זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות מווסתים מרכזיים פוטנציאליים לחידוש עצמי והתמיינות של תאי EML בעכבר באמצעות טכנולוגיית ריצוף RNA. זה מושג על ידי הפרדה ראשונה בין תאי EML שליליים CD 34 שליליים לשושלת CD 34 על סמך סמני פני השטח. השלב השני הוא לבודד mRNA, להמיר את ה-mRNA ל-cDNA ולהכין את הספרייה לריצוף.

לאחר מכן, ספריית ה-DNA נתונה לריצוף תפוקה גבוהה. השלב האחרון הוא לנתח את תוצאות הריצוף ולחפש גורמי שעתוק המתבטאים באופן דיפרנציאלי. בסופו של דבר, טכנולוגיית ריצוף RNA משמשת להצגת גורמי שעתוק המתבטאים באופן דיפרנציאלי בתאי EML שליליים CD 34 שליליים לשושלת ותאי EML שליליים CD 34 שליליים.

היתרון העיקרי של ריצוף RNA על פני שיטות אחרות של ביטוי G פרולן כגון מיקרו-ריי, הוא שיש לו רגישות גבוהה יותר, דיוק וטווח דינמי רחב יותר, והוא אינו מסתמך על מידע הערות גנים קיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח בתחום תאי הגזע, כגון מהם גורמי התעתיק העיקריים המווסתים את ההתחדשות העצמית של התאים והתמיינותם. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על המקום שבו הטיפול במחלות דם מכיוון שהבנה טובה יותר של הרגולטור העיקרי השולט בתאי המבשר ההמטופויאטיים, חידוש עצמי והתמיינות יכולים להוביל לפיתוח טיפולים יעילים.

בדרך כלל, אדם חדש בשיטה זו יתקשה מכיוון שנדרשים כלים ביופורמטיים שונים לניתוח הריצוף. כליית האוגר התינוק או תאי BHK לאיסוף גורמי תאי גזע מתורבתים במדיום dmem המכיל 10% FBS ב-25 סמ"ר, בקבוק ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. כאשר התאים הגיעו ל-80 עד 90% מפגש עיני טריפסין ואוספים אותם על ידי צנטריפוגה ב-200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את ה-snat והשעו מחדש את פלטת התאים ב-10 מיליליטר של מדיום תרבית תאי BHK טרי.

העבירו שני מיליליטר של מתלה התא לבקבוק חדש של 75 סנטימטר רבוע והוסיפו 48 מיליליטר של תרבית תאי BHK טרייה. בינוני לתרבות הבקבוקים. תאים של BHK במשך יומיים.

לאחר יומיים, אספו את מדיום התרבות והעבירו אותו דרך פילטר נקודתי של 45 מיקרומטר. אחסן את המדיום בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. תאי האריתרואיד, המיאלואיד והלימפוציטים או EML של העכבר המשמשים בפרוטוקול זה מתורבתים בתרחיף במדיום בסיסי EML המכיל מדיום תרבית תאי BHK ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.

שמור על תאי EML בצפיפות תאים נמוכה עם צפיפות שיא של פחות מ-600,000 תאים למיליליטר. פצל את התאים כל יומיים-שלושה ביחס של אחד עד חמישה מעבר לתאים בעדינות, אך לא יותר מ-10 דורות כדי לרוקן תאים חיוביים לשושלת. קצרו את תאי ה- EML על ידי צנטריפוגה ב -200 גרם למשך חמש דקות.

שטפו את התאים פעם אחת עם PBS וצנטריפוגה שוב לאחר השלכת הסופרנטנט. השעו מחדש את התאים ב-PBS וספרו את התאים בעזרת ציטומטר המו. מספר התאים נחוץ לקביעת ריכוז הנוגדנים בשלב הבא.

בודד את התאים השליליים או השליליים באמצעות קוקטייל נוגדנים לשושלת ומערכת מיון תאים מופעלים מגנטית בהתאם להוראות היצרן. כדי להתחיל בהליך זה, סובב את התאים השליליים ב-200 G למשך חמש דקות. השעו מחדש את כדור התא עם PBS וספרו את התאים בעזרת ציטומטר המו.

שטפו את התאים פעמיים עם מאגר פקס. לאחר הכביסה השנייה, גלו את התאים ב -200 גרם למשך חמש דקות. סמן את חמשת צינורות המיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר עם המספרים 1, 2, 3, 4 וחמש בהתאמה.

השעו מחדש את התאים עם נפח מתאים של עובדות חוצץ לריכוז של מיליון תאים לכל 100 מיקרוליטר. לאחר מכן יש להקצות 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל אחד מחמשת צינורות המיקרו צנטריפוגה. הוסף מיקרוגרם אחד של נוגדן CD 34 FE נגד עכבר לצינור 1 ולצינור 2.

מערבבים את הצינורות, דוגרים בעדינות את כל הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה בחושך. לאחר מכן, הוסף נקודה 25 מיקרוגרם של אנטיקה מצומדת PE, נוגדן אחד ו-20 מיקרוליטר של שושלת מצומדת PC. נוגדנים קוקטייל לשניים אחד, הוסף נקודה 25 מיקרוגרם של אנטיקה מצומד PE נוגדן אחד לצינור שלוש ו -20 מיקרוליטר של שושלת מצומדת PC.

קוקטייל נוגדנים לצינור ארבע. מערבבים את הצינורות בעדינות ודוגרים על התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות בחושך. לאחר 30 דקות, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר פקס לכל הצינורות וסובב את התאים ב-200 Gs למשך חמש דקות.

שטפו את התאים שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר מאגר פקס לאחר הכביסה הסופית. Resus השעו כל כדור תא ב-500 מיקרוליטר של מאגר פקס מבודד לין שלילי SCA חיובי CD 34 חיובי ו-SCA שלילי CD 34 תאים שליליים בצינור 1 על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי. סה"כ RNA מופק מתאי CD 34 שליליים לין שליליים CD 34 ושלילי CD 34 באמצעות טריול ו-DNA מזוהם מוסר באמצעות דאוקסיריבו נוקלאז אחד.

בהתאם לפרוטוקול היצרן, העריכו את איכות ה-RNA הכולל באמצעות ביו-אנלייזר בהתאם להוראות היצרן רק דגימות RNA עם מספר תקינות RNA או RIN של יותר מתשע משמשות למיצוי mRNA ולהליכי בניית ספרייה לאחר מכן. תרשים זה מציג את התוצאה של דגימת RNA באיכות גבוהה עם RIN השווה ל-9.4. פרוטוקול בניית הספרייה המשמש כאן הוא ספציפי לפלטפורמת ריצוף ה-RNA של Illumina ומשתמש בערכת הכנת דגימת RNA.

עקוב אחר ההוראות שסופקו על ידי היצרן מכיוון שרק השלבים שנבחרו מוצגים בסרטון זה. התחל בבחירה חיובית של poly MNA באמצעות חרוזים מגנטיים של oligo DT. לאחר מכן, פיצול ה-poly mRNA בצע שעתוק הפוך באמצעות פריימרים אקראיים כדי להמיר את ה-mRNA ל-CD NA. לאחר מכן, הגדיל השני המסונתז CD NA משמש ליצירת DNA דו-גדילי.

לאחר מכן, שלושת התלויים העיקריים מוסרים וחמשת התלויים הראשוניים ממולאים על ידי DNA פולימראז דנט. שלושת הקצוות העיקריים של שברי CD NA מקשירה זה לזה. הוסף מתאמי אינדקס מרובים לשני הקצוות של CD NA הדו-גדילי לצורך רצף.

לבסוף, בצע PCR להעשרת ה-CD NA עבור מקטעים באמצעות ספקטרופוטומטר למדוד את הספיגה שתיים 60 על פני ספיגה שתיים 80 של ה-DNA המוגבר. כדי לקבל מידע על ריכוז הספרייה, יש להעריך את איכות הספרייה ולמדוד את טווח הגדלים של מקטעי ה-DNA באמצעות ביו-אנלייזר. השיטות לניתוח נתוני ריצוף RNA נמצאות בטקסט הפרוטוקול הנלווה וכוללות עיבוד קבצי נתונים לניתוח במורד הזרם, איתור תעתיקים חדשים והערכת רמת הביטוי, זיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי וזיהוי גורמי שעתוק המתבטאים באופן דיפרנציאלי.

תאי EML שליליים לשושלת נצבעו בנוגדנים נגד CD 34 antica one וקוקטייל שושלת ו-lin שלילי לגולגולת חיובי CD 34 חיובי ו-lin sca שלילי. תאים שליליים CD 34 הופרדו באמצעות מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים בלבד. תאים שליליים של לין היו מגודרים לניתוח ביטוי SCA one ו-CD 34.

שתי אוכלוסיות של תאי EML נצפו כאשר בניית הספרייה הסתיימה. גודל שברי הדנ"א בספרייה נבדק באמצעות ביואנלייזר. נתונים מייצגים אלה מראים ספרייה באיכות טובה, אך גודל השבר מגיע לשיא של כ-300 זוגות בסיסים.

האלגוריתם D-E-S-E-Q שימש לניתוח ביטוי דיפרנציאלי תוך התמקדות בגורמי שעתוק המתבטאים באופן דיפרנציאלי מכיוון שגורמי שעתוק חיוניים לקביעת סולפט. גורמי שעתוק המשתנים ביותר מפי 1.5 בין CD 34 שלילי לין CD 34 חיובי ל-CD שלילי 34 נמצאו ומוצגים במפת חום זו. יש לציין כי רמת הביטוי היחסית של TCF 7 בתאים חיוביים CD 34 שליליים גבוהה פי 100 מזו של תאים שליליים CD 34 שליליים.

לפיכך, TCF 7 נבחר לניתוח נוסף של כרומטין וניתוח ריצוף ובדיקות פונקציונליות כדי לאשר את תפקידו בוויסות חידוש עצמי והתמיינות בתאי EML. לאחר השליטה, ניתן לסיים את ספריית ה-RNA תוך מספר ימים וניתן להשלים את ההליך כולו תוך כחודש אם הוא מבוצע כראוי לאחר פיתוחו. טכנולוגיה זו סללה את הדרך לחוקרים המוכנים לחקור באופן דיפרנציאלי ביטוי גנים בין סוגי תאים ורקמות מגוונים כגון תאי B ותאי B ממאירים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש ב-CAR TRNA גבוה מכיוון שזה הבסיס לכל הליך חולה RNA. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין טוב יותר כיצד לזהות מווסתים מרכזיים השולטים בחידוש והתמיינות תאי EML.