Name: קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: למד שיטה לקשירת microRNA בשתי שלבי ליגציה וריצוף תפוקה גבוהה. השיטה מאפשרת כימות גנומי מדויק של miRNA ברזולוציית נוקלאוטיד בודד לחקר תפקידי רגולציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להודות לחברי מעבדת יי ובמיוחד לג'אוג'י ז'אנג על דיונים פוריים בנוגע לתכנון קישורים ויעילות הקשירה, כמו גם לאגודה האמריקאית לסרטן על תמיכתם בעבודה זו באמצעות מלגת פוסט-דוקטורט (#125209) ל-J.E.L. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך גם על ידי המכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס R01AR059697 (לר.י.) ומענק מחקר ממכון לינדה קרניק לתסמונת דאון. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הערה: זה קריטי כדי לשמור על תנאי RNase ללא במהלך ההליך כולו. 1. Adenylation של 3 &#39;לינקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל oligonucleotide DNA המיועד לתגובות קשירה &#39;3 עד 100 מיקרומטר בH nuclease ללא 2 O. הערה: oligonucleotide צריך &#39;קבוצת פוספט, dinucleotide אקראי ב5&#39; 5 הסוף, וdideoxycytosine &#39;3. 5 &#39;קבוצת פוספט היא דרישה של אנזים MTH ל5 יעיל&#39; adenylation 10. פוספט ניתן להוסיף על ידי טיפול מקדים של oligonucleotide עם kinase polynucleotide, או הורה עם השינוי באופן ישיר. Dinucleotide האקראי בסוף &#39;5 הוא חשוב למזעור העדפת הרצף שתערוכת ligases RNA לסוף-סוף מסוים הצטרפות תגובות על פני אחרים 6. 3 &#39;dideoxycytosine מציב אלמנט חסימה ב3&#39; סוף t oligonucleotideo מעכב את ההיווצרות של concatamers מקשר מקשר במהלך שלבי קשירה לאחר מכן ומשמש גם לחסום &quot;סוף מולקולת מירנה-לינקר נוצרה בסוף 3 &#39;3 תגובת קשירת 11. רצף מקשר oligonucleotide שנבחר לשיטת miR-Seq משוחד הוא כדלקמן: 5&#39;PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את התגובה הבאה adenylation: 200 pmol 3 &#39;oligonucleotide מקשר, 4 μl 10x 5&#39; חיץ adenylation DNA, 4 μl 1 מ&quot;מ ATP, 4 μl האנזים MTH RNA, H nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 40 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תגובה על 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לסיים תגובה על ידי חימום עד 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז מקשר adenylated על ידי התוספת של 2.5 כרכים של 100% אתנול ו 1/3 נפח של 10 אצטט M אמוניום להסיר ATP שייר ולמנוע ligations בלתי צפוי בתגובות עתידיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, לערבב אלcohol, מלח, ופתרון אוליגו להומוגניות, מסתובב במהירות מלאה בmicrocentrifuge (~ 15,000 XG) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שטוף את הכדור באתנול 70%, אוויר יבש, וגלול בנפח המתאים של H nuclease ללא 2 O להניב 50-100 מיקרומטר של אוליגו adenylated. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר adenylation על ידי הפעלת ג&#39;ל polyacrylamide 18%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הג&#39;ל על ידי הערבוב הבא ביחד: 6.3 אוריאה g, 6.75 מיליליטר של acrylamide 40%, ו -1.5 מיליליטר של 10x TBE. הוספת H 2 O ל -15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עד האוריאה נמס לגמרי ולהוסיף 150 μl 10% (w / v) persulfate אמוניום (APS) ו -15 tetramethlyethylenediamine μl (TEMED). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שג &#39;קבע, שלפני ריצה למשך 30 דקות ב 24 V / סנטימטר של רוחב ג&#39;ל עם TBE 1x חיץ פועל בטמפרטורת חדר. ברגע 30 דקות היא עד בארות מיושרות עם הפעלת מאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 5 pmol של אוליגונוקלאוטידים adenylated עם ונפח שווה של חיץ טעינת RNA denaturing 2x (95% v / v) Formamide (,0.02% (w / v) SDS, 0.02% bromophenol כחול (w / v), 0.01% (w / v) קסילן Cyanol, 1.0 מ&quot;מ EDTA), חום לזמן קצר ל -75 מעלות צלזיוס, וצמד מקורר בקרח. לוותר מדגם כולו לתוך הבאר של הג&#39;ל. כמו כן כולל סכום זהה של שליטה שאינה adenylated, ותקני גודל משקל מולקולריים נמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 24 V / סנטימטר עד bromophenol הכחול הוא ¾ מהדרך לתחתית הג&#39;ל. לפרק מנגנון, ג&#39;ל לאחר כתם עם פתרון SYBR-זהב 1x ב1x TBE ולדמיין על תיבת UV-transilluminator (איור 2). הערה: ג&#39;ל לטהר את אוליגו adenylated באופן דומה לזה שתואר לעיל, אם &quot;אין RNA קלט&quot; בקרות וכתוצאה מכך כמות גבוהה של מוצר ה- PCR בהשוואה לדגימות עם RNA קלט. </li></ol></li></ol> 2. לינקר קשירת 3 End &quot;של מירנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קשירת &#39;3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הרכיבים על הקרח הבאים, לפי הסדר הרשום: 1.0 מיקרוליטר 50% (w / v) 8000 PEG, 0.5 &amp;956 #; l 10x חיץ האנזים RNA (500 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.5, 100 מ&quot;מ MgCl 2, 10 מ&quot;מ DTT), 1.0 מיקרוליטר adenylated 3 &#39;לינקר (100 מיקרומטר), מעכב RNase 0.5 μl, .5-8.0 מיקרוגרם רנ&quot;א הכל, האנזים 0.5 μl RNA T4 2, H nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 5 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התגובה על ידי pipetting כפתרון הוא צמיג מדי למערבולת בשל הריכוז הגבוה של PEG 8000. מעורבים ברגע יסודיות, למקם את התגובה בCycler תרמית עם מכסה מחומם. הגדר את הבלוק 16 מעלות צלזיוס, ודגירה של 4 שעות. הערה: התגובה יכולה להיות מדורגת עד נפח סופי של 20 μl בלי לפגוע ביעילות קשירה. להגיב ל4 שעות בטמפרטורת הסביבה או הלילה ב 4 ° C כדי להניב את יעילות קשירה זהה במהות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיהור ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קשירה &#39;3, לערבב את התגובה עם נפח שווה של חיץ טעינת 2x RNA. חום עד 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהצמיד מגניב על קרח. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המדגם על 15% ג&#39;ל polyacrylamide לטיהור עמוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;ל polyacrylamide 15% המכיל 7 M אוריאה, באופן דומה לזה שתואר קודם לכן בשלב 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להפעיל את הג&#39;ל על 24 V / סנטימטר של רוחב ג&#39;ל ללפחות 30 דקות. כבה את אספקת חשמל, בארות סומק, מדגם עומס וג&#39;ל לרוץ באותו מתח כמו לפני ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המדגם ולהפעיל את עמוד עד bromophenol הכחול יש רק יצא ג&#39;ל. המוצר הרצוי יעבור קרוב לcyanol קסילן. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים, ויזואליזציה, וכריתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק מנגנון ג&#39;ל וג&#39;ל המקום במגש נקי עם חיץ 1x פועל (TBE), SYBR-זהב 1x, ורוק במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל ממנה מכתימה ולדמיין על תיבת transilluminator UV המכוסה בניילון נצמד נקי. מוצר קשירה צריך להיות סביב 45 נוקלאוטידים באורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו האזור הכולל את מוצר קשירה עם razo נקילהב r ומקום ב0.5 מיליליטר צינור מיקרו צנטריפוגות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מוצר ורטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחתון פירס של 0.5 צינור מיליליטר microcentrifuge עם מחט G 30 ובמקום צינור הפירסינג בנמוך ההחזקה נקייה שנייה,, 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב~ 15,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזותי לאשר שכל פרוסה ג&#39;ל עברה דרך החור בצינור הפנימי. במידת צורך, להשתמש בקצה פיפטה נקי לדחוף כמה שברי ג&#39;ל קרובים יותר לחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את צינור 0.5 מיליליטר הריק ולהוסיף 400 μl של חיץ טור גבוה מלח (HSCB 400 מ&quot;מ NaCl, 25 מ&quot;מ טריס-HCl pH 7.5, 0.1% SDS) לסלארי acrylamide. צינור רוק (ים) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התרחיף לטור ספין אצטט 0.22 מיקרון תאית באמצעות פיפטה קצה רחב נשא. צנטריפוגה במשך 3 דקות בטמפרטורת חדר בXG ~ 15,000 כדי לאסוף את כל הנוזל ממטריצת ג&#39;ל acrylamide. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הנוזל לשפל ההחזקה נקייה,, צינור 1.5 מיליליטר מכילing 1 μl של 20 מ&quot;ג / מיליליטר גליקוגן. הוסף נפח שווה של isopropanol ו1/10 נתרן אצטט נפח ה. מערבבים פתרון על ידי היפוך כמה פעמים צינור ולזרז במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות מלאה על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עד גלולה חומצות הגרעין. הסר supernatant ולשטוף באתנול 70%. גלולה האוויר יבשה במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר ולהמשיך ישירות 5 צעד קשירה &quot;. </li></ol></li></ol> 3. מקשר קשירת 5 &#39;סוף-3 מירנה&#39; היברידי לינקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחומצות גרעין pelleted, להוסיף את המרכיבים הבאים: 2 μl PEG 8000 (50% w / v), 0.5 μl 10x RNA אנזים מאגר, ATP 0.5 μl (10 מ&quot;מ), 0.5 μl NN-RNA אוליגו (100 מיקרומטר), ו- H 2 O לנפח סופי של 4 μl. הערה: ההרכב &quot;אוליגו NN-רנ&quot;א &#39;הוא כדלקמן 5&#39;ההפוך dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3&#39; והיה מטוהר באמצעות HPLC על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבביםמדגם זה על ידי pipetting למעלה ולמטה שוב ושוב. לעשות את זה במשך זמן מה (עד 5 דקות) כדי להבטיח שהגלולה כבר לגמרי מחדש solubilized. אם מחדש solubilization הוא בעייתי, לחמם בקצרה המדגם (3-5 דקות) עד 37 מעלות צלזיוס ולחדש pipetting לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהכדור הוא חזרה בפתרון, להעביר את התוכן לצינור נקי PCR המכיל 1 μl של 1: 1 תערובת של מעכב RNase ו- T4 RNA אנזים 1 (5 יחידות). שוב מערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה בCycler תרמית על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. פנה מייד לסינתזת cDNA. </li></ol> 4. שעתוק לאחור / cDNA סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הרכיבים הבאים ל5 &#39;תגובת קשירת: 2 μl חיץ 5x RT, 0.75 μl 100 מ&quot;מ DTT, μl 1 Illumina RT פריימר 5&#39;-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 &quot;(1 מיקרומטר), ו -0.5 dNTPs μl (10 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים על ידי pipetting וחום עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. לאחר מכן לקרר לאט בt הספסלop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתגובה מתקררת לטמפרטורת חדר, צינור מקום על קרח ולהוסיף 0.5 μl כל אחד מאנזים טרנסקריפטאז ההפוך ומעכב RNase. מערבבים על ידי pipetting והמקום בCycler תרמית לצעד הסיומת מצויינים בהוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתוספת שלמה 5 μl של H nuclease ללא 2 O להביא את הנפח הסופי של ספריית cDNA עד 15 μl. </li></ol> 5. ספריית הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאינדקס PCR, להרכיב את התגובה על קרח הבא: 6 μl 5x Phusion מאגר, dNTPs 1 μl (10 מ&quot;מ), 0.9 μl DMSO, 0.75 μl 5 &#39;פריימר (25 מיקרומטר), 0.75 μl 3&#39; פריימר (25 מיקרומטר), ספריית 3 μl cDNA (ריכוז משתנה בהתאם לכמות של הקלט), 0.5 μl Phusion פולימראז (יחידת 1), H-nuclease ללא 2 O לנפח סופי של 30 μl. בחר רצפי פריימר כדי להבטיח תאימות עם התבנית ואת פלטפורמת הרצף שלבחירה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תגובת PCR עם ההגדרות הבאות: denaturation הראשוני על 98 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, במשך 4 המחזורים הראשונים, לפגל 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, לחשל על 50 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, להאריך ב 72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות . הערה: בהתאם לכמות חומר ההזנה, להשתנות כולל מספרי מחזור PCR. בדרך כלל, לקלט של 1-2 מיקרוגרם של רנ&quot;א הכל, 13 מחזורי PCR כולל מספיקים כדי ליצור את ספריית miR-Seq. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מחזורים שלאחר מכן, לדוגמא, מחזורי 5-12, באופן דו-שלבים שבו מחזורי חישול וסיומת משולבים ויבוצעו על 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות וdenaturation הוא שוב 98 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות. הערה: נפח התגובה היא 30 μl להתיר השהיית תכנית ה- PCR ולהסיר aliquot 10 μl במספרי מחזור שנקבע מראש כדי לפקח על מראה של מוצר רצוי. בדרך כלל, מחזורי 10, 13, ו -16 נבחרו לבדיקה מסך מדגם RNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן8% ג&#39;ל acrylamide שאינו denaturing על ידי ערבוב 2 מיליליטר של acrylamide 40%, 1 מיליליטר של 10x TBE, ו- H 2 O ל 10 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 10% APS 100 μl ו -10 μl של TEMED. יוצקים ג&#39;ל ולתת סט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להפעיל את הג&#39;ל על 12 V / סנטימטר של רוחב ג&#39;ל למשך 30 דקות. בארות סומק. הוסף 1 μl של חיץ טעינת 10x (15% Ficoll-400, 66 mM EDTA, 20 טריס-HCl pH 8.0 מ&quot;מ, 0.1% (w / v) SDS, 0.01% (w / v) bromophenol הכחול), להוסיף 10 μl של מדגם היטב בכל ממדים 5 מ&quot;מ x 1 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ. בדרך כלל, כל אחד גם יכול לטעון עד 30 μl של דגימות. הרץ את הג&#39;ל המדגם ב 10 V / סנטימטר של רוחב ג&#39;ל במאגר 1x TBE עד הצבע הכחול bromophenol רק נגמר תחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ולדמיין ג&#39;ל כמתואר בשלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו להקת זוג 146 הבסיס וelute לילה ב0.25 מיליליטר של HSCB באופן דומה למה שתואר בסעיף 2.4. משקע DNA בנפח שווה של isopropanol ו1/10 נתרן אצטט נפח ה. גלולה לשטוף בדואר 70%thanol וגלול במאגר TE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הספרייה באמצעות PicoGreen פי המלצות יצרן. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-ligase-dependent+biases+in+miRNA+representation+in+deep-sequenced+small+RNA+cDNA+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries.</a> RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).</li>
<li>Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA+cloning+enables+accurate+quantification+of+miRNA+expression+by+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing.</a> Genome Biology. 14 (10), 109(2013).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ENCODE+%28ENCyclopedia+Of+DNA+Elements%29+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project.</a> Science. 306 (5696), 636-640 (2004).</li>
<li>Consortium, T. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Linsen, S. E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+small+RNA+digital+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling.</a> Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).</li>
<li>Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+remediation+of+biases+in+the+activity+of+RNA+ligases+in+small-RNA+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).</li>
<li>McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Acceptor+Oligoribonucleotide+Sequence+on+the+T4+RNA+Ligase+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction.</a> European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).</li>
<li>Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bias+in+T4+RNA+ligase-mediated+3%E2%80%B2-adapter+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).</li>
<li>Harrison, B., Zimmerman, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-stimulated+ligation%3A+enhanced+ligation+of+oligo-+and+polynucleotides+by+T4+RNA+ligase+in+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions.</a> Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).</li>
<li>Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+RNA+ligase+is+a+homodimeric+protein+that+catalyzes+intramolecular+ligation+of+single-stranded+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA.</a> Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).</li>
<li>Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Abundant+Class+of+Tiny+RNAs+with+Probable+Regulatory+Roles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 294 (5543), 858-862 (2001).</li>
<li>Yi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGCR8-dependent+microRNA+biogenesis+is+essential+for+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).</li>
<li>Leung, A. K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+Ago2+binding+sites+from+mouse+embryonic+stem+cells+with+and+without+mature+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

המתודולוגיה שתוארה במסמך זה עושה שימוש במספר משתנה מפתח למקסם את יעילות קשירה, כלומר ריכוז גבוה של PEG, השימוש בlinkers אקראי, וריכוז גבוה של linkers 2,6,9. גישה זו מאפשרת ספריות רצף אמין כמותי מדגימות RNA הכולל 2. ערכנו titrations מרובה של RNA הקלט והגעתי למסקנה כי המתודולוגיה הקודמת היא מתאימה ביותר עבור כמויות RNA הכוללת בטווח 1-8 מיקרוגרם (מידע לא מוצג). כאשר כמויות בטווח 10-500 ng משמשות, רוב שטח הקריאה הוא נצרך על ידי concatamers מתאם ורצפי חיידקים שממנ...

מתודולוגיות מבוססות רצף תפוקה גבוהה כבר מיושמות באופן נרחב הרבה דגימות ביולוגיות בשנים האחרונות מאוד להרחיב את ההבנה של המורכבות המולקולרית של מערכות ביולוגיות 3,4. עם זאת, הכנת דגימות RNA לרצף תפוקה גבוהה לעתים קרובות מקנה הטיות ספציפיות הגלומות למתודולוגיה המועסקות, המגבילות את התועלת הפוטנציאלית של טכניקות רבות עוצמה אלה. הטיות שיטה ספציפית הללו תועדו היטב להכנות ספרייה מבוססת-קשירה, הקטן-RNA 1,2,5,6. הטיות אלה מובילים לוריאצית 1,000 פי בקוראים מספרים לmiRNAs הסינתטי equimolar, מה שהופך את ההיסק של שפע מירנה מנתוני רצף נוטים בפראות משתנה וטעייה. מחקרים המתמקדים במאפיינים של ligases RNA T4-נגזר הפאג תעדו כי האנזימים להציג את העדפות המבוסס על נוקלאוטיד 7, שבאו לידי ספריות מוטות כמו בניסויי רצף תפוקה גבוהה <sעד&gt; 1,2,8. על מנת למזער את ההטיות הנחילה ידי ligases RNA, אסטרטגיות מרובות להיות מועסקת; macromolecular צפיפות 9, באופן אקראי, רצף נוקליאוטידים של מתאם החשמל, הוא הפרוקסימלי לאתר קשירת 6, ומעסיק ריכוזים גבוהים של קשירת מתאם 2. באמצעות שילוב של שלוש הגישות הללו פיתחנו עבודת זרימה להכנה משוחדת של ספריות RNA קטנות תואמות לרצף תפוקה גבוהה (איור 1). להשוואה ישירה בין פרוטוקולים הנוכחיים והשיטה מותאמת שלנו, אנא פנה אל הדו&quot;ח האחרון שלנו 2. שיטה מותאמת זה מניב יעילות קשירה של יותר מ 95% בשני 3 &#39;ו 5&#39; צעדים ומאפשרת קשירה משוחדת של מולקולות RNA קטנות מדגימות סינתטיות וביולוגיות 2.

<table><tbody><tr><td>3 'Linker (5' זרחני, 3' חסום)</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>מותאמות אישית</td><td></td></tr><tr><td>5' Linker</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>מותאמות אישית</td><td>5' חסומות, HPLC מטוהר</td></tr><tr><td>T4RNL2 (1-249 K227Q)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0351S</td><td>מתמחה בקשירת מתאמי DNA טרום-אדניליים</td></tr><tr><td>10x מאגר קשירה (ללא ATP)</td><td>ניו אינגלנד מעבדות ביולוגיות</td><td>כלולות במאגר קשירה M0351S</td><td></td></tr><tr><td>10x (עם ATP)</td><td>מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד</td><td>כלולות ב-M0204L</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול (מול. משקל 8,000)</td><td>מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד</td><td>כלולות ב-M0204L</td><td></td></tr><tr><td>אמביון</td><td>מים ללא נוקלאז</td><td>AM9937</td><td>מצאנו שמים שנאספו ממנגנון זיקוק הם באיכות שווה.</td></tr><tr><td>T4RNL1</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0204L</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III RT ערכת</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ערכת PCR של</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Illumina RP1 פריימר</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td> מידע <td>רצף מותאם אישית</td><td>זמין מ-Illumina</td></tr><tr><td>Illumina RT פריימר</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td> מידע רצף <td>מותאם אישית</td><td>זמין מ-Illumina</td></tr><tr><td>Illumina Index פריימר/ים</td> טכנולוגיות <td>DNA משולבות</td><td>מותאמות אישית</td><td>מידע על רצף זמין מ-Illumina</td></tr><tr><td>40% אקרילאמיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP14081</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>טטרמתיאתילנדיאמין (TEMED)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>2x מאגר טעינת RNA דנטורינג</td> ניו <td>אינגלנד ביולאבס</td><td>כלול עם סכיני גילוח M0351S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>צינורות SpinX Centricon Costar</td><td></td><td>CLS8161</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרופוגה עם שמירה נמוכה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דנילציה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E2610L</td><td></td></tr></tbody></table>

קשירת יעילה ביותר של rna קטן מולקולות לmicrorna quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

שיבוט מירנה ורצף תפוקה גבוהה, המכונים miR-Seq, עומד לבד כגישת transcriptome רחבה לכמת miRNAs עם רזולוציה נוקלאוטיד יחידה. טכניקה זו לוכדת miRNAs על ידי הצמדת מתאמי 3 &#39;ו 5&#39; oligonucleotide למולקולות מירנה ומאפשרת גילוי דה נובו מירנה. צימוד עם פלטפורמות רצף של הדור הבא חזקות, miR-Seq כבר סייע בחקר ביולוגיה מירנה. עם זאת, הטיות משמעותיות שהוצגו על ידי צעדי קשירת oligonucleotide מנעו miR-Seq להיות מועסק ככלי quantitation מדויק. מחקרים קודמים מראים כי הטיות בשיטות miR-Seq הנוכחיים לעתים קרובות להוביל לכימות מדויק מירנה עם שגיאות עד 1,000 פי כמה miRNAs 1,2. כדי לפתור הטיות אלה הנחילה ידי קשירת RNA, שפיתחנו שיטת קשירת RNA קטנה שגורמת ליעילות קשירה של מעל 95% עבור שני 3 &#39;ו 5&#39; צעדי קשירה. בהשוואות im זההוכיח שיטת בניית ספרייה באמצעות miRNAs הסינתטי equimolar או באופן דיפרנציאלי המעורב, באופן עקבי תשואות קוראים מספרים עם סטייה של פחות מכפולה מהערך הצפוי. יתר על כן, שיטת miR-Seq יעילות גבוהה זו מאפשרת יצירת פרופילי מירנה מדויקת הגנום מדגימות רנ&quot;א הכל in vivo 2.

התוצאות הצפויות לשיטה הקודמת צריכים להיות בתחילת תצפית של משמרת אחת נוקלאוטיד (גידול) בגודל של oligonucleotide DNA שהיה כפוף לadenylation על ידי האנזים MTH RNA (איור 2). בעקבות קשירה '3, להדמיה של ג'ל acrylamide מציינת (ראה איור 3) להקות חדות משקל מולקולרי גבוהות באו לידי ביטוי באזור נוקלאוטיד 100-300 של הג'ל. זה מצביע על כך מדגם RNA הכולל בשימוש הוא באיכות גבוהה (לא מושפל). שנית יש לבחון אות בהירה מאוד באזור 25 נוקליאוטידים של ג'ל, שהוא ...

MicroRNAs (miRNAs) הם סוג של מולקולות רגולטוריות שנשמרו באופן נרחב. כאן אנו מתארים שיטת שיבוט miRNA המסתמכת על שני שלבי קשירה חזקים ואחריהם ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה שלנו מאפשרת כימות מדויק בכל הגנום של miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין ללא משוא פנים מיקרו-רנ"א לריצוף תפוקה גבוהה. זה מושג על ידי הכנה או רכישה של אוליגונוקלאוטידים של DNA הכשירים לקשירה לשלושת הקצוות העיקריים של המיקרו RNA. השלב השני הוא לקשור את שלושת האוליגונוקלאוטידים הראשוניים של ה-DNA לשלושת הקצה הראשוני של המיקרו-RNA.לאחר מכן, תוצר הקשירה מטוהר בג'ל ומקשר חמשת האוליגונוקלאוטידים העיקריים של ה-RNA נקשר לקצה החמישי של המיקרו-RNA. השלב האחרון הוא להמיר את המולקולות ההיברידיות ל-CDNA ולאחר מכן להגביר את ה-CDNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז. בסופו של דבר, שיבוט מיקרו RNA וריצוף תפוקה גבוהה משמשים להצגת הפרופיל הרחב של הטרנסקריפטום של מיקרו-RNA בצורה כמותית ברזולוציית נוקלאוטידים בודדים.היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו על פני טכניקות קיימות כגון כתם qPCR מיקרו-רצף מיקרו-קרניים, הוא שהטכניקה שלנו משקפת יותר את רמת המיקרו-קרני בפועל בקנה מידה מעבדתי רחב ברזולוציית נוקלאוטיד יחידה. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ביולוגיה של מיקרו-RNA, ניתן ליישם אותה גם על טכנולוגיות ריצוף אחרות בתפוקה גבוהה כמו HC clip ו-RNA-Seq. אוליגונוקלאוטידים של ה-DNA להליך זה מיועדים לשלוש תגובות קשירה ראשוניות וצריכים להיות בעלי קבוצת פוספט ראשונית של חמישה ראשוניים, דינוקלאוטיד אקראי בקצה חמשת הראשוניים וציטוזין תלת-ראשוני לדלל את אוליגונוקלאו

highly-efficient-ligation-small-rna-molecules-for-microrna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים זמנית אופטימיזציה הפוך transcriptase PCR כמותי (qRT-PCR) פרוטוקול בשילוב עם פלטפורמת microfluidic ככלי העלות והזמן תפוקה גבוהה יעיל ההקרנה microRNA (מירנה) רמות הביטוי, במיוחד כאשר עובדים עם כמויות מוגבלות של המדגם.

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

אנו מתארים פרוטוקול של PCR בזמן אמת לפרופיל מיקרו RNA בנוזל המוח והשדרה (CSF). למעט פרוטוקולי מיצוי RNA, ההליך יכול להתארך עד RNA המופק מנוזלים אחרים בגוף, תאים בתרבית, או דגימות רקמה.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

מיקרו-רנ"א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ"א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש במיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר כשיטה יעילה לבידוד אוכלוסיות טהורות של סוגי תאים מרקמות ערמונית הטרוגניות לצורך ניתוח RNA במורד הזרם.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה צעד אחר צעד עבור בידוד RNAs קטנים, העשרת עבור microRNAs, והכנת דגימות עבור רצף תפוקה גבוהה. לאחר מכן נתאר כיצד לעבד רצף וליישר אותם ל-microRNAs, באמצעות כלי קוד פתוח.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

שיטה זו ממחישה את השימוש בטכניקת הכלאה הצפוני כדי לזהות miRNAs מתוך תמצית RNA מוחלטת.

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

ריצוף RNA לכימות מוחלט (AQRNA-seq) היא טכנולוגיה שפותחה כדי לכמת את הנוף של כל הרנ"א הקטן בתערובות ביולוגיות. כאן, הן שלבי הכנת הספרייה והן שלבי עיבוד הנתונים של AQRNA-seq מודגמים, המכמתים שינויים במאגר RNA העברה (tRNA) ב- Mycobacterium bovis BCG במהלך תרדמה הנגרמת מרעב.

AQRNA-seq לכימות רנ"א קטן

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

שיטה זו מתארת סינתזה in vitro בתפוקה גבוהה של mRNA עם כיסוי (capped) וללא כיסוי (uncapped), מפלסמיד ליניארי המכיל את הגן של לוסיפראז Gaussia (GLuc). ה-RNA מטוהר, וחלק מה-RNA ללא הכיסוי עובר תהליך כיסוי אנזימטי באמצעות אנזים הכיסוי של נגיף ה-Vaccinia. בשלב הסופי, ה-mRNA מוחדר (transfection) לתאי HeLa, ותעליל התרבית של התאים נבדק לפעילות לוסיפראז.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

למד שיטה לקשירת microRNA בשתי שלבי ליגציה וריצוף תפוקה גבוהה. השיטה מאפשרת כימות גנומי מדויק של miRNA ברזולוציית נוקלאוטיד בודד לחקר תפקידי רגולציה.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

גלה סרטונים נוספים