קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין ללא משוא פנים מיקרו-רנ"א לריצוף תפוקה גבוהה. זה מושג על ידי הכנה או רכישה של אוליגונוקלאוטידים של DNA הכשירים לקשירה לשלושת הקצוות העיקריים של המיקרו RNA. השלב השני הוא לקשור את שלושת האוליגונוקלאוטידים הראשוניים של ה-DNA לשלושת הקצה הראשוני של המיקרו-RNA.

לאחר מכן, תוצר הקשירה מטוהר בג'ל ומקשר חמשת האוליגונוקלאוטידים העיקריים של ה-RNA נקשר לקצה החמישי של המיקרו-RNA. השלב האחרון הוא להמיר את המולקולות ההיברידיות ל-CDNA ולאחר מכן להגביר את ה-CDNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז. בסופו של דבר, שיבוט מיקרו RNA וריצוף תפוקה גבוהה משמשים להצגת הפרופיל הרחב של הטרנסקריפטום של מיקרו-RNA בצורה כמותית ברזולוציית נוקלאוטידים בודדים.

היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו על פני טכניקות קיימות כגון כתם qPCR מיקרו-רצף מיקרו-קרניים, הוא שהטכניקה שלנו משקפת יותר את רמת המיקרו-קרני בפועל בקנה מידה מעבדתי רחב ברזולוציית נוקלאוטיד יחידה. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ביולוגיה של מיקרו-RNA, ניתן ליישם אותה גם על טכנולוגיות ריצוף אחרות בתפוקה גבוהה כמו HC clip ו-RNA-Seq. אוליגונוקלאוטידים של ה-DNA להליך זה מיועדים לשלוש תגובות קשירה ראשוניות וצריכים להיות בעלי קבוצת פוספט ראשונית של חמישה ראשוניים, דינוקלאוטיד אקראי בקצה חמשת הראשוניים וציטוזין תלת-ראשוני לדלל את אוליגונוקלאוטידים של ה-DNA ל-100 מיקרו-מולר במים נטולי נוקלאז.

הרכיבו את תגובת האוורור על ידי שילוב ריאגנטים אלה: 200 פיקו מול של שלושת האוליגונוקלאוטידים המקשרים הראשוניים, ארבעה מיקרוליטרים של חמישה מאגר אוורור DNA ראשוני, ארבעה מיקרוליטרים של TP, ארבעה מיקרוליטרים של M-T-H-R-N-A, ליגאז ומים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 40 מיקרוליטר. דגרו את התגובה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה. סיים את התגובה על ידי חימום ל 85 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

זרז את מקשר ה-TED על ידי הוספת 2.5 נפחים של 100% אתנול ושליש נפח של 10 אמוניום אצטט מולארי. כדי להסיר שאריות TP ולמנוע קשירה בלתי צפויה בתגובות עתידיות, ערבבו את תמיסת האלכוהול, המלח והאוליגונוקלאוטיד להומוגניות על ידי סיבוב במהירות מלאה במיקרו צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שטפו את הגלולה ב-70% אתנול יבש באוויר והשעו את הגלולה בנפח המתאים של מים נטולי נוקלאז כדי להניב 50 עד 100 מיקרומולר של אוליגונוקלאוטיד מאוורר.

אשר אוורור של האוליגונוקלאוטיד על ידי אלקטרופורזה על ג'ל פולי אקרילאמיד 18%. הפעל מראש את הג'ל למשך 30 דקות ברוחב של 24 וולט סנטימטר ג'ל עם מאגר פועל XTBE אחד בטמפרטורת החדר. לאחר תום 30 הדקות, שטפו את הבארות עם חיץ זורם.

אוליגונוקלאוטידים של ה-DNA להליך זה מיועדים לשלוש תגובות קשירה ראשוניות וצריכים להיות בעלי קבוצת פוספט של חמישה ראשוניים, דינוקלאוטיד אקראי בקצה חמשת הראשוניים ואוקסיטוצין בעל שלושה ראשוניים. לדלל את האוליגונוקלאוטידים של ה-DNA ל-100 מיקרו-מולר במים נטולי נוקלאז. יש להריץ את הג'ל ב-24 וולט לסנטימטר עד שהברומו פנול הכחול נמצא שלושת רבעי הדרך לתחתית עמוד הג'ל.

מכתים את הג'ל בתמיסת סייבר זהב אחת ב-XTBE אחד והדמיינו על קופסת טרנס-לומינטור UV. צריך להיות שינוי נוקלאוטיד יחיד בגודל האוליגונוקלאוטיד של ה-DNA שהיה נתון לאוורור על ידי M-T-H-R-N-A ליגאז עבור תגובת שלושת הקשירה הראשונית. הרכיבו את הרכיבים הבאים על קרח בסדר זה.

מיקרוליטר אחד של 50% PEG 8, 000 0.5 מיקרוליטר של 10 XRNA ligase buffer. מיקרוליטר אחד של מקשר תלת-ראשוני מאוורר, 0.5 מיקרוליטר של מעכב RNA 0.5 עד שמונה מיקרוגרם של RNA כולל, 0.5 מיקרוליטר של T ארבעה RNA Ligase 2 ומים ללא נוקלאז לנפח סופי של חמישה מיקרוליטר. מערבבים את התגובה על ידי פיפטינג לאחר ערבוב יסודי.

מניחים את התגובה במחזור תרמי עם מכסה מחומם. הגדר את הבלוק ל -16 מעלות צלזיוס ודגירה למשך ארבע שעות. שימו לב שניתן להגדיל את התגובה לנפח סופי של 20 מיקרוליטר ללא כל אובדן ביעילות הקשירה.

לאחר שלושת הקשירה הראשונית, מערבבים את התגובה עם נפח שווה של שני חום חיץ טעינת XRNA ל-70 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות ומצננים על קרח. הג'ל הבא. טהר את הדגימה על ג'ל פולי אקרילאמיד 15%.

הפעל מראש את הג'ל ברוחב של 24 וולט סנטימטר למשך 30 דקות לפחות. כבה את אספקת החשמל ושטוף את הבארות עם מאגר פועל. טען את הדגימה והפעל את הג'ל באותו מתח כמו הריצה המוקדמת עד שפנול הברומו שנשף בדיוק יצא מהג'ל.

המוצר הרצוי ינדוד קרוב לקסילן ציאן כאשר האלקטרופורזה של ג'ל פולי אקרילאמיד תושלם. מניחים את הג'ל במגש נקי עם מאגר ריצה אחד ו-x זהב סייבר אחד וסלעים למשך 15 דקות. הסר את הג'ל מכלי הצביעה ודמיין על קופסת טרנסלומינטור UV מכוסה בניילון נקי.

תוצר הקשירה צריך להיות באורך של כ-45 נוקלאוטידים. מכיוון שתוצר קשירה זה בדרך כלל אינו נראה, חשוב לכלול דגימת RNA סינתטי בקרה חיובית בנתיב הסמוך באמצעות סכין גילוח נקי, האזור המכיל את תוצר הקשירה. מונחה על ידי המיקומים של דגימת ה-RNA הסינתטי ותקני הגודל.

מניחים את שבר ג'ל הבלו בצינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר. חודרים את החלק התחתון של צינור המיקרו צנטריפוגה בנפח 0.5 מיליליטר עם מחט בגודל 30 ומניחים את צינור הפירס בצנטריפוגה שנייה נקייה ונמוכה, 1.5 מיליליטר למשך חמש דקות בכ-15,000 פעמים. G. אשר חזותית שכל פרוסת הג'ל עברה דרך החור בצינור הפנימי.

במידת הצורך, השתמש בקצה פיפטה נקי כדי לדחוף כמה שברי ג'ל קרוב יותר לחור. השלך את הצינור הריק של 0.5 מיליליטר והוסף 400 מיקרוליטר של מאגר עמוד מלח גבוה לתמיסת האקרילאמיד. נענעו את הצינור בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה למחרת.

העבירו את התרחיץ לעמוד ספין אצטט תאית 0.22 מיקרון באמצעות צנטריפוגה עם קצה פיפטה רחב למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר בערך פי 15,000. G כדי לאסוף את כל הנוזלים הרחק ממטריצת הג'ל האקרילאמיד. העבירו את הנוזל לצינור נקי של 1.5 מיליליטר המכיל מיקרוליטר אחד של תמיסת גליקוגן של 20 מיליגרם למיליליטר.

הוסף נפח שווה של איזופרופנול ונפח עשירי של נתרן אצטט וערבב את התמיסה על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. משקעים במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. צנטריפוגה במלוא המהירות בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.

כדי לגלול את חומצת הגרעין, הסר את החנוך ושטוף באוויר אתנול 70%. יבש את הגלולה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והמשך ישירות לשלב חמשת הקשירה העיקרית. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף את הרכיבים הבאים לחומצת הגרעין שגלולה קודם לכן, שני מיקרוליטר של PEG 8, 000 0.5 מיקרוליטר של מאגר RNA Ligase, 0.5 מיקרוליטר של TP 0.5 מיקרוליטר של מקשר, RNA אוליגונוקלאוטיד ומים לנפח סופי של ארבעה מיקרוליטר.

מערבבים דגימה זו על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שוב ושוב עד חמש דקות כדי להבטיח שהגלולה מסיסה מחדש לחלוטין. לאחר שהגלולה בתמיסה, העבירו את התוכן לצינור PCR נקי המכיל מיקרוליטר אחד של תערובת אחד לאחד של מעכב RNA ו-T ארבעה RNA ליגאז אחד מעורבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. דגרו את התגובה במחזור תרמי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

לאחר השלמת התגובה, המשך מיד לסינתזה של CD NA כמתואר בטקסט הפרוטוקול לאחר קשירת המקשר לשלושת הקצוות הראשוניים של RNA וניתוח עמודים של התגובות. רצועות חדות במשקל מולקולרי גבוה ניכרות באזור 100 עד 300 הנוקלאוטידים של הג'ל, מה שמעיד על כך שדגימת ה-RNA הכוללת המשמשת היא באיכות גבוהה. האות הבהיר מאוד באזור 25 הנוקלאוטידים של הג'ל הוא עודף RNA סינתטי של שלושה מקשרים ראשוניים לא קשור מצביע על קשירה שבוצעה עם חמישה פיקומולים של מיקרו RNA סינתטי ושלושה מקשרים ראשוניים, שטוהרו בג'ל.

מוצגת כאן רדיוגרמה אוטומטית של שלוש תגובות קשירה ראשוניות שבוצעו עם P 32 5 ראשוני ומסומן מיקרו RNA סינתטי. מספר השעות שבהן הותר לתגובה להמשיך מצוין בחלק העליון, והמספרים בתחתית מציינים את הכמויות שנקשרו כאחוז מסכום הבלתי קשורים והקשורים. רדיוגרמה אוטומטית זו היא של חמש תגובות קשירה ראשוניות המבוצעות עם P 32 5 קצה ראשוני המסומן מיקרו RNA סינתטי שלושה היברידיות מקשרות ראשוניות.

המספרים בתחתית מציינים את הכמויות שנקשרו כאחוז מסכום הלא קשורים והקשורים, וחושפים את החשיבות של שימוש בריכוז גבוה של PEG 8,000 R-N-A-D-N-A קטן. ספריות התואמות לריצוף תפוקה גבוהה נוצרות לאחר מכן על ידי PCR. המספר הנכון של מחזורי PCR נקבע באופן אמפירי.

בדוגמה זו, גודל תוצר ה-DNA הצפוי הוא 146 זוגות בסיסים לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו כראוי תוך יומיים בלבד. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב לזכור לשמור על כל הקצוות והצינורות נקיים מ-RNAs.