Name: הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: חקור תגובות נוירונים טעמיים ורצף RNA ברקמות טעם של Aedes aegypti. שיטות אלקטרופיזיולוגיות וניתוח ביטוי גנים חושפים מנגנוני תפיסת טעם ביתושים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לבריאן ט. ויניארד ממשרד החקלאות האמריקאי, שירות המחקר החקלאי, מרכז המחקר החקלאי הנרי א. וואלאס בלטסוויל, שירות הייעוץ הביומטרי, בלטסוויל, מרילנד על הניתוחים הסטטיסטיים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק ל-JCD מתוכנית המחקר להגנה על לוחמי מלחמה פרוסים (DWFP) במימון משרד ההגנה באמצעות מועצת ניהול המזיקים של הכוחות המזוינים (AFPMB).

<html> 1. גידול Ae. מבוגרים aegypti <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים בוקעים בכ ¾ אינץ &#39;מים במגש רדוד. צפיפות תקטין את הגודל של מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלים אחוריים במהירות של 25 ° C (12-HL: 12-HD) ולהאכיל עם מזון לדגי קרקע. הערה: האכלת יתר עלולה להפחית את שיעורי הישרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גלמים בנפרד על ידי פיפטה פסטר היומית ולהעביר לצלחות פלסטיק (9 סנטימטרים × 5.5 סנטימטרים) בתוך דליי בלימה קטנים עם מכסי רשת בסדר, וכך יוצר 24 קבוצות גיל hr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% תמיסת סוכרוז יתושים בוגרים Feed על ידי כדור צמר גפן שהונחה על קירות המסך של דיור כלוב היתושים בתא סביבתי על 27 מעלות צלזיוס ו -70% לחות יחסית באותם photoperiod כזחלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאלקטרופיזיולוגיה, להשתמש 5-10 ישנים בעלי חיים יום. באופן כללי, בעלי חיים גדולים יותר יפיקו תוצאות טובות יותר. לבידוד RNA, להשתמש בבעלי חיים הנמצאים בקיבוץ גיל 24 שעות בודדות בטווח הישן 5-10 היום. </li></ol>התחת = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. הכנת כימיקלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע ריכוז מתאים של אלקטרוליטים (למשל 1-10 מ&quot;מ) שמעורר פעילות מינימאלית מתאי עצב תחושתיים שנבחרו. 10 מ&quot;מ NaCl או 1 המ&quot;מ KCl הם אלקטרוליטים סבירים כדי לבדוק את הפעילות בסיסית כאשר מתחיל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כל כימי ניסיוני בממס מתאים (אם לא מים, להשתמש באתנול או DMSO) שיש לו השפעה מועטת, אם בכלל, על פעילות ספייק בהשוואה לאלקטרוליט לבד. ריכוזים סופיים של 10% אתנול או DMSO 1% ריכוזים התחלה סבירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מתאים (למשל כינין למר או סוכרוז למתוק) כימיקלים שליטה המתוארות היטב הרתעה האכלה או ממריצים בחרקים. </li></ol> 3. אלקטרופיזיולוגיה (הקלטת טיפ 8; איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודות זכוכית טופס מכאני מושך נימי זכוכית. לייעל חום ולמשוך הגדרות למשוך זכוכית כדי ליצור recordi בצורה הולמתאלקטרודות ng. לשבור בזהירות את סוף אלקטרודת זכוכית באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי ליצור קצה האלקטרודה פתיחה שהוא רחב מספיק כדי לעטוף Sensillum היעד, אך קטן מספיק כדי להימנע ממגע עם מבנים שכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית לזהות על ידי מורפולוגיה ומקם את sensilla / Sensillum היעד כדי להבטיח את דירות של הקלטת קצה. בעלי החיים Prep כדי לאפשר גישה חופשית לsensilla מזווית כניסת האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרקים קרים מבוגרים להרדים במקפיא ב -20 ° C. למנוע נזק לתאי עצב היקפי על ידי חשיפה לטמפרטורות קרות. חותך רצועות צרות של קלטת צלופן עם סכין גילוח על שקופיות זכוכית. לשתק חרקים שלמים בשקופית זכוכית באמצעות רצועות צרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס תיל טונגסטן חידד כימי לתוך בית חזה הגב או עין לשמש את האלקטרודה אדישה (קרקע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא אלקטרודת זכוכית נעשתה בשלב 3.1 עם פתרון מגרה של עניין. באמצעות מזרק הוכנס, למלא כובעillary מקצה משך להקהות סוף. גרור את כל בועות האוויר, מחזיק סוף הוריד. הכנס חוט כסף (chloriding אופציונאלי) לאלקטרודת הזכוכית נעשתה בשלב 3.1 לשמש הקלטה והאלקטרודה מגרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודות למגבר קדם שנועד להקלטות מsensilla chemoreceptive קשר בחרקים. מגבר קדם זה (300 הרץ-3 מסנן bandpass kHz) יפחית את הזמן להתיישב כדי ללכוד פעילות עצבית קרובה לגירוי הקדמה ככל האפשר. לאסוף, לאחסן ולנתח אותות חשמליים באמצעות מייקרו-מחשב מצויד בתוכנת הקלטת ספייק. הערה: הארקת הגדרת ההקלטה כראוי עשויים לשפר בצורה דרסטית יחס אות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר sensilla עם פתרון שליטה (אלקטרוליט בלבד) כדי להבטיח פונקציונליות. רוזן קוצים מתחילים 200 אלפיות שניים הבאים חפץ הגירוי לכל ההכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופן אקראי את סדר הכימיקלים מבחן עבור כל הניסויים, למעט מחקרי מנה-תגובה,לחסל את ההטיה. ללימודי מנה-תגובה, לחשוף sensilla להגדלת ריכוזים של חומר כימי ניסיוני. לאפשר מינימום של 3 דקות בין גירויים כדי להבטיח התאוששות נאותה. הערה: דרישה זו עשויה להשתנות בהתאם לחרקים וsensilla. סף מוגדר כריכוז שבי שגיאה סטנדרטית אינה חופפת עם שגיאת התקן לריכוז הנמוך ביותר שנבדק. </li></ol> 4. בידוד RNA ורצף (איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עלי RNase ללא הדוק שלבש על ידי קירור אותם על קרח יבש לפני עלי RNase ללא ליווי הרקמה disruption.Prepare שמתאימים צינורות כובע הצמד בחוזקה. שמור צינורות איסוף סגורים, אלא אם כן באופן פעיל לנתח כדי למנוע התעבות עודפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות aspirator המסונן, מקום 30 עד 40 יתושים-הרדים קרים (15 שניות ב-20 ° C במקפיא) על במה קרה ולמיין לפי מין. בעלי חיים מקום מגבים בצד למטה, לתפוס כנפיים לא לפגוע נספחים טעם.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בשני זוגות מלקחיים עדינים, לנתח labella זיווג או טרסי מזכרים או נקבות תחת מיקרוסקופ לנתח ולהגביל את ההכללה של רקמות סמוכות. הערה: 500 labella לזווג תשואה של כ 800-1,000 ננוגרם של mRNA הכולל. 400 טרסי הבודד (5 מגזרים כל אחד) להניב 1,200-1,800 ננוגרם של mRNA הכולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של התנשמות-מלקחיים, קל לתפוס חוטם יתושים רק הפרוקסימלי לlabella חושף stylets הפנימי. באמצעות זוג אוסף-מלקחיים אחרים, להסיר labella ולהוסיף רקמה לצד שני של צינור איסוף קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג אחד של מלקחיים, קל לתפוס רגל יתוש בצומת של עצם השוק ומגזר tarsal הראשון. באמצעות זוג מלקחיים אחר, להסיר טרסי ולהוסיף רקמה לצד שני של צינור איסוף קר. הערה: קח בחשבון את סוגי התאים בממשק של רקמה רצתה ולא רצוי. אמנם חשוב להגביל את הכללת השכנה רקמה, זה חשוב לא פחות לא להשמיט חלקים מרקמה רצויה. Fiמדגם סופי חייב לייצג במדויק את כל האיבר של עניין. צור גבול מדויק עם המלקחיים האחיזה כך שמלקחי אוסף דווקא יכולים לשחרר על ידי גירוד או תופסים רק את הרקמה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעת לעת, ספין למטה צינור איסוף בקצרה בצנטריפוגה C ° 0 ב9,000 XG לשמור רקמות בחלק תחתון של צינור. אם לחות מצטברת בצינורות איסוף במהלך נתיחה, להוסיף 50uL של מגיב Trizol הקר לכיסוי רקמה שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סמן מעבדה אנטי כתם, באופן ברור לתייג מיליליטר RNase ללא אחד 1.5 להצמיד צינור כובע לכל סוג רקמה לאוסף. שימוש במתלת צינור 1.5 מיליליטר וחנקן נוזלי, להקפיא אז לטחון רקמות לאבקה דקה (חתיכות בסדר אם בTrizol). חזור פעם אחת. תביא נפח כולל של Trizol 1 מיליליטר ו resuspend רקמת קרקע על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 ul של כלורופורם ומערבבים היטב. אחרי 5 דקות בטמפרטורת חדר, ספין למטה בצנטריפוגות ב 4 ° C ו11,000 XG במשך 15 דקות. זהירותלהוסיף שכבה מימית ישירות לעמודת מסנן הדנ&quot;א הגנומי. ספין למטה ב11,000 x ז במשך 5 דקות. הוספת נפח שווה של אתנול 70% RNase ללא לזרום דרך ומערבבים על ידי pipet. העבר את הנוזל לעמודת אוסף RNA ולהמשיך הפקת RNA להוראות שסופקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ולהעריך את טוהר של RNA הכולל על ספקטרופוטומטר דיוק ולהמשיך בכל שיטת רצף RNA סטנדרטית. </li></ol> 5. כמותי RT-PCR אישור של RNA רצף (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר גנים רבים ככל האפשר כדי להשוות רמות ביטוי גנים יחסי על פני טווח דינמי, הן בשפע רצף חזה ותפקוד גן chemosensory חזקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוגות פריימר עיצוב עבור כל גן המטרה להגביר מוצר PCR 100-180 basepair ספציפי. תכלול ההגברה gDNA שאינו ספציפית על ידי הבטחת פריימר אחד לפחות לכל סט משתרע על פני גבול אינטרון. לחלופין, להשתמש בטיפול DNase כדי להפחית זיהום גנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוףרקמת חרקים כפי שתואר בסעיף קודם. לחשב כמה רקמות נדרש לספק מספיק RNA להשלים את כל תגובות qRT-PCR. הערה: בשלושה עותקים ביולוגיים ותגובות שלושה עותקים טכניים יספק ביטחון מרבי בתוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב כימות גן יחסי כיעד X - (CT [היעד] -Ct [התייחסות]) עבור כל גן המטרה וממוצע לכל לשכפל, ביולוגי וטכני. השתמש בגן ​​משק (ים) לנרמל ערכי ה- CT בין משכפל ביולוגי ולעקור את היקף ציר Y בהשוואות של ביטוי יחסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הדמיון של RNA-seq ומערכי נתוני qRT-PCR באמצעות מבוסס רגרסיה, הליך bootstrap שקילות 9, איטרטיבי מיושם, לנתונים מכל רקמה. הערה: הליך זה מזהה את &quot;האזור של דמיון&quot; הקטן ביותר שניתן לבנות סביב נתוני RNA-seq וqRT-PCR שנצפו, ולאפשר ביטוי גנים היחסי כפי שהיא נמדדת על ידי qRT-PCR כדי להיחשב מבחינה סטטיסטית שווה ערך למדידה של ביטוי גנים יחסי על ידי RNA-seq. </li></ol>

<ol><li>Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repellent+and+deterrent+effects+of+SS220%2C+picaridin%2C+and+DEET+suppress+human+blood+feeding+by+Aedes+aegypti%2C+Anopheles+stephensi%2C+and+Phlebotomus+papatasi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi.</a> J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).</li>
<li>Dickens, J. C., Bohbot, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini+review%3A+Mode+of+action+of+mosquito+repellents.Pestic%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic.</a> Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).</li>
<li>Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+chemosensory+appendages+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae+reveals+tissue-+and+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding.</a> BMC Genomics. 12 (271), (2011).</li>
<li>Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+transcriptomic+analysis+of+chemosensory+receptors+in+a+pair+of+divergent+ant+species+reveals+sex-specific+signatures+of+odor+coding%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genet%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding.</a> PLOS Genet. 8 (8), e1002930(2012).</li>
<li>Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+adult+Drosophila+antenna+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+Studies%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing.</a> Zoological Studies. 52 (42), (2013).</li>
<li>Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+Aedes+aegypti+odorant+receptor+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family.</a> Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).</li>
<li>Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+receptors+and+neurons+for+DEET+and+new+insect+repellents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents.</a> Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).</li>
<li>Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physiology+of+a+primary+chemoreceptor+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The physiology of a primary chemoreceptor unit.</a> Science. 122 (3166), 417-418 (1955).</li>
<li>Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regression-based+equivalence+test+for+model+validation%3A+shifting+the+burden+of+proof%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof.</a> Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq.</a> Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li>
<li>Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).</li>
<li>Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptor+neuron+responds+to+DEET+and+other+insect+repellents+in+the+yellow-fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwiss%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).</li>
<li>Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+receptor+expression+in+the+labella+and+tarsi+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).</li>
<li>Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gr+family+of+candidate+gustatory+and+olfactory+receptors+in+the+yellow-fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti.</a> Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).</li>
<li>Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+abundance+of+ubiquitously+expressed+genes+revealed+by+tissue+transcriptome+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data.</a> PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598(2009).</li>
<li>Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+based+criterion+for+gene+expression+calls+using+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data.</a> Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).</li>
<li>Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+active+genes+in+deep+RNA-seq+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies.</a> BMC Genomics. 14 (778), (2013).</li>
<li>Isono, K., Morita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+designs+of+insect+taste+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cellu.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular designs of insect taste receptor system.</a> Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ההיבט המאתגר ביותר של פוטנציאל פעולת הקלטה מsensilla התעורר אצל הוא להחליט איזה תגובות הם &quot;נורמלים&quot;. כאשר העסקת קצה Sensillum התעורר אצל אחת הקלטה בפעם הראשונה לניתנו מיני חרקים, מספר הכולל ורגישויות של תאי עצב קולט התעורר אצל (GRNs) הם סביר להניח לא ידוע. הקלטות ראשוניות רבות נדרשות ראשון להחליט את הטווח וריכוזים של כימיקלים לבדיקה. במקרה זה, שהתחלנו עם התצפית כי GRN יחיד הגיב לריכוזים נמוכים של DEET (איור 1). בהמשך לכך, נבחנו תגובות בתוך אותו Sensillum...

תרכובות כמו DEET, Picaridin, Citronellal וIR3535 הוכחו ביעילות להדוף יתושים, כולל Aedes וקטור מחלה החשוב aegypti 1,2. אנו רושמים פוטנציאל פעולה מתא עצב תחושתי הקשורים sensilla התעורר אצל ספציפי כדי לקבוע את התאים מעורבים עם דחיית יתושים. בשילוב עם רצף במורד הזרם של גנים המתבטאים ברקמות אלה, אנו עשויים לזהות את הגנים סביר להניח תיווך התגובות של תאים אלה כדי להקרין תרכובות חדשות ליכולות דחייה השתפרו. RNA-seq הוא כלי רב עוצמה, הופך סטנדרטי למעקב אחר שינויים של זמן ומרחב בביטוי גנים במהירות. RNA-seq ניתוחים של איברים chemosensory חרקים ואיברים שימשו לחשוף קולטנים מולקולריים בכמה מיני חרקים 3-5, שיפור משמעותי בגן מבוסס PCR קונבנציונלי חיפושים על ידי גן 6. חרקים מייצגים את מעמד בעלי החיים המגוון ביותר, מראשsenting הזדמנויות רבות ללמוד את הקשר בין גנים ופנוטיפים ייחודיים. טכנולוגית RNA-seq יכולה להיות מועסק על כל רקמת חרקים חיים. כמו כן, הקלטת אלקטרו מתאי חישה בתוך sensilla התעורר אצל uniporous ניתן להשיג במינים חרקים רבים ושונים. הזיווג של שתי הטכניקות הללו מאפשר לחוקרים כדי לצמצם גני הסט מעורבים בפנוטיפ chemosensory נצפה. מינים שונים יציגו אתגרים ספציפיים, אך עשוי להודיע ​​על הקשר בין גני קולט chemosensory והסתגלות chemosensory. הגודל והמורפולוגיה של sensilla chemosensory משתנה ועשוי לדרוש פתרון בעיות נרחבות בעת הקלטת פוטנציאל פעולה כדי להפחית את הרעש ולזהות אותות הדיר. ניתוחים של איברי chemosensory עשויים להיות טריוויאלי או עדין וזמן רב, בהתאם למורפולוגיה וגודל של החרק. שחזור של RNA באיכות גבוהה עשוי לדרוש כמה פתרון בעיות, כמו גם, כגון הימנעות פיגמנטים מסוימים במהלךאוסף רקמות. תוך שהם מפגינים את ההשפעות של תרכובות דוחה באמצעות ניסויים התנהגותיים הוא ישיר ואינפורמטיבי, גישה זו היא זמן אינטנסיבי ורחב ביחס למנגנון פעולה. אלקטרופיזיולוגיה בשילוב עם RNA-seq מאפשרת לניתוחים ספציפיים יותר של מה שמניע את התנהגויות הימנעות בחרקים. ברגע ש&quot; ארגז הכלים &quot;של אפליה כימית זוהה במיני חרקים, ניסיונות ספציפיים יותר על מנת לשפר את דוחי ידועים הם אפשריים. קולטנים וחלבונים הקשורים בתאי חישה אחראים להתנהגויות אלה עשויים לבוא לידי ביטוי heterologously להקרנה כימית ישירה. יתר על כן, הדמיה מולקולרית יכולה לנבא איזה כימיקלים יהיו לעורר תגובה חזקה מקולטנים אלה 7. תמונת המצב של כל הגנים הפעילים בקבוצה צרה של רקמות chemosensory יכול להיות גם שימושית בזיהוי גנים דומים במינים אחרים. באמצעות הומולוגיה ברצף וsi הביטויmilarities, חוקרים עלולים להיווצר סטים של קולטנים מולקולריים סביר להניח תיווך תגובות לדוחים שהם רחב אפקטיביים על חרקים. אנו מציגים את הפרוטוקול הבא כדי לעזור לחוקרים בפירוק מסלולי chemosensory חרקים ולשכנע יותר להתעמק neuroethology של אי-מודל וחרקים חשובים מבחינה כלכלית.

<table><tbody><tr><td>נימי זכוכית</td><td>A-M Systems</td><td>628000</td><td>סטנדרטי, 1.5 מ"מ X 0.86 מ"מ,</td></tr> <tr><td>חוט כסף</td> 4 אינץ' <td>A-M Systems</td><td>7875.015</td> אינץ' <td></td></tr><tr><td>חוט טונגסטן</td> חשוף <td>מוצרי אלפא</td><td>369</td><td>0.127 מ"מ קוטר</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11252</td><td>#5SF Inox</td></tr><tr><td>Refridgerated stage</td><td>BioQuip Products</td><td>1429</td><td>Chill </td></tr><tr><td>מגבר שולחן Syntech</td><td></td><td>Taste Probe</td><td>קדם מגבר</td></tr><tr><td>תוכנה לאלקטרופיזיולוגיה</td><td>תוכנת Syntech</td><td>Autospike</td><td>לאלקטרופיזיולוגיה</td></tr><tr><td>מזון דגים TetraMin טטרה</td><td></td><td>גרגירי מזון דגים טרופיים</td><td>מזון דגים טחון לאבקה עדינה</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>מגיב בידוד RNA</td></tr><tr><td>RNeasy Plus מיני קיט</td><td>Qiagen</td><td>74136</td><td>כולל מחסל gDNA ועמודות ספין RNeasy</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר ננו-טיפה</td><td>מוצרי ננו טיפה</td><td>ND-1000</td><td>ספקטרומטר שולחני</td></tr><tr>R <td>תוכנה חינמית סטטיסטית (נוצרה על ידי רוברט ג'נטלמן ורוס איהאקה)www.r-project.org</td><td></td> <td>השתמש בפונקציית lm של חבילת הסטטיסטיקה ובפונקציית equiv.boot של חבילת השקילות בסביבת המחשוב R.</td><td></td></tr><tr><td>מתלה צינור 1.5 מ"ל</td><td>ירוק עד</td><td>240-6388-030</td><td>יוצקים חנקן נוזלי לכמה בארות ריקות כדי להקפיא ולטחון רקמות.</td></tr><tr><td>צינורות איסוף 1.5 מ"ל עם עלי</td><td>Grainger</td><td>6HAX6</td><td>RNase</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td> ללא <td>11178160 Thermo Scientific</td><td></td><td>סובב רקמות קפואות כדי לשמור בתחתית צינור 1.5 מ"ל.</td></tr><tr><td>Primer-BLAST כלי לעיצוב פריימר</td><td>NCBI</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

הקלטות פיסיולוגיות וrna רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה aedes aegypti

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

רישום אלקטרופיזיולוגי של פוטנציאל פעולה מנוירונים חושיים של יתושים מספק לחוקרים הצצה לתפיסה הכימית של נשאי מחלות אלה. לאחרונה זיהינו נוירון חישה מר בתווית של נקבת Aedes aegypti המגיב ל-DEET ודוחים אחרים, כמו גם לכינין מר, באמצעות חקירה אלקטרופיזיולוגית ישירה. תגובות נוירונים אלה של קולטני טעם הניעו את ריצוף ה-mRNA הכולל מדגימות לבלה וטרסי זכריות ונקביות כאחד כדי להבהיר את הגנים הכימותרפיים המשוערים המתבטאים ברקמות הקליטה הכימית של המגע הללו. דגימות של טרסי חולקו לתת-סוגים פרו-מזו-מזולוגיים ומטא-תוראקיים לשני המינים. לאחר מכן אימתנו את מערך הנתונים שלנו על ידי ביצוע qRT-PCR על אותן דגימות רקמה והשתמשנו בשיטות סטטיסטיות כדי להשוות את התוצאות בין שתי השיטות. מחקרים העוסקים בתפקוד מולקולרי עשויים כעת להתמקד בגנים ספציפיים כדי לקבוע את אלה המעורבים בתפיסת הדוחה על ידי יתושים. מסלולי קולטנים אלה עשויים לשמש לסינון דוחים חדשים לשיבוש התנהגות חיפוש מארח כדי לבלום את התפשטותם של וירוסים מזיקים.

הקלטות שמץ של פוטנציאל פעולה מAe. sensilla התעורר אצל aegypti (איור 1) להדגים את היעילות של גירוי ישיר עם מגוון רחב של כימיקלים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לכמת את תגובות לכל גירוי כימי על ידי ספירת קוצים של משרעת ומשך נתון על פני טווח זמן סביר (בדרך כלל פחות מ -500 ms). הקלטות Trace חייבת להיות לשחזור בקלות תחת קבוצת נתונה של תנאי ניסוי. אחרת, התגובות הפיזיולוגיות שנצפו עשויות לייצג פנוטיפים נדירים בקרב אנשיו של מין המבחן. <p class="jove_conte...

באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן בתגובות של נוירונים טעמיים בחרקים ולמדוד ביטוי גנים ברקמות טעם. זה מושג על ידי רישום תחילה של התגובות של שערות טעם ספציפיות למספר טעמים בריכוזים שונים. השלב השני הוא לנתח בזהירות את רקמות הטעם.לאחר מכן הפרד את הדגימות לפי מין ותוספתן. לאחר מכן, בודדו את ה-RNA הכולל מכל דגימת רקמה וצרו תכשירי CD NA לריצוף הדור הבא ו-QPCR. השלב האחרון הוא לנתח את נתוני ביטוי הגנים ולגבש השערות, כגון כיצד הגנים החושיים הכימותרפיים המתבטאים מתווכים תגובות פיזיולוגיות לטעמים בחרקים.בסופו של דבר, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות משמשות להצגת טווח הקליטה של מערכת הטעם של החרקים ורצף RNA של רקמת טעם משמש להדגשת המרכיבים הגנטיים החשובים ביותר של קליטת הטעם. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטות אלה יתקשו בגלל הגודל הקטן של כימותרפיה נגד חרקים. נספחים חושיים.בין אם ניתוח או הקלטה מאיברי חרקים קטנים תרגול בחולים הם המפתחות לשליטה בטכניקות אלה. כדי להתחיל בהליך זה, משוך אלקטרודת הקלטה בקצה דק בחולץ פיפטה עם נימי זכוכית מתחת למיקרוסקופ הניתוח. שברו בזהירות את קצה האלקטרודה כך שפתחו יהיה רחב מספיק כדי לעטוף את סנטום המטרה, אך קטן מספיק כדי להימנע ממגע עם המבנים הסמוכים.לאחר מכן, הרדימו שניים עד ארבעה חרקים בוגרים במקפיא בחום של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות. לאחר מכן, יש לשתק את אחד החרקים באמצעות החלקת כיסוי עם רצועות קטנות של סרט צלופן. מתחת למיקרוסקופ.זהה את חיישן המטרה לפי המורפולוגיה והמיקום שלו וכוון את החיה כך שתאפשר גישה חופשית אליה מזווית כניסת האלקטרודה. לאחר מכן הכנס חוט טונגסטן לבית החזה הגבי שלו. כדי לשמש כאלקטרודה הקרקעית, מלאו את אלקטרודת הזכוכית מהקצה בתמיסה מגרה מעניינת.העיף החוצה את בועות האוויר תוך כדי החזקת הקצה כלפי מטה. הכנס חוט כסף לאלקטרודה כדי לשמש כאלקטרודת ההקלטה והגירוי. לאחר מכן, חבר את האלקטרודות למגבר מקדים, המאפשר להפחית את זמן ההתייצבות כדי ללכוד פעילות עצבית.המגבר המקדים מחובר למחשב המצויד בתוכנת הקלטת ספייק כדי לאסוף, לאחסן ולנתח אותות חשמליים. כעת עורר את הסנטום עם פתרון בקרה כדי להבטיח את הפונקציונליות שלו. ספרו את הקוצים החל מ-200 אלפיות השנייה לאחר חפץ הגירוי.כדי להשיג את תוצאות תגובת המינון. חשוף את הסנטום לריכוזים הולכים וגדלים של הכימיקל הניסיוני ואפשר מרווחים של שלוש דקות לפחות בין גירויים כדי להבטיח התאוששות מספקת. בהליך זה, הכינו צידנית רדודה עם קרח יבש.עבור צינורות איסוף הרקמות, סמן את צינורות מכסה ההצמדה ללא RNA בנפח 1.5 מיליליטר לאיסוף סוגים שונים של רקמות. שמור את הצינורות סגורים כדי למנוע עיבוי עודף. לאחר מכן, יש להרדים 30 עד 40 יתושים במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 שניות.לאחר מכן מעבירים את היתושים המורדמים לשלב קר וממיינים לפי מין. הפוך את הצד הגבי של החרקים כלפי מטה על ידי אחיזת הכנפיים שלהם, והיזהר לא לפגוע בנספחי הטעם. תחת מיקרוסקופ מנתח, נתח את התווית הזוגית בלה או טרסי מזכרים או נקבות על ידי אחיזה עדינה של היתוש פרו בואה ממש קרוב לתווית.בלה עם זוג מלקחיים אחד כדי לחשוף את העט הפנימי ולהסיר את התווית עם זוג המלקחיים השני. לאחר מכן הנח את הרקמה בצינור האיסוף הקר לרקמת טרסל. אחוז בעדינות ברגל היתוש בצומת השוקה וקטע הטרסל הראשון, והסר את הטרסי.לאחר מכן הנח את הרקמה בצינור המסומן בקור. סובב את צינורות האיסוף למשך דקה אחת בצנטריפוגה של אפס מעלות צלזיוס בכוח הכבידה פי 9,000 כדי לשמור על הרקמה בתחתית הצינור. אם מצטברת לחות בצינורות האיסוף במהלך הדיסקציה, הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב טריול קר כדי לכסות ולהגן על הרקמה שנאספה.הקפיאו את הצינורות במדף הצינור של 1.5 מיליליטר המכיל חנקן נוזלי. לאחר מכן, הכינו את העלים נטולי ה-RNA המתאימים היטב על ידי קירורם על קרח יבש לפני שיבוש הרקמות. לאחר מכן טוחנים את הרקמה לאבקה דקה וחוזרים על הפעולה פעם נוספת.הביאו את הנפח הכולל של טריול למיליליטר אחד והחייאה. השעו את רקמת הקרקע על ידי מערבולת. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר כלורופורם לרקמת הקרקע וערבבו היטב.לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, סובב אותו בצנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס בכוח הכבידה פי 11,000 למשך 15 דקות. הוסף בזהירות את השכבה המימית ישירות לעמודת מסנן DNA גנומי. לאחר מכן סובב אותו בכוח הכבידה פי 11,000 למשך חמש דקות.הוסף נפח שווה של אתנול 70% נטול RNA לזרימה וערבב על ידי פיפטינג. מעבירים את הנוזל לעמודת איסוף RNA וממשיכים במיצוי RNA. לאחר מכן, כמת והעריך את טוהר ה-RNA הכולל בספקטרופוטומטר מדויק והמשך בכל שיטת ריצוף RNA סטנדרטית.רישומי העקבות של פוטנציאל הפעולה מ-E GTI הטעם של העוזר מדגימים את היעילות של גירוי ישיר עם מגוון הכימיקלים. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לכמת תגובות לכל כימיקל מגרה על ידי ספירת הקוצים של משרעת ומשך נתון בטווח זמן סביר של פחות מ-500 אלפיות השנייה. שלושת הקוצים הללו מתאימים לשלושה תת-סוגים של נוירונים חושיים עם רגישויות שונות.השכפולים הביולוגיים עבור מערכי נתונים של RNA-Seq עשויים להיות מוגבלים על ידי עלות או קושי באיסוף רקמות. Q-R-T-P-C-R מציע את היכולת לאמת תת-קבוצות קטנות של ביטוי גנים כולל בעלות נמוכה יותר ודורש פחות מקור. RNA המוצג בפאנל השמאלי זה לצד זה הוא השוואה בין הביטוי היחסי שנקבע על ידי RN Aeq לבין הביטוי היחסי שנקבע על ידי Q-R-T-P-C-R.שתי השיטות הללו מסתמכות על כימיות שונות להערכת שפע הגנים. פונקציות השקילות הסטטיסטיות המוצגות באופן גרפי בפאנל הימני מדגימות את גבולות הוודאות בכל מקרה. ב לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח רקמת חרקים לבידוד RNA ולהקליט אותות עצביים משערות הטעם של חרקים חיים.

physiological-recordings-rna-sequencing-gustatory-appendages-yellow

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התגובות של אלקטרו עצב סנסורי חוש הריח כדי odorants ניתן למדוד חרקים באמצעות הקלטות sensillum יחיד. במאמר זה הווידאו נדגים כיצד לבצע הקלטות sensillum אחת האנטנות של זבוב החומץ...

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

ניתוחי RNA-Seq הופכים חשובים יותר ויותר לזיהוי היסודות המולקולריים של תכונות הסתגלות באורגניזמים שאינם מודלים. כאן, מתואר פרוטוקול לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בין יתושי Aedes albopictus שאינם דיאפאוזה, מגידול יתושים, ועד לריצוף RNA וניתוחים ביואינפורמטיים של נתוני RNA-Seq.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים, אדס המפוספס

שומן הגוף הוא האיבר מטבולית במרכז בחרקים. אנו מציגים מערכת תרבות איברים חיים המאפשרת למשתמש ללמוד את התגובות של רקמות הגוף השמן מבודד לגירויים שונים.

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

עבור שליטה יעילה של יתוש נישאים וירוס שידור, הידע של פוטנציאל וקטורי של יתושים בהתאמה הוא עניין מיוחד. אנו מתארים ריור בכפייה כשיטה לנתח מיומנות וקטור של אדס , שלושה taxa כולכית שונים להעברת Zika וירוס.

הכריחו ריור כשיטה לנתח מיומנות וקטור של יתושים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק ארוחות דם שמקורן בבעלי חיים ומלאכותיות ליתושים Aedes aegypti באמצעות מאכיל קרום מלאכותי ולכמת במדויק את נפח הארוחה שנבלעה.

האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

המאמר הנוכחי מפרט פרוטוקול שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרמות מוצלחות ובעלות רעש נמוך במספר סוגים של יתושים, כולל נקבות וזכרים כאחד.

מדריך שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרפיה של יתושים

מתן אוראלי של dsRNA המיוצר על ידי חיידקים, שיטת אספקה להפרעות RNA (RNAi) המשמשת באופן שגרתי ב - Caenorhabditis elegans, יושם כאן בהצלחה על יתושים בוגרים. השיטה שלנו מאפשרת מחקרים חזקים בגנטיקה הפוכה ומחקרי וקטורים חוסמי העברה ללא שימוש בהזרקה.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

מתוארים נהלים לחקר התנהגויות החיטוט והבליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם באמצעות אלקטרו-חדירה AC-DC.

אלקטרו-פנטרוגרפיה AC-DC לחקר התנהגויות בדיקה ובליעה של יתושי Culex tarsalis על ידי אדם

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לעריכת גנום באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית ביתוש A. aegypti באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9.

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

חקור תגובות נוירונים טעמיים ורצף RNA ברקמות טעם של Aedes aegypti. שיטות אלקטרופיזיולוגיות וניתוח ביטוי גנים חושפים מנגנוני תפיסת טעם ביתושים.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

גלה סרטונים נוספים