORAs אדמה, אתים ידניים או כלים דומים, ואסוף מלפחות חמישה אתרים אקראיים בכל אזור דגימה שנבחר. כל דגימה צריכה להיות שקית כפולה ולתייג בטוש עמיד למים.
התווית צריכה להכיל מידע על האתר, המיקום, הגובה, התאריך ומשתנים סביבתיים כגון תיאור בית הגידול עם הצמחייה והטמפרטורה הנלווים באתר. רשמו לעצמכם את החרקים המקומיים ומינים אחרים של חסרי חוליות. אספו מינים שלא ניתן לזהות מיד לזיהוי מאוחר יותר במעבדה בין אתרי האיסוף, שטפו היטב את כלי האיסוף במים, ולאחר מכן חטאו אותם באמצעות 70% אתנול או 0.5% אקונומיקה.
אחסן את דגימות האדמה בצידנית בטמפרטורה של שמונה עד 15 מעלות צלזיוס להובלה. CES מלבד חלק אחד של הדגימה כדי לנתח את המאפיינים הגסים של הקרקע כמו הרכבה, מרקמה, מוליכותה וכן הלאה. מכל דגימת אדמה, הסר את הפסולת שעלולה להוביל לזיהום חיידקי SEIC.
לאחר מכן הרטיבו את האדמה במים כדי שהנמטודות שבתוכה יוכלו לנוע בקלות. טען 200 עד 250 גרם מהאדמה הלחה למיכל פלסטיק עם מכסה. ואז להוסיף פיתיונות חרקים.
חמישה עד 10 חרקים יספיקו. חבר את המכסה, הפוך את המיכל והכניס אותו לחושך. בטמפרטורת החדר כל יומיים-שלושה, הסר את החרקים המתים ובמידת הצורך החלף אותם בחרקים בריאים לשקלול נוסף.
אם גופת החרקים חומה או אוכרה, זה מרמז על שטיין ונמה טפילי פריט. ואילו אם הגופה היא בצבע אדום לבנים עד סגול כהה, צפו להטרו. השתמש במלכודת לבנה שונה כדי לאסוף את הנמטודות שטפלו את פיתיונות החרקים.
ראשית, הניחו את המכסה של צלחת פטרי בגודל 50 או 60 מילימטר בבסיס צלחת 100 מילימטר. ואז הניחו דף ווטמן עגול. מספר אחד נייר סינון בצלחת הקטנה יותר.
שוטפים את גופות החרקים במים מעוקרים ומעבירים אותם לנייר המסנן. התפשטו כך שלא יהיו במגע זה עם זה. מלאו רק את המנה הגדולה יותר בכ-20 מיליליטר מים מזוקקים וכסו את המכלול בכלים הגדולים יותר. המכסה.
סמן את הכלים עם שם הנמטודה, תאריך פיתיון החרקים ותאריך. המלכודת מוקמת. שמור את המלכודות בטמפרטורת החדר ופקח על נמטודות זיהומיות, צעירות או IJs היוצאות מגופות החרקים.
זה יכול לקחת 10 עד 25 ימים ותלוי בטמפרטורה וברמת הלחות של המקום שבו המלכודת. אם מפלס המים במלכודת התאדה, הקפד למלא אותו מחדש על צלחות עם IJs. קצרו את המים מהצלחת הגדולה יותר, שאמורה להכיל נמטודות.
הניחו לנמטודות לשקוע למשך מספר דקות ואז שפכו לאט לאט את המים. לאחר שהנמטודות נשארות בנפח קטן של מים, שטפו אותן עוד כמה פעמים על ידי הוספת מים בחזרה ואז שפכו אותם בזהירות. לאחר מכן בצע דילולים סדרתיים כדי להעריך את אוכלוסיית הנמטודות.
בבקבוק תרבית של 250 מיליליטר, התאם את ריכוז הנמטודה בין אחת ל -3000 נמטודות למיליליטר. אחסן את המתלה הזה בין 10 ל-20 מעלות צלזיוס. בדרך כלל בטבע, הסיכוי למצוא חרקים טפיליים על ידי נמטודות פתוגניות אנטרו הוא נמוך מאוד.
לפיכך, הפרוטוקול המתואר המשתמש בזחלי מלנומה G כפיתיון שימש לבידוד נמטודות כאלה בקצב יעיל בהרבה. לאחר חמישה ימים, החרקים נדבקו והיו בעלי צבע אדום. מלכודות לבנות ששונו הראו שובלי נמטודות.
אחרי 15 יום מהמלכודות האלה, הנמטודות שנאספו במים, היו בעלות מראה נקי והיו נקיות מרקמות חרקים. מחזור מיצוי יחיד באמצעות זחלי גליום מלניה עשוי להיות לא מספיק לשחזור כל הנמטודות הפתוגניות של אומה שנמצאות בדגימת אדמה. לכן אנו ממליצים לעשות זאת מספר פעמים.
כמו כן, אנו ממליצים למשתמשים לשקול חרקים אחרים ולא גלריה, מה שישפר גם את סיכויי ההחלמה. דיון בדגימות קרקע עם חרקים הוא טכניקה שניתן לשקול גם לבידוד של פתוגנים אחרים של חרקים כגון חיידקים או פטריות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים שיטות לבידוד נמטודות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע. הטכניקות כוללות פיתיון חרקים ומלכודת White משופרת לשליפת נמטודות מפגרי חרקים נגועים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- נמטודות אנטומופתוגניות
- טכניקות לדגימת קרקע
- פתולוגיה של חרקים
רקע
- נמטודות אנטומופתוגניות הן תולעי מעיים השוכנות בקרקע.
- הן טפילים של מיני חרקים שונים.
- הבנת תהליך הבידוד שלהן חיונית לצורך גידול במעבדה.
- נמטודות אלו חשובות לצורך הדברה ביולוגית בחקלאות.
מטרת המחקר
- להדגימ 방법을 יעילים לדגימת קרקע.
- לבודד נמטודות פטריות-חרקים (entomopathogenic nematodes) לצורך מחקרים במעבדה.
- להקים תרביות לצורך בדיקות ביולוגיות (bioassays) נוספות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות קרקע באמצעות גישות של דגימה רנדומלית ודגימה לאורך טרנסקט.
- פיתיון לחרקים לשם בידוד סלקטיבי של נמטודות.
- שימוש במלכודת וייט (White trap) משופרת לאיסוף נמטודות מחרקים נגועים.
- איסוף שדה של שלבי בגרות של נמטודות.
תוצאות עיקריות
- הצלחה בהשבת נמטודות באמצעות השיטות המתוארות.
- הדגמה של יעילות הפיתיון באמצעות חרקים.
- תיקוף של מלכודת White המשופרת לבידוד נמטודות.
- ביסוס פרוטוקולים לתרבית מעבדה של נמטודות.
מסקנות
- השיטות המתוארות חיוניות לבידוד נמטודות פתוגניות לחרקים.
- טכניקות אלו מקלות על הקמת תרביות נמטודות.
- הן מספקות בסיס לבדיקות ביולוגיות עתידיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מובילה
בידוד של נמטודות אנטומופתוגניות מהקרקע מאפשר תיקוף של מטרות במסלולי גילוי לבקרת ביולוגית. שיטות אלו תומכות בסינון פנוטיפי של אינטראקציות בין נמטודות לחרקים ומספקות מערכות רלוונטיות למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים. הגישה מקלה על זיהוי של מועמדים מובילים של קומפלקסים של נמטודה-בקטריה בעלי פעילות קוטלת חרקים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני מאכסן-טפיל ותיקוף תפקודי של ארסוּת (virulence) של נמטודות.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקולים סטנדרטיים לדגימת קרקע ולפיתיונות חרקים לצורך בידוד בר-שחזור של המטרה.
- ערך חיזוי: תומך בהערכת טווח המאכסנים של הנמטודה ועמידותה הסביבתית לצורך קבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים באמצעות מלכודת White שונה להערכת תנובת נמטודות והבקיעה של גומחים זיהומיים (infective juveniles).
- ערך תפעולי: מבסס תהליכי עבודה ניתנים להרחבה של פיתיון חרקים לשחזור נמטודות בקיבולת גבוהה מן הקרקע.
- מוכנות הבדיקה: מייצר תרחיפי נמטודות מטוהרים המתאימים לסריקת בדיקות ביולוגיות בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בנמטודות המופקות מהקרקע כדי למדל מחזורי הדבקה טבעיים במיני מזיקים מטרה.
- המשכיות תרגומית: גישור בין בידוד מהשדה לתרבית במעבדה לצורך הערכה פרה-קלינית עקבית.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר בדיקת יעילות של קומפלקסים של נמטודה-חיידק תחת תנאים נשלטים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מגדיר את דגימת הקרקע ואת פיתיון החרקים כשלבי גילוי מקדימים המשמשים לבסס את תרבית הנמטודות ולהכין אותן לבדיקה ביולוגית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות לגבי זיהומיות נמטודות והסתגלות סביבתית.
- סריקה: מספקת תכשירים סטנדרטיים של נמטודות לסריקת תרכובות או גורמים סביבתיים.
- אנליטיקה: מאפשרת כימות של זחליים זיהומיים וצבעוניות של גופות כמדדים פנוטיפיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין בידודים מהשטח לזנים המטופחים במעבדה לצורך ביצוע עקבי של בדיקות ביולוגיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לבידוד נמטודות הניתנת לשימוש חוזר במגוון סוגי קרקעות ומודלים של חרקים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בפתוגנזה של נמטודות-חרקים באמצעות בידוד מבוקר.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של דגימה חלקית של קרקע, פיתיון ומלכודת לבנה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת מדדי תפוקה כמותיים של נמטודות.
- השפעה על תיק הפרויקטים: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של זני נמטודות על בסיס יעילות השחזור ותכונות וירולנטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באקולוגיה של קרקע, טיפול בחרקים ומורפולוגיה של נמטודות.
- נחוצים מכלים מפלסטיק, נייר סינון, צלחות פטרי ואחסון בטמפרטורה מבוקרת (10-20°C).
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של עומק דגימת הקרקע (0-15 cm), דגימה משנית וחיטוי כלים.
- דורש שיקולי התאמה עבור פיתיונות חרקים חלופיים מעבר ל-Galleria mellonella.
- מוגבל בשל שכיחות טבעית נמוכה של חרקים נגועים, דבר המחייב שימוש בפיתיונות לצורך התאוששות יעילה.
