הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן בתגובות של נוירונים טעמיים בחרקים ולמדוד ביטוי גנים ברקמות טעם. זה מושג על ידי רישום תחילה של התגובות של שערות טעם ספציפיות למספר טעמים בריכוזים שונים. השלב השני הוא לנתח בזהירות את רקמות הטעם.

לאחר מכן הפרד את הדגימות לפי מין ותוספתן. לאחר מכן, בודדו את ה-RNA הכולל מכל דגימת רקמה וצרו תכשירי CD NA לריצוף הדור הבא ו-QPCR. השלב האחרון הוא לנתח את נתוני ביטוי הגנים ולגבש השערות, כגון כיצד הגנים החושיים הכימותרפיים המתבטאים מתווכים תגובות פיזיולוגיות לטעמים בחרקים.

בסופו של דבר, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות משמשות להצגת טווח הקליטה של מערכת הטעם של החרקים ורצף RNA של רקמת טעם משמש להדגשת המרכיבים הגנטיים החשובים ביותר של קליטת הטעם. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטות אלה יתקשו בגלל הגודל הקטן של כימותרפיה נגד חרקים. נספחים חושיים.

בין אם ניתוח או הקלטה מאיברי חרקים קטנים תרגול בחולים הם המפתחות לשליטה בטכניקות אלה. כדי להתחיל בהליך זה, משוך אלקטרודת הקלטה בקצה דק בחולץ פיפטה עם נימי זכוכית מתחת למיקרוסקופ הניתוח. שברו בזהירות את קצה האלקטרודה כך שפתחו יהיה רחב מספיק כדי לעטוף את סנטום המטרה, אך קטן מספיק כדי להימנע ממגע עם המבנים הסמוכים.

לאחר מכן, הרדימו שניים עד ארבעה חרקים בוגרים במקפיא בחום של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. לאחר מכן, יש לשתק את אחד החרקים באמצעות החלקת כיסוי עם רצועות קטנות של סרט צלופן. מתחת למיקרוסקופ.

זהה את חיישן המטרה לפי המורפולוגיה והמיקום שלו וכוון את החיה כך שתאפשר גישה חופשית אליה מזווית כניסת האלקטרודה. לאחר מכן הכנס חוט טונגסטן לבית החזה הגבי שלו. כדי לשמש כאלקטרודה הקרקעית, מלאו את אלקטרודת הזכוכית מהקצה בתמיסה מגרה מעניינת.

העיף החוצה את בועות האוויר תוך כדי החזקת הקצה כלפי מטה. הכנס חוט כסף לאלקטרודה כדי לשמש כאלקטרודת ההקלטה והגירוי. לאחר מכן, חבר את האלקטרודות למגבר מקדים, המאפשר להפחית את זמן ההתייצבות כדי ללכוד פעילות עצבית.

המגבר המקדים מחובר למחשב המצויד בתוכנת הקלטת ספייק כדי לאסוף, לאחסן ולנתח אותות חשמליים. כעת עורר את הסנטום עם פתרון בקרה כדי להבטיח את הפונקציונליות שלו. ספרו את הקוצים החל מ-200 אלפיות השנייה לאחר חפץ הגירוי.

כדי להשיג את תוצאות תגובת המינון. חשוף את הסנטום לריכוזים הולכים וגדלים של הכימיקל הניסיוני ואפשר מרווחים של שלוש דקות לפחות בין גירויים כדי להבטיח התאוששות מספקת. בהליך זה, הכינו צידנית רדודה עם קרח יבש.

עבור צינורות איסוף הרקמות, סמן את צינורות מכסה ההצמדה ללא RNA בנפח 1.5 מיליליטר לאיסוף סוגים שונים של רקמות. שמור את הצינורות סגורים כדי למנוע עיבוי עודף. לאחר מכן, יש להרדים 30 עד 40 יתושים במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 שניות.

לאחר מכן מעבירים את היתושים המורדמים לשלב קר וממיינים לפי מין. הפוך את הצד הגבי של החרקים כלפי מטה על ידי אחיזת הכנפיים שלהם, והיזהר לא לפגוע בנספחי הטעם. תחת מיקרוסקופ מנתח, נתח את התווית הזוגית בלה או טרסי מזכרים או נקבות על ידי אחיזה עדינה של היתוש פרו בואה ממש קרוב לתווית.

בלה עם זוג מלקחיים אחד כדי לחשוף את העט הפנימי ולהסיר את התווית עם זוג המלקחיים השני. לאחר מכן הנח את הרקמה בצינור האיסוף הקר לרקמת טרסל. אחוז בעדינות ברגל היתוש בצומת השוקה וקטע הטרסל הראשון, והסר את הטרסי.

לאחר מכן הנח את הרקמה בצינור המסומן בקור. סובב את צינורות האיסוף למשך דקה אחת בצנטריפוגה של אפס מעלות צלזיוס בכוח הכבידה פי 9,000 כדי לשמור על הרקמה בתחתית הצינור. אם מצטברת לחות בצינורות האיסוף במהלך הדיסקציה, הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב טריול קר כדי לכסות ולהגן על הרקמה שנאספה.

הקפיאו את הצינורות במדף הצינור של 1.5 מיליליטר המכיל חנקן נוזלי. לאחר מכן, הכינו את העלים נטולי ה-RNA המתאימים היטב על ידי קירורם על קרח יבש לפני שיבוש הרקמות. לאחר מכן טוחנים את הרקמה לאבקה דקה וחוזרים על הפעולה פעם נוספת.

הביאו את הנפח הכולל של טריול למיליליטר אחד והחייאה. השעו את רקמת הקרקע על ידי מערבולת. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר כלורופורם לרקמת הקרקע וערבבו היטב.

לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, סובב אותו בצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס בכוח הכבידה פי 11,000 למשך 15 דקות. הוסף בזהירות את השכבה המימית ישירות לעמודת מסנן DNA גנומי. לאחר מכן סובב אותו בכוח הכבידה פי 11,000 למשך חמש דקות.

הוסף נפח שווה של אתנול 70% נטול RNA לזרימה וערבב על ידי פיפטינג. מעבירים את הנוזל לעמודת איסוף RNA וממשיכים במיצוי RNA. לאחר מכן, כמת והעריך את טוהר ה-RNA הכולל בספקטרופוטומטר מדויק והמשך בכל שיטת ריצוף RNA סטנדרטית.

רישומי העקבות של פוטנציאל הפעולה מ-E GTI הטעם של העוזר מדגימים את היעילות של גירוי ישיר עם מגוון הכימיקלים. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לכמת תגובות לכל כימיקל מגרה על ידי ספירת הקוצים של משרעת ומשך נתון בטווח זמן סביר של פחות מ-500 אלפיות השנייה. שלושת הקוצים הללו מתאימים לשלושה תת-סוגים של נוירונים חושיים עם רגישויות שונות.

השכפולים הביולוגיים עבור מערכי נתונים של RNA-Seq עשויים להיות מוגבלים על ידי עלות או קושי באיסוף רקמות. Q-R-T-P-C-R מציע את היכולת לאמת תת-קבוצות קטנות של ביטוי גנים כולל בעלות נמוכה יותר ודורש פחות מקור. RNA המוצג בפאנל השמאלי זה לצד זה הוא השוואה בין הביטוי היחסי שנקבע על ידי RN Aeq לבין הביטוי היחסי שנקבע על ידי Q-R-T-P-C-R.

שתי השיטות הללו מסתמכות על כימיות שונות להערכת שפע הגנים. פונקציות השקילות הסטטיסטיות המוצגות באופן גרפי בפאנל הימני מדגימות את גבולות הוודאות בכל מקרה. ב לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח רקמת חרקים לבידוד RNA ולהקליט אותות עצביים משערות הטעם של חרקים חיים.