Name: בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: חקור שיטה לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 לזיהוי מדכאי רעילות חלבונים במודל שמרים. הטכניקה מאפשרת בחירת וריאנטים המדכאים רעילות של חלבונים מקופלים שלא כהלכה ותורמת להבנת הפרעות קיפול חלבון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסו לינדקוויסט, אהרון גיטלר ומרטין דונוולד על שיתוף ריאגנטים אדיבים. המחקרים שלנו נתמכו על ידי: מלגת פוסט-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (M.E.J); פרס החדשן החדש של מנהל ה-NIH DP2OD002177, מענקי NIH R21NS067354, R21HD074510 ו-R01GM099836, פרס מחקר של האגודה לניוון שרירים (MDA277268), מרכז פקארד לחקר ALS באוניברסיטת ג'ונס הופקינס, Target ALS ופרס חוקר חדש בהזדקנות של הקרן הרפואית אליסון (J.S).

1. ספריית דור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות ספריות של Hsp104 באמצעות PCR מועדת לטעויות תחום ספציפי, להגביר ראשון תחום עניינים עם DNA פולימרז לשגיאות 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצר ה- PCR על ידי שאיבת קריש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע צעד הארכת megaprimer באמצעות פרוטוקול מוטגנזה מכוון סטנדרטי: לשלב פלסמיד 50 ng תבנית, 250 megaprimer ng, 200 מיקרומטר dNTPs, וDNA פולימרז באיכות גבוהה במאגר PCR, ולדלל את נפח כולל של 50 μl עם מים הכיתה PCR 20 . להפעיל תכנית PCR סטנדרטית. הערה: פריימרים ספציפיים בשימוש ישתנה בהתאם לאזור המסוים של הגן שהוא להיות מוגברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות PCR, לעכל תבנית ה- DNA של הורים עם μl 1 אנזים הגבלת DPN אני לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את הספרייה באמצעות electroporation או אחר בultracompetent E. coli ולטהר אותו על ידי miniprep. הערה: דור ספרייהמשתנה מבוסס במידה מהותית על המטרות של ניסוי נתון. Hsp104 הוא חלבון גדול מאוד, כך שזה לא מעשי באקראי כל הגן, וזו הסיבה שאנו מנצלים PCR לשגיאות תחום ספציפי. בנוסף, המבנה של Hsp104 נשאר הבין היטב, והעיצוב של ספריות בבימוי מאתגרות 21. ניתן לבנות ספריות תוך שימוש בגישות מכוונות או אקראיות לmutagenesis, עם ההגבלה היחידה הוא שעמוד שדרת פלסמיד התבנית צריכה להכיל את גן URA3 כדי לאפשר 5-פואה בחירת דלפק בתקשורת דקסטרוז. </li></ol> 2. שינוי של ספריית Hsp104 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב את המצע הקשורים למחלות לשמרי Hsp104 W303aΔ באמצעות ליתיום אצטט סטנדרטי / פרוטוקול שינוי PEG 22. בחר מושבות אחת ולסנן אותן לרעילות לבודד את מתח עם רעילות גבוהה של המחלה קשורה מצע 23. הערה: השתמש במתח וIsola משולביםTE מושבה אחת כדי להבטיח ביטוי שווה בכל התאים. לשכפל את מצע המחלה לפלסמיד המאפשר שילוב של הגן תחת כל סמן אחר מאשר אורציל (אנו משתמשים היסטידין) וספריית Hsp104 לפלסמיד pAG416GAL (סמן אורציל) 24. כדי לאפשר ל5-פואה counterselection, להבטיח שהספרייה באה לידי ביטוי מפלסמיד עם סמן אורציל. יכולים גם להיות מועסקים זני שמרים אחרים. רשמתי לפנינו את הפנוטיפ דיכוי רעילות דומה באמצעות W303a וBY4741 זני שמרים בשני רקעי Hsp104 WT וΔ (Mej וJS, תצפיות לא פורסמו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את ספריית Hsp104 לזן זה תוך שימוש באותו ליתיום אצטט / פרוטוקול שינוי PEG 22. בהיקף של עד השינוי כראוי כדי לשמור על מרחב הרצף של הספרייה ולשמור על גודל הספרייה חזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תערובת הטרנספורמציה על noninducing, צלחות סלקטיבית (למשל SD--אורה) באמצעות מספיק צלחות ללהבטיח צמיחה של מספר רב של מושבות. השתמש בצלחות פטרי גדולות (150 מ&quot;מ) כדי למזער את מספר הצלחות הנחוצות. שחזור transformants באמצעות צלחות מאפשר יעילות שינוי להיות מוערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך Hsp104 WT ובקרות שליליות וקטור במקביל. </li></ol> 3. הקרנה לדיכוי Proteotoxicity <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את המושבות מהצלחות באמצעות תקשורת נשירת raffinose תוספת (למשל SRaff--אורה). השתמש פיפטה סרולוגית והחלה מעץ סטרילי כדי לשחרר את המושבות מהצלחות. העבר את שטיפות נוזל לצינור חרוטי 50 מיליליטר ומערבולת ביסודיות כדי להפריד כל גושים של תאים. לדלל את תרבות מעונן במקצת, OD 600 ~ 0.025. הערה: כאן raffinose משמשת כדי להקל על התאים של דיכוי בתיווך גלוקוז של אינדוקציה, וכך תחול התאים לזירוז בתיווך גלקטוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות בדילול הלילה בתקשורת נשירת raffinose עם רועד ב30 ºC. לגדול WT Hsp104 ובקרות וקטור במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, צלחת טווח ריכוזים על גלקטוז הבודד צלחות (למשל SGal--האורה) (1 μl 2 מיליליטר מרוכז תרבות ב400 μl נפח כולל). ציפוי במגוון רחב של ריכוזים יבטיח כי צלחת תהיה מושבות אחת. הריכוז בפועל נדרש תלוי ברעילות של מצע המחלה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הווקטור ותרבויות Hsp104 WT לOD 600 של הספרייה וצלחת כמויות שווה להשוות צמיחה של הספרייה ביחס לקבוצת הביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך החמרת בחירה, צלחת הספרייה ברמת סוכר (הדחקה) תקשורת. דגירה צלחות במשך 2-3 ימים ב 30 ºC, עד מושבות להופיע (איור 2). להעריך את המושבות וכתוצאה מכך ולהשוות לקבוצת הביקורת. הערה: לעתים קרובות שני מושבות גדולות וקטנות מתקבלות, אבל אין קשר בין גודל מושבה ומעשהivity הוא ציין. מסך להיטים הפוטנציאליים אלה תוך שימוש בטכניקת 5-פואה בחירת דלפק (שלב 4) כדי למזער את התוצאות החיוביות שגויות נשאו מעל לריצוף. </li></ol> 4. 5-פואה Counterselection והאיתור לחסל חיובי שגוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס החוצה מושבות אחת בשני עותקים על גבי מדיה זוגית אחת נשירה (למשל SD--האורה וSD-צלחות) ולגדול לילה בשעה 30 ºC. חזור עם פקדי וקטור וHsp104 WT. ציפוי על SD-לפני 5-פואה מגבירה את היעילות של שלב 5-פואה על ידי הגדלת הסבירות שתאים איבדו את הפלסמיד Hsp104 כאשר הם מצופים על 5-פואה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע צלחות מהתייבשות, לעטוף את SD--אורה צלחות בparafilm ולאחסן ב 4 ºC בעת ביצוע מסך 5-פואה. צלחות אלה סופו של דבר לשמש לריצוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס המושבות מSD-צלחות למושבות אחת על צלחות 5-פואה (YPD תקשורת + 1G / L 5-פואה) ו דגירה של 1-2 ימים ב 30 ו186 #; C עד מושבות אחת מופיע. כאן, 5-פואה הופכת למוצר רעיל (5-fluorodeoxyuridine) בתאים המכילים את גן URA3. כך, כל תאים מקננים עדיין פלסמיד Hsp104 ימותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס מושבות אחת מצלחות 5-פואה בשני עותקים על גבי SD-אורה וSD-צלחות. מבחן 3 מושבות לכל נפגעו כדי להגביר את הסבירות שמושבה אחת לפחות עבור כל פגע תאבד את הפלסמיד Hsp104. דגירה של 1-2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. מושבות שאיבדו את הפלסמיד Hsp104 לא יגדל על SD-צלחות, אך לא צלחות SD-אורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול הזנים שאיבדו פלסמידים Hsp104 לאיתור מבחני. לגדול הזנים לרוויה בתקשורת נשירת raffinose (למשל SRaff-שלו) ב -96 DeepWell 2 צלחות מיליליטר לילה בשעה 30 ºC עם רעד. הקפד לכלול זני שליטת 5-פואה טופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין צלחות לאיתור assay. בעזרת פיפטה רבה, 200 תקשורת נשירת raffinose μl aliquot (למשל SRaff-) לעמודות גם צלחת גם 96, בהזמנת 1 ו -7 לתרבויות המסודרות. Aliquot 250 μl של כל אחד 16 התרבויות רוויות בטורי 1 ו -7 של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרתי לדלל את התרבויות 5 לקפל לתוך כל עמודה של הצלחת, ערבוב ביסודיות עם פיפטה רבה. הסר 50 μl של התרבות בדילול מלא מעמודים 6 ו -12 כדי להבטיח את הנפח הסופי של כל אחד גם הוא 200 μl. זה חיוני כדי להבטיח גם תצפית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי 96-בורג משכפל (Frogger), לזהות את התרבויות בשני עותקים על גבי SD-SGal-צלחות ו. דגירה הצלחות על 30 ºC במשך 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עבור סידור זנים כי תערוכת רעילות על SGal-צלחות דומות לזה של קבוצת הביקורת. בטל זנים חיוביים שקריים שאינם רעילים כמו הפקדים. 5-פואה היא גם לעתים קרובות רעילה בפני עצמו, כל כך להשליך זנים כי תערוכת פגם צמיחה בSD-צלחות או שהם מציגים רעילות משמעותית יותר מאשר מצע המחלה לבד ( <strong&gt; איור 3). </li></ol> 5. סידור גרסאות Hsp104 על ידי המושבה PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים לגרד ~ 10 μl מצלחות SD--האורה ב 3 μl 20 מ&quot;מ NaOH בצינורות רצועת PCR וlyse התאים על ידי ההפשרה הקפאה. מניחים את צינורות הרצועה במקפיא -80 ºC למשך 10 דקות או בחנקן נוזלי, ואז לדגור על 99 ºC בthermocycler למשך 10 דקות. לדלל את הזנים למי כיתה PCR 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PCR תגובות: תבנית PCR 5 μl, 0.5 μl 100 מיקרומטר כל צבע יסוד, 10mm dNTPs 0.5 μl, 0.25 DNA פולימרז μl במאגר PCR, ולעשות עד נפח כולל של 25 μl עם מים כיתה PCR. פריימרים עיצוב כדי להגביר את האזור באופן אקראי בתוספת כ -100 נ&quot;ב בכל קצה. מזער את הגודל של האזור המוגבר כדי להגדיל את הסיכוי של הגברה מוצלחת. להפעיל תכנית PCR סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח דגימות על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה של מוצר ה- PCR של siz המתאיםדואר. חזור PCR אם אין מוצר קיים. הערה: הכשל בPCR הוא בדרך כלל עקב יותר מדי שמרים בשימוש בשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דגימות לרצפי DNA. הסר פריימרים PCR או על ידי טיהור PCR או באמצעות מגיב ניקוי מוצר ה- PCR כמו exonuclease אני ושרימפס אלקליין phosphatase אנזים (ExoSAP-IT) לבזות DNA חד גדילים. מגיב זה אנזימי מדרדרת פריימרים וdNTPs מאוגדים, המאפשר תפוקה גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף מוצרי ה- PCR. הקפד לנתח ביסודיות chromatograms רצף למוטציות. מוטציות אפשר לראות כתערובת של שני נוקלאוטידים באתר נתון (איור 4), כמרים לעתים קרובות נמל פלסמידים מרובים. </li></ol>

<ol><li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS%2FTLS%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases%3A+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li>
<li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress%2C+aging%2C+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li>
<li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li>
<li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li>
<li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+reveal+a+%27druggable%27+Rsp5%2FNedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li>
<li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein%2C+alpha-synuclein%2C+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li>
<li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+model+of+FUS%2FTLS-dependent+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li>
<li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp104%3A+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li>
<li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li>
<li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li>
<li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittrup%2C+KD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoeke%2C+JD+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).</li>
<li>Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyazaki%2C+K+%22eds+FrancesH+Arnold+%26+George+Georgiou%22">eds FrancesH Arnold & George Georgiou</a>. 231, Humana Press. 23-28 (2003).</li>
<li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+machines+for+protein+folding%2C+unfolding+and+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li>
<li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+suite+of+Gateway%C2%AE+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מציגים את הגישה שלנו לבידוד גרסאות Hsp104 potentiated המדכאות את הרעילות של מצעים הקשורים למחלות באמצעות מודלים השמרים proteinopathy. שימוש בגישה זו, ספריות גדולות של גרסאות יכולות להיות מוקרנת בתפוקה גבוהה, עם המגבלה היחידה להיות מספר הגרסאות שעוברות מסך המשני 5-פואה. על ידי ביצוע השלבים הבאים בפורמט 96 גם, אנו שגרתי מסך עד 200 להיטים בכל פעם בשלב 5-פואה במהלך 1-2 שבועות. מספר הלהיטים שהתקבלו במהלך שלב הסינון הראשוני ישתנה בהתאם במידה רבה על רעילות מצע והאיפור של כל ספריי...

המודלים proteinopathy השמרים פותחו לטיפול בהפרעות misfolding חלבון כוללים מחלת ניוון (ALS) ופרקינסון (PD) 1-3. ביטוי של החלבונים TDP-43 וFUS, שmisfold בחולי ALS, הם רעיל וmislocalize כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 1,2. בדומה לכך, הביטוי של α-סינוקלאין (α-SYN), אשר היה מעורב בPD, הוא רעיל וmislocalizes כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 3. תכונות אלה לשחזר פנוטיפים בחולים עם הפרעות אלה 4,5. כך, שמרי מודלים לספק פלטפורמה שימושית עבור בדיקות סקר לאיתור חלבונים או מולקולות קטנות המונעים או הפוך פנוטיפים אלה 2,6-13. אנו מעוניינים בפיתוח של חלבונים המסוגלים היפוך צבירה ורעילות בשל TDP-43, FUS, וα-syn. אנו מתמקדים בHsp104, AAA + חלבון משמרים כי הוא מסוגל ריסוק חלבונים ייחודי הן frאגרגטים אום אמורפי ועמילואיד בשמרים, אך אין לה homologue אדם 14,15. Hsp104 רגיש ועדין לdisaggregate פריונים שמרי אנדוגני ויש לו רק יכולת מוגבלת disaggregate מצעים המעורבים במחלות ניווניות אנושיות, שזה אף פעם לא נתקל בדרך 16,17. כך, אנו שואפים להנדס גרסאות משופרות של Hsp104 כי הם מסוגלים disaggregate efficaciously מצעים האנושיים אלה. לשם כך, אנו בונים ספריות גדולות של Hsp104 גרסאות באמצעות PCR ומועד לשגיאות; יכולות להיות מוקרנת ספריות אלה באמצעות המודלים השמרים proteinopathy 17. אנחנו אימצנו גישה ממוקדת-תחום לבניית וסינון ספריות, כHsp104 הוא גדול מאוד 17. אנחנו בתחילה התמקדנו בתחום ביניים (MD) של Hsp104 17, אם כי יכולים להיות מועסקות גישות דומות לדומיינים אחרים. מודלים אלה מאפשרים בדיקות סקר לאיתור פעילות Disaggregase ישירות, בניגוד לטכניקות חלופיות כגון תצוגה לפני שטח, ושארricted להשתמש לניטור מחייב 18. הפרוטוקול שלנו מבוסס על שני שלבי סינון (איור 1). ראשית, גרסאות Hsp104 המדכאות את הרעילות של מצע המחלה בשמרים נבחרות. לשם כך, Hsp104 גרסאות ו- קשור מחלה מצעם cotransformed לשמרי Hsp104 Δ. אנו מעסיקים שמרי Hsp104 Δ ללחקור את חלל רצף Hsp104 בהעדר wild-type (WT) Hsp104 17. חשוב לציין, מחיקה של Hsp104 אינה משפיעה על α-syn, FUS, או TDP-43 רעילות בשמרים, וביטוי של Hsp104 WT מספק הצלה מינימאלית 1,13,17. השמרים אז מצופים על גרימת תקשורת כדי לגרום לביטוי של שני החלבונים. שמרים מחסה גרסאות Hsp104 המדכאות רעילות של הצמיחה מקנה המצע הקשורים למחלות של המושבה. גרסאות אלו נבחרו לניתוח נוסף, בעוד שמושבות שמירת גרסאות שאינו לדכא למות רעילות. עם זאת,תוצאות חיוביות שגויות הן בעיה משמעותית במסך זה. הביטוי של TDP-43, FUS, וα-syn הוא רעיל ביותר, אשר יוצר לחץ סלקטיבי חזק להופעתו של מדכאי גנטיים ספונטניים של רעילות שאינה קשורה לגרסת Hsp104 לידי ביטוי. כך, יש לנו להשתמש במסך משני שהוא גם גבוהה יחסית תפוקה לחסל מדכאי רעילות ספציפיים אלה 17. במסך המשני זו, מטופלים שמרים נבחרים עם 5-Fluorootic חומצה (5-פואה) כדי להתמודד בחר לפלסמיד Hsp104 19. אז הזנים נבחנים לגבי מצע רעילות (TDP-43, FUS, או α-SYN) באמצעות איתור assay כדי להבטיח שהרעילות של המצע משוחזרת לאחר אובדן פלסמיד Hsp104. כך, שמרים שברעילות משוחזרת במסך משני זה כנראה שבעבר הוצגו דיכוי רעילות בשל נוכחותם של גרסת Hsp104. השמרים הללו מיועדים &#39;להיטים&#39; ופלסמיד Hsp104 צריך להיות אזהתאושש ורצף לזהות מוטציות בגן Hsp104 17 (איור 1). כל להיטים אז צריכים להיות אושר על ידי בניית המוטציה באופן עצמאי באמצעות מוטגנזה מכוונת ולאחר מכן בדיקה חוזרת לדיכוי רעילות. היישומים האפשריים עבור פרוטוקול זה הם רחבים. שימוש בשיטות אלה, ספריות מכל סוג של חלבון יכולות להיות מוקרנת לגרסות המדכאות רעילות של כל חלבון מצע כי הוא רעיל בשמרים.

<table><tbody><tr><td>GeneMorphII EZClone תחום מוטגנזה ערכת</td><td>Agilent</td><td>200552</td><td></td></tr><tr><td>150 מ"מ צלחות פטרי</td><td>פלקון</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>5-מוצרי מחקר חומצה פלואורוטית</td><td>בינלאומי</td><td>f10501-5.0</td><td></td></tr><tr><td>96-DeepWell 2 מ"ל צלחות</td><td>Eppendorf</td><td>0030 502.302</td><td></td></tr><tr><td>96 כלי משכפל מודגש</td><td>V& P Scientific</td><td>vp-404</td><td></td></tr><tr><td>ExoSAP-IT</td><td>Affymetrix</td><td>78200</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד דוגמניות proteinopathy שמרי שימוש potentiated hsp104 גרסאות

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

ניתן לעצב הפרעות רבות של קיפול שגוי של חלבון בשמרים הניצנים Saccharomyces cerevisiae. חלבונים כמו TDP-43 ו-FUS, המעורבים בטרשת אמיוטרופית צידית, ו-α-synuclein, המעורבים במחלת פרקינסון, הם רעילים ויוצרים אגרגטים ציטופלזמיים בשמרים. תכונות אלה מסכמות פתולוגיות חלבון שנצפו בחולים עם הפרעות אלה. לפיכך, שמרים הם פלטפורמה אידיאלית לבידוד מדכאי רעילות מספריות של גרסאות חלבון. אנו מעוניינים ליישם דיסאגרגזים של חלבונים כדי לחסל קונפורמרים רעילים של חלבונים רעילים. באופן ספציפי, אנו מהנדסים Hsp104, חלבון AAA+ הקסמרי משמרים המסוגל באופן ייחודי להמיס הן אגרגטים לא מסודרים והן עמילואיד ולהחזיר את החלבונים לקונפורמציות המקוריות שלהם. בעוד ש-Hsp104 נשמר מאוד באיקריוטים ובאובקטריה, אין לו הומולוג מטזואני ידוע. ל-Hsp104 יש יכולת מוגבלת בלבד לחסל אגרגטים לא מסודרים וסיבי עמילואיד המעורבים במחלות אנושיות. לפיכך, אנו שואפים להנדס גרסאות Hsp104 כדי להפוך את קיפול החלבון המעורב בהפרעות ניווניות. פיתחנו שיטות לסינון ספריות גדולות של גרסאות Hsp104 לדיכוי רעילות פרוטאוטוקסיות בשמרים. מכיוון ששמרים נוטים לדיכוי רעילות ספונטני ולא ספציפי, פותח תהליך סינון דו-שלבי כדי למנוע תוצאות חיוביות כוזבות. באמצעות שיטות אלה, זיהינו סדרה של גרסאות Hsp104 מוגברות המדכאות בעוצמה את הרעילות והצבירה של TDP-43, FUS ו-α-synuclein. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול האופטימלי הזה, שניתן להתאים לספריות מסך שנבנו באמצעות כל עמוד שדרה חלבוני לדיכוי הרעילות של כל חלבון רעיל בשמרים.

בנינו ספרייה של גרסאות Hsp104 אקראיות בתחום האמצע והקרנו אותו לדיכוי TDP-43 רעילות. הספרייה הפכה ומצופית על גלוקוז וגלקטוז צלחות (איור 2) על מנת להעריך את החומרה של המסך. מושבות אחת נבחרו והזנים נבחרו דלפק באמצעות 5-פואה לחסל את הפלסמיד Hsp104. זנים אלה ולאחר מכן נבדקו כדי לאשר רעילות שנבע TDP-43 לבד, ללא גרסאות Hsp104. מבחני איתור של קבוצת משנה של הגרסאות שנבחרו במסך הראשוני הראו כי של 4 המושבות שנבחרו, 2 מוצג דיכוי TDP-43 רעילות תיווך Hsp104, 1 היה חיובי כוזב, ו...

מודלים של חלבוני שמרים הם כלים רבי ערך להערכת הרעילות והצבירה של חלבונים המעורבים במחלה. כאן, אנו מציגים שיטות לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 עבור מדכאי רעילות. ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לסנן כל ספריית חלבונים לאיתור מדכאי רעילות של כל חלבון רעיל בשמרים.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

מטרת הניסוי הבא היא לסנן ספריות HS P 1 0 4 לבחירת גרסאות המדכאות את הרעילות של החלבונים הקשורים להפרעות קיפול חלבונים. זה מושג על ידי שינוי משותף של ספריות וריאנטים HSP 1 0 4 עם מצע הקשור למחלה בשמרים ו-coex המבטא את שני החלבונים כשלב שני. השמרים שנבחרו מטופלים בחמש חומצה אוטית פלואור או חמישה FOA כדי לבחור נגד הפלסמיד HSP 1 0 4.לאחר מכן, הפגיעות מרוצפות על ידי הגברת אזור המוטגן על ידי PCR של מושבה או זיהוי המוטציות בגן HSP 1 0 4. בסופו של דבר, ניתן להעריך את דיכוי הרעילות של המצע הקשור למחלה כדי לזהות את גרסאות HS P 1 0 4 המבטיחות ביותר לאפיון נוסף. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בחירות מבוססות קשירה, הוא שטכניקה זו מאפשרת בחירה של גרסאות המדכאות את הרעילות של המצע הקשור למחלה.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום קיפול החלבונים על ידי זיהוי החלבונים שיכולים להפוך את קיפול החלבון הלא נכון. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חיזוק HS P 1 0 4, ניתן ליישם אותה גם על ספריות סינון של כל חלבון לדיכוי הרעילות של כל מצע רעיל בשמרים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שייתכן שיהיה צורך לסנן מושבות רבות כדי למצוא להיטים תקפים כדי לסנן את דיכוי רעילות הפרוטאה התחל בשטיפת HSP 1 0 4 מושבות מהצלחות עם חומר נשירה בתוספת רפינוז, פיפטה סרולוגית ועץ סטרילי ואפליקטורים מעבירים את שטיפות הנוזל לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומערבולת את המושבות ביסודיות כדי להפריד את כל גושי התאים.לאחר מכן, יש לדלל את תרחיף התאים לתרבית מעט עכורה ולגדל את התאים למשך הלילה באמצעי נשירה של רפינוז עם טלטול ב-30 מעלות צלזיוס. גדל את ה-HSP 1 0 4 סוג הבר ובקרות הווקטור במקביל גם בשלב זה. צלחת הבוקר שלאחר מכן, טווח של ריכוזי תאים על לוחות גלקטוז בודדים כדי ליצור לפחות צלחת אחת לכל קבוצה עם מושבות בודדות.לנרמל את הווקטור ואת תרביות מסוג עולם HSP 1 0 4 ל-OD 600 של הספרייה והצלחת. נפחים שווים של תאים אלה לריכוזי הזן הניסיוני כדי להשוות את צמיחת הספרייה ביחס לבקרות כדי להעריך את הבחירה. קפדנות גם לוחית את הספרייה על מדיה מדכאת גלוקוז ולאחר מכן דוגרת על כל הצלחות למשך יומיים-שלושה ב-30 מעלות צלזיוס עד שנראה שהמושבות משתמשות בחמישה FOA לבחירת התאים, שכבר לא שומרים על HSP 1 0 4 פלסמידים המבטאים את הפסמידים הבאים החוצה את המושבות הבודדות מכל זן בשכפול על צלחות מדיה כפולות ובודדות לכל דגירה של לילה ב-30 מעלות צלזיוס.צלחות אלו ישמשו לרצף מאוחר יותר כדי למנוע את התייבשות הצלחות. עטפו את לוחות היורו של ה-SD בסרט פרה והתקינו אותם בארבע מעלות צלזיוס תוך כדי ביצוע חמשת מסך ה-FOA. לאחר מכן פס את המושבות מלוחות השריקה SD למושבות בודדות על חמש לוחות FOA למשך יום עד יומיים בדגירה של 30 מעלות צלזיוס עד להופעת מושבות בודדות. הבא.מכל חמש צלחת FOA, בחר ופס. שלוש מושבות ששרדו על SD Euro אחד ו-SD אחד הצלחת שלו לכל מושבה ששרדה לאחר יום או יומיים של דגירה ב-30 מעלות צלזיוס. המושבות שאיבדו את הפלסמיד HSP 1 0 4 יגדלו על לוחות SD hiss, אך לא על לוחות SD Euro.הגדל את הזנים הללו לרוויה במדיה של נשירה רפינוז ב 96. באר עמוקה שתי צלחות מיליליטר למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול. לאחר מכן, כדי למנוע תוצאות חיוביות כוזבות, בצע בדיקת תצפית.לקראת סוף הדגירה יש פיפטה רב-ערוצית כדי להכיל 200 מיקרוליטר של אמצעי נשירה של רפינוז לבאר לצלחת חדשה של 96 בארות השומרת עמודים אחד ושבע לתרבויות מסודרות. לאחר מכן, יש להקצות 250 מיקרוליטר מכל אחת מ-16 התרביות הרוויות לעמודות אחת ושבע של הצלחת ולדלל באופן סדרתי את התרביות פי חמישה לכל עמודה של הצלחת, תוך ערבוב יסודי עם הפיפטה הרב-ערוצית. לאחר מכן, כדי להבטיח כתמים אחידים, הסר 50 מיקרוליטר מהתרבית המדוללת מעמודה 6 ו-12 כדי להבטיח שהנפח הסופי של כל באר הוא 200 מיקרוליטר.לאחר מכן השתמש בכלי משכפל 96 וולט כדי לזהות את התרביות המשוכפלות על לוחות SD hiss ו-escal. לאחר דגירה של יומיים-שלושה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, בחר את זני הריצוף המציגים רעילות על לוחות השריקה של האסקל. בדומה לזה של הבקרה, ניתן להשליך זנים חיוביים כוזבים, שאינם רעילים כמו הבקרות.השלך גם זנים המציגים פגם בגדילה על ה-sd. הצלחות שלו או אלה מציגות רעילות גדולה יותר באופן משמעותי ממצע המחלה בלבד. כדי לרצף את גרסאות HSP 1 0 4 על ידי PCR מושבה, ראשית מגרדים כ-10 מיקרוליטר שמרים מלוחות היורו של SD לשלושה מיקרוליטרים של 20 מילי-נתרן הידרוקסיד בצינורות מופשטים של PCR כדי להפשיר את התאים על ידי הפשרת הקפאה.ראשית מניחים את הרצועות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות במקפיא, דגרו את הצינורות בטמפרטורה של 99 מעלות צלזיוס בתרמוסייקלר למשך 10 דקות, ולאחר מכן דללו את הזנים ל-100 מיקרוליטר במים בדרגת PCR באמצעות ריכוז פריימר גבוה. לאחר מכן, הפעל תוכנית PCR סטנדרטית על הדגימות, ולאחר מכן נתח את הדגימות על ידי אלקטרופורזה אג'ל כדי לאשר את ההגברה של מוצר PCR בגודל המתאים.לבסוף, רצף את מוצרי ה-PCR תוך הקפדה על ניתוח יסודי של כרומטוגרמות הריצוף למוטציות. ניתן להבחין במוטציות כתערובת של שני נוקלאוטידים לאתר נתון מכיוון ששמרים מכילים לעתים קרובות פלסמידים מרובים. בניסוי מייצג זה, לאחר בניית ספרייה של גרסאות HSP 1 0 4 שחולקו באופן אקראי בתחום האמצעי, הספרייה הפכה לשמרים המכילים פלסמיד לביטוי TDP 43 המעורר גלקטוז.לאחר מכן נאספו הטרנספורמנטים וציפו אותם על לוחות גלוקוז וגלקטוז כדי להעריך את חומרת המסך נבחרו להיטים מלוח הגלקטוז. לאחר חמש בדיקות איתור טיפול ב-FOA של תת-קבוצה של הגרסאות שנבחרו במסך הראשוני. צוין כי מבין ארבע המושבות שנבחרו, שתיים הראו HSP 1 0 4, תיווכו דיכוי רעילות TDP 43.אחד היה חיובי כוזב ואחד הראה רעילות מוגברת. לאחר חמישה טיפולים ב-FOA, שתי הפגיעה האמיתית רוצפו על ידי PCR של המושבה כדי לזהות את המוטציות בתחום האמצעי. לאחר מכן ניתן לבצע מוטציות HSP P 1 0 4 אלה בפלסמיד HSP 1 0 4 ההורה על ידי מוטגנזה מכוונת אתר כדי לאשר את דיכוי הרעילות שלהן לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן עד 200 פגיעות בכל פעם בחמשת ה-FO, שלב במהלך שבוע עד שבועיים אם היא מבוצעת כראוי.בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לנתח בקפידה את תוצאות הריצוף שכן לעתים קרובות מתקבלות תערובות של פלסמידים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לעזור לענות על שאלות נוספות כגון, כיצד גרסאות HSP 1 0 4 משפיעות על הצטברות המצע הקשור למחלה? לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסנן ספריות של גרסאות HSP 1 0 4 לבחירת מדכאי רעילות.

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה...

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים...

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

מאמר זה מתאר פרוטוקולים כדי להעריך את ההשפעה של חלבונים פלורסנט על צבירה ורעילות של התרחבות misfolded polyglutamine על הערכה מהירה של חלבון פלואורסצנטי uncharacterized לאחרונה בהקשר של עיתונאים פלורסנט.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

פרוטוקול זה מתווה נהלים ניסיוני לאפיון הגנום כולו לשינויים ברמות של היסטון post-translational שינויים (PTM) המתרחשים בהקשר ביטוי של חלבונים הקשורים ALS מחלת פרקינסון ב מודלים האפייה . לאחר ההפרדה מרחביות-דף, רמות PTM היסטון בודדים מזוהים עם נוגדנים ספציפיים שינוי באמצעות סופג המערבי.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

חקור שיטה לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 לזיהוי מדכאי רעילות חלבונים במודל שמרים. הטכניקה מאפשרת בחירת וריאנטים המדכאים רעילות של חלבונים מקופלים שלא כהלכה ותורמת להבנת הפרעות קיפול חלבון.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

גלה סרטונים נוספים