בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות
11 בנובמבר 2014
מודלים של חלבוני שמרים הם כלים רבי ערך להערכת הרעילות והצבירה של חלבונים המעורבים במחלה. כאן, אנו מציגים שיטות לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 עבור מדכאי רעילות. ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לסנן כל ספריית חלבונים לאיתור מדכאי רעילות של כל חלבון רעיל בשמרים.
מטרת הניסוי הבא היא לסנן ספריות HS P 1 0 4 לבחירת גרסאות המדכאות את הרעילות של החלבונים הקשורים להפרעות קיפול חלבונים. זה מושג על ידי שינוי משותף של ספריות וריאנטים HSP 1 0 4 עם מצע הקשור למחלה בשמרים ו-coex המבטא את שני החלבונים כשלב שני. השמרים שנבחרו מטופלים בחמש חומצה אוטית פלואור או חמישה FOA כדי לבחור נגד הפלסמיד HSP 1 0 4.
לאחר מכן, הפגיעות מרוצפות על ידי הגברת אזור המוטגן על ידי PCR של מושבה או זיהוי המוטציות בגן HSP 1 0 4. בסופו של דבר, ניתן להעריך את דיכוי הרעילות של המצע הקשור למחלה כדי לזהות את גרסאות HS P 1 0 4 המבטיחות ביותר לאפיון נוסף. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בחירות מבוססות קשירה, הוא שטכניקה זו מאפשרת בחירה של גרסאות המדכאות את הרעילות של המצע הקשור למחלה.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום קיפול החלבונים על ידי זיהוי החלבונים שיכולים להפוך את קיפול החלבון הלא נכון. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חיזוק HS P 1 0 4, ניתן ליישם אותה גם על ספריות סינון של כל חלבון לדיכוי הרעילות של כל מצע רעיל בשמרים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שייתכן שיהיה צורך לסנן מושבות רבות כדי למצוא להיטים תקפים כדי לסנן את דיכוי רעילות הפרוטאה התחל בשטיפת HSP 1 0 4 מושבות מהצלחות עם חומר נשירה בתוספת רפינוז, פיפטה סרולוגית ועץ סטרילי ואפליקטורים מעבירים את שטיפות הנוזל לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומערבולת את המושבות ביסודיות כדי להפריד את כל גושי התאים.
לאחר מכן, יש לדלל את תרחיף התאים לתרבית מעט עכורה ולגדל את התאים למשך הלילה באמצעי נשירה של רפינוז עם טלטול ב-30 מעלות צלזיוס. גדל את ה-HSP 1 0 4 סוג הבר ובקרות הווקטור במקביל גם בשלב זה. צלחת הבוקר שלאחר מכן, טווח של ריכוזי תאים על לוחות גלקטוז בודדים כדי ליצור לפחות צלחת אחת לכל קבוצה עם מושבות בודדות.
לנרמל את הווקטור ואת תרביות מסוג עולם HSP 1 0 4 ל-OD 600 של הספרייה והצלחת. נפחים שווים של תאים אלה לריכוזי הזן הניסיוני כדי להשוות את צמיחת הספרייה ביחס לבקרות כדי להעריך את הבחירה. קפדנות גם לוחית את הספרייה על מדיה מדכאת גלוקוז ולאחר מכן דוגרת על כל הצלחות למשך יומיים-שלושה ב-30 מעלות צלזיוס עד שנראה שהמושבות משתמשות בחמישה FOA לבחירת התאים, שכבר לא שומרים על HSP 1 0 4 פלסמידים המבטאים את הפסמידים הבאים החוצה את המושבות הבודדות מכל זן בשכפול על צלחות מדיה כפולות ובודדות לכל דגירה של לילה ב-30 מעלות צלזיוס.
צלחות אלו ישמשו לרצף מאוחר יותר כדי למנוע את התייבשות הצלחות. עטפו את לוחות היורו של ה-SD בסרט פרה והתקינו אותם בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי ביצוע חמשת מסך ה-FOA. לאחר מכן פס את המושבות מלוחות השריקה SD למושבות בודדות על חמש לוחות FOA למשך יום עד יומיים בדגירה של 30 מעלות צלזיוס עד להופעת מושבות בודדות. הבא.
מכל חמש צלחת FOA, בחר ופס. שלוש מושבות ששרדו על SD Euro אחד ו-SD אחד הצלחת שלו לכל מושבה ששרדה לאחר יום או יומיים של דגירה ב-30 מעלות צלזיוס. המושבות שאיבדו את הפלסמיד HSP 1 0 4 יגדלו על לוחות SD hiss, אך לא על לוחות SD Euro.
הגדל את הזנים הללו לרוויה במדיה של נשירה רפינוז ב 96. באר עמוקה שתי צלחות מיליליטר למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול. לאחר מכן, כדי למנוע תוצאות חיוביות כוזבות, בצע בדיקת תצפית.
לקראת סוף הדגירה יש פיפטה רב-ערוצית כדי להכיל 200 מיקרוליטר של אמצעי נשירה של רפינוז לבאר לצלחת חדשה של 96 בארות השומרת עמודים אחד ושבע לתרבויות מסודרות. לאחר מכן, יש להקצות 250 מיקרוליטר מכל אחת מ-16 התרביות הרוויות לעמודות אחת ושבע של הצלחת ולדלל באופן סדרתי את התרביות פי חמישה לכל עמודה של הצלחת, תוך ערבוב יסודי עם הפיפטה הרב-ערוצית. לאחר מכן, כדי להבטיח כתמים אחידים, הסר 50 מיקרוליטר מהתרבית המדוללת מעמודה 6 ו-12 כדי להבטיח שהנפח הסופי של כל באר הוא 200 מיקרוליטר.
לאחר מכן השתמש בכלי משכפל 96 וולט כדי לזהות את התרביות המשוכפלות על לוחות SD hiss ו-escal. לאחר דגירה של יומיים-שלושה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, בחר את זני הריצוף המציגים רעילות על לוחות השריקה של האסקל. בדומה לזה של הבקרה, ניתן להשליך זנים חיוביים כוזבים, שאינם רעילים כמו הבקרות.
השלך גם זנים המציגים פגם בגדילה על ה-sd. הצלחות שלו או אלה מציגות רעילות גדולה יותר באופן משמעותי ממצע המחלה בלבד. כדי לרצף את גרסאות HSP 1 0 4 על ידי PCR מושבה, ראשית מגרדים כ-10 מיקרוליטר שמרים מלוחות היורו של SD לשלושה מיקרוליטרים של 20 מילי-נתרן הידרוקסיד בצינורות מופשטים של PCR כדי להפשיר את התאים על ידי הפשרת הקפאה.
ראשית מניחים את הרצועות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות במקפיא, דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס בתרמוסייקלר למשך 10 דקות, ולאחר מכן דללו את הזנים ל-100 מיקרוליטר במים בדרגת PCR באמצעות ריכוז פריימר גבוה. לאחר מכן, הפעל תוכנית PCR סטנדרטית על הדגימות, ולאחר מכן נתח את הדגימות על ידי אלקטרופורזה אג'ל כדי לאשר את ההגברה של מוצר PCR בגודל המתאים.
לבסוף, רצף את מוצרי ה-PCR תוך הקפדה על ניתוח יסודי של כרומטוגרמות הריצוף למוטציות. ניתן להבחין במוטציות כתערובת של שני נוקלאוטידים לאתר נתון מכיוון ששמרים מכילים לעתים קרובות פלסמידים מרובים. בניסוי מייצג זה, לאחר בניית ספרייה של גרסאות HSP 1 0 4 שחולקו באופן אקראי בתחום האמצעי, הספרייה הפכה לשמרים המכילים פלסמיד לביטוי TDP 43 המעורר גלקטוז.
לאחר מכן נאספו הטרנספורמנטים וציפו אותם על לוחות גלוקוז וגלקטוז כדי להעריך את חומרת המסך נבחרו להיטים מלוח הגלקטוז. לאחר חמש בדיקות איתור טיפול ב-FOA של תת-קבוצה של הגרסאות שנבחרו במסך הראשוני. צוין כי מבין ארבע המושבות שנבחרו, שתיים הראו HSP 1 0 4, תיווכו דיכוי רעילות TDP 43.
אחד היה חיובי כוזב ואחד הראה רעילות מוגברת. לאחר חמישה טיפולים ב-FOA, שתי הפגיעה האמיתית רוצפו על ידי PCR של המושבה כדי לזהות את המוטציות בתחום האמצעי. לאחר מכן ניתן לבצע מוטציות HSP P 1 0 4 אלה בפלסמיד HSP 1 0 4 ההורה על ידי מוטגנזה מכוונת אתר כדי לאשר את דיכוי הרעילות שלהן לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן עד 200 פגיעות בכל פעם בחמשת ה-FO, שלב במהלך שבוע עד שבועיים אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לנתח בקפידה את תוצאות הריצוף שכן לעתים קרובות מתקבלות תערובות של פלסמידים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לעזור לענות על שאלות נוספות כגון, כיצד גרסאות HSP 1 0 4 משפיעות על הצטברות המצע הקשור למחלה? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנן ספריות של גרסאות HSP 1 0 4 לבחירת מדכאי רעילות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לסריקת ספריות של וריאנטים של Hsp104 במטרה לזהות מדכים (suppressors) של רעילות חלבונים הקשורה להפרעות של קיפול שגוי. הגישה משתמשת במודלים של שמרים כדי להעריך את יעילותם של וריאנטים אלו בהפחתת הרעילות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- הפרעות של קיפול חלבונים שגוי
- מודלים של שמרים
רקע
- הפרעות של קיפול שגוי של חלבונים קשורות לצבירה רעילה של חלבונים.
- Hsp104 הוא חלבון מלווה (chaperone) שיכול להשפיע על אגרגציה של חלבונים.
- זיהוי וריאנטים המדכאים רעילות יכול לספק תובנות לגבי אסטרטגיות טיפוליות.
- מודלים של שמרים יעילים לחקר רעילות ואגרגציה של חלבונים.
מטרת המחקר
- לסריקת ספריות של וריאנטים של Hsp104 במטרה לאתר וריאנטים המדכאים רעילות של חלבונים.
- להערכת היעילות של וריאנטים אלו במודל של שמרים.
- להעמקת ההבנה של הפרעות הנובעות מקיפול שגוי של חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספורמציה משותפת של ספריות וריאנטים של Hsp104 עם סובסטראטים הקשורים למחלות בשמרים.
- ביטוי משותף של שני החלבונים להערכת אינטראקציות.
- טיפול בשמרים נבחרים ב-5-Fluorouracil לצורך ברירה נגדית של פלסמיד ה-Hsp104.
- ריצוף של הפגיעות (hits) לזיהוי מוטציות בגן Hsp104.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של וריאנטים של Hsp104 המדכאים רעילות ביעילות.
- הערכה של דיכוי הרעילות במודלים של שמרים.
- תובנות לגבי המכניזמים של הפרעות קיפול שגוי של חלבונים.
- השוואה של שיטה זו לברירות קיימות המבוססות על קישור.
מסקנות
- השיטה מאפשרת בחירה של וריאנטים המדכאים רעילות.
- היא מספקת גישה מבטיחה לאפיון נוסף של וריאנטים של Hsp104.
- מחקר זה תורם להבנת הפרעות של קיפול שגוי של חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת לצוותי מו"פ בביופרמצבטיקה לזהות וריאנטים מהונדסים של חלבון disaggregase המדכאים רעילות במודלים של מחלות ניוროדגנרטיביות, ובכך לתמוך בתיקוף המטרה (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים. באמצעות שימוש במודלים של proteinopathy בשמרים לסריקת ספריות של Hsp104, גישה זו מספקת מערכת ניתנת להרחבה וניתנת לטיפול גנטי להערכת הצלה פונקציונלית של חלבונים פרוטאו-טוקסיים כגון TDP-43, FUS ו-α-synuclein. תהליך הסריקה הדו-שלבי מפחית תוצאות חיוביות שגויות, ובכך מגביר את הביטחון בבחירת ה-hits להערכה פרה-קלינית בהמשך.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של תפקודם של וריאנטים של Hsp104 בדיכוי רעילות ואגרגציה של TDP-43, FUS ו-α-synuclein בשמרים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבחנה בין מדכאים אמיתיים למדכאים ספונטניים באמצעות סלקציה נגדית עם 5-FOA.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יצירת תוצאות כמותיות מבוססות גדילה על מצעים סלקטיביים להערכת דיכוי רעילות המתווך על ידי וריאנטים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של סריקת ספריות באמצעות טרנספורמציה משותפת, ביטוי הניתן להשראה ובחירה על פי אובדן פלסמיד לצורך זיהוי שחזורי של פגיעות (hits).
מחקר תרגומי ופקליני
- ערך מדעי: שימוש במודלים של שמרים המשחזרים אגרגציה ציטופלזמית של חלבונים הקשורים למחלות בבני אדם, מה שמאפשר סריקה פנוטיפית הרלוונטית לפתולוגיה של ALS ומחלת פרקינסון.
- ערך תפעולי: מקל על התקדמות משלב ה-hit לשלב ה-lead על ידי קישור בין דיכוי גנטי להצלה של קונפורמציית החלבון, ובכך תומך במעקב מכניסטי במערכות של יונקים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, ומאפשרת זיהוי של מולקולות מובילות (leads) באמצעות סריקה תפקודית של ספריות וריאנטים של Hsp104 לפני תיקוף מכניסטי ופרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי הערכה האם וריאנטים של Hsp104 יכולים להפוך פרוטאו-טוקסיות הקשורה לסובסטרטים הקשורים למחלות.
- סריקה: מספק זני שמרים מוכנים לבדיקה עם ביטוי הניתן להשראה וברירה נגדית להערכת וריאנטים בסריקה רב-דגימתית (high-throughput).
- אנליטיקה: מאפשר ביצוע colony PCR וריצוף כדי לקשר בין מוטציות גנטיות לדיכוי תפקודי, ובכך להנחות ניתוח של מבנה-תפקוד.
- מחקר תרגומי: מקשר נתוני דיכוי מבוססי שמרים לפנוטיפים של קיפול שגוי של חלבונים רלוונטיים לבני אדם, ובכך מספק מידע על רמת הביטחון ביעד.
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול ניתן להתאמה לכל שלד חלבון וסובסטרט רעיל, מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור מספר יעדים של ניוון עצבי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במודולציה של המטרה על ידי תיקוף של דיכוי תפקודי של אגרגציה ורעילות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות בדיקות סריקה (spotting assays) וברירה נגדית סטנדרטיות להסרת תוצאות חיוביות שגויות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ההמשך (go/no-go) על ידי תיעודו של עדיפות לווריאנטים שהפגינו יעילות במודלים רלוונטיים למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם-סיכון של ווריאנטים של Hsp104 כמועמדים טיפוליים פוטנציאליים להפרעות של קיפול שגוי של חלבונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של שמרים, טרנספורמציה של פלסמידים וטיפול במצעי גידול סלקטיביים.
- תלוי במערכות ביטוי הניתנות להשראה (למשל, מקדמי גלוקטוז) ובסמני סלקציה שלילית (למשל, רגישות ל-5-FOA).
- מחייב זרימות עבודה סטנדרטיות עבור טרנספורמציה של ספריות, זריעה על מצעים ובדיקה פנוטיפית של חזרות.
- התאמה לשלדים חלבוניים אחרים דורשת תיקוף של הביטוי, הקיפול והרעילות בשמרים.
- מגבלה מעשית: יעילות הסריקה תלויה בגודל הספרייה ובשיעור החיוביים השקריים, מה שמחייב תיקוף דו-שלבי כדי להבטיח את איכות המועמדים שנמצאו.
