טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש Vulgaris Phaseolus כדוגמה

מטרת הליך זה היא להדגים את מיצוי הנוזל האפלסטי מעלי הצמח בטכניקת צנטריפוגת הסתננות. זה מושג על ידי טבילה ראשונה של עלה בנוזל הסתננות, ושימוש בהפרשי לחץ שנוצרים באמצעות מזרק או משאבת ואקום כדי לחדור אליו במלואו. השלב השני הוא הכנת העלה לצנטריפוגה באמצעות מכשיר תומך.

לאחר מכן, העלה עובר צנטריפוגה בעדינות כדי להשיג את נוזל הכביסה של APO plast. השלב האחרון הוא קביעת גורם דילול הפלסט APO ובדיקת איכות נוזל הכביסה האחרון. בסופו של דבר, בדיקת צנטריפוגת ההסתננות משמשת להשגת דגימות פלסט APO מייצגות שניתן להשתמש בהן למגוון ניתוחים במורד הזרם.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות אחרות הוא שפשוט לבצע אופטימיזציה למגוון סוגי עלים על מנת להשיג דגימות עליונות פלוס שיש להן זיהום מינימלי בתרכובות ציטופלזמיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים כמו פיזיולוגיה של הצמח ואינטראקציות של חיידקי צמחים, שבהם חשוב להבין כיצד הרכב ה-APLs משתנה בין צמחים ומשתנה בתנאים פיזיולוגיים או עקות שונות. כצעד ראשון, נקוט באמצעי זהירות על ידי לבישת כללי מעיל מעבדה, כפפה ומשקפי מגן.

לאחר מכן, הכינו נפח מים מזוקקים בו ניתן לטבול את דגימת העלים. הכינו סכין גילוח לאיסוף דגימה במקרה זה, עלה מזן השעועית ירוק רך. הנח את סכין הגילוח על חיית המחמד של עלה והצמד את העלה מהצמח.

לאחר האיסוף, טבלו את העלה הטרי שנכרת במים מזוקקים כדי להסיר מזהמים על פני העלה. לאחר מכן השתמש בטישו סופג או בנייר כדי לחסום בעדינות את ייבוש העלה. מדוד את משקל העלה לפני שתמשיך בהסתננות.

זה יעזור בהמשך בקירוב נפח ההסתננות. התחל את תהליך ההסתננות עם מזרק של 60 מיליליטר. כשהבוכנה שלו מוסרת, מגלגלים בזהירות או מקפלים את העלה למזרק.

לאחר מכן, מלאו את המזרק בנוזל הסתננות. כאן משתמשים במים מזוקקים. הכנס את הבוכנה והפוך את המזרק כדי להוציא אוויר בתוכו.

שימו לב לצבע העלה להשוואה מאוחרת יותר. העבר את הבוכנה לסימון 40 מיליליטר באמצעות חתיכה קטנה של פרמטר. מכסים את קצה המזרק.

לאחר מכן משוך את הבוכנה לסימון 60 מיליליטר כדי ליצור לחץ שלילי. הפוך את המזרק כדי לשחרר בועות אוויר מפני השטח של העלה. החזר לאט את הבוכנה למצב ההתחלה למשך כשתי שניות.

יש לחשוף את קצה המזרק ולהוציא אוויר. לאחר מכן כסו שוב את הקצה ולחצו על הבוכנה כדי ליצור כמות צנועה של לחץ חיובי. המשיכו להפעיל לחץ שלילי, להוציא אוויר ולהפעיל לחץ חיובי עד לחדירה מלאה של העלה.

עדות לחדירה מלאה היא הצבע הכהה של האזורים שחדרו. ברגע שזה נראה, הסר את העלה מהמזרק. חסום בעדינות את העלה עם נייר סופג כדי להסיר נוזל פני השטח.

לאחר מכן מדוד את משקל העלה שהסתנן, ושיטת הסתננות חלופית משתמשת בבקבוק ואקום. שוב, אוספים עלה ושוטפים אותו במים מזוקקים. לאחר ייבוש יש למדוד את משקל העלה.

השג בקבוק זרוע צד בנפח מינימלי של 250 מיליליטר. מניחים את העלה בבקבוק ומכסים אותו במים מזוקקים. לאחר מכן, הניחו פקק בבקבוק והצמידו משאבת ואקום לזרוע הצד.

מרחו ואקום על הבקבוק מספיק זמן כדי להשיג לחץ. כ -650 מילימטרים כספית. מערבבים בעדינות את הבקבוק כדי לשחרר בועות אוויר מהעלה בלחץ מופחת.

לאחר מכן שחרר בזהירות ובאטיות את הוואקום במהלך כ-10 שניות. חזור על תהליך הפעלת ואקום, ערבוב הבקבוק ושחרור הוואקום עד לחדירה מלאה של העלה. עדות לחדירה מלאה היא הצבע הכהה של האזורים שחדרו.

מוציאים את העלה שהסתנן במלואו מהבקבוק ומכתים בעדינות את העלה בנייר סופג. כדי להסיר נוזל פני השטח, מדוד את משקל העלה שהסתנן כדי לאפשר קביעת נפח החדירה המשוער. לאחר שעלה חדר במלואו, הכינו אותו לצנטריפוגה.

הניחו חתיכה של סרט פרה ברוחב ארבעה אינץ'. הניחו את העלה על סרט הפרה. לאחר מכן בעזרת קצה פיפטה של חמישה מיליליטר, מגלגלים את העלה בסרט הפרה.

קח גוף מזרק של 20 מיליליטר כשהבוכנה הוסרה והכנס את העלה המגולגל עם קצה הפיפטה. מקם את כל קצוות העלים החתוכים ופונים לקצה הבוכנה. השג צינור פוליאתילן או פוליקרבונט בנפח 50 מיליליטר והכנס לתוכו את המזרק.

השתמש בצנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד. טען את הצינור המכיל את העלה והצנטריפוגה שחדרו בארבע מעלות צלזיוס ו -1000 גרם למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, בדוק את העלה כדי לקבוע אם רוב נוזל ההסתננות נפלט.

צינור הצנטריפוגה מכיל כעת נוזל כביסה APO plast משוחזר המשך על ידי פיפטינג נוזל הכביסה המוחזר לצינורות טריים של 1.5 מיליליטר. הנח את דגימות נוזל הכביסה של APO plast לתוך הצנטריפוגה וסובב ב-15,000 גרם למשך חמש דקות כדי להסיר תאים או חלקיקים. לאחר הצנטריפוגה, פיפטה את הספינאט לצינורות טריים.

שמור את הדגימות על קרח עד שניתן יהיה לאחסן אותן במינוס 80 מעלות צלזיוס. שיטה אחת להעריך את איכות נוזל הכביסה של APO plat היא לחשב את גורם הדילול של APO plat. לשם כך, הכינו שני נפחים של נוזל ההסתננות מים מזוקקים במקרה זה, כל אחד מהם מספיק למספר חדירות לנפח אחד.

הוסף אבקת אינדיגו קרמין לריכוז סופי של 50 מיקרומולר. לא להוסיף דבר לשני. השג מיקרופלייט 96 באר מלא שלוש בארות עם 200 מיקרוליטר מתמיסת ההסתננות.

עם אינדיגו קרמין, מלאו שלושה נוספים ב-200 מיקרוליטר של תמיסת ההסתננות הטהורה בבסיס המיקרו-צלחת בקורא כדי למדוד את הספיגה של כל נוזל. ב-610 ננומטר, הספיגה הממוצעת של נוזל עם אינדיגו קרמין פחות הספיגה הממוצעת לנוזל ללא נותנת את הספיגה המתוקנת של ההסתננות. לאחר מכן, שכפל את פרוטוקול חדירת העלים שלוש פעמים עבור כל אחד מפתרונות ההסתננות.

טבלו דגימת עלים במים. הפעל לחץ שלילי וחיובי בעת שימוש בתמיסת ההסתננות של אינדיגו קרמין, שטוף את העלים במים מזוקקים לאחר ההסתננות כדי להסיר את כל שאריות האינדיגו קרמין מפני העלה. שחזר את נוזל הכביסה האחרון באמצעות צנטריפוגה.

לאחר שחזור נוזל הכביסה האחרון, חזור לקורא הצלחות בבארות של המיקרופלייט. הניח 200 מיקרוליטר מכל אחת מהתמציות ללא אינדיגו קרמין, וגם 200 מיקרוליטר מכל מיצוי נוזל כביסה של אינדיגו קרמין. מדוד את ספיגת הדגימות ב-610 ננומטר כדי לקבל את הספיגה המתוקנת.

ממוצע של כל קבוצת מספרים וקח את ההפרש. השתמש בספיגה המתוקנת של ההסתננות ובספיגה המתוקנת של נוזל הכביסה האפלסטי כדי לקבוע את גורם הדילול APL כדי לקבל הערכות של ריכוזים או פעילויות בנוזל אפלסטי. השתל מכפיל את ערכי הריכוז או הפעילות מנוזל הכביסה האחרון בגורם הדילול המופק מנוזל הכביסה האחרון מזן fasi vulgaris.

ירוק רך שימש לייצור חומצות אורגניות בספקטרום מסה של כרומטוגרפיית גז. סוכרים וחומצות אמינו פשוטים מייצגים את עיקר המטבוליטים הניתנים לזיהוי. הנה השוואה של דף SDS, ג'ל צביעה של קומאסי של תמציות עלים של נוזל כביסה fasi vulgarus.

המיצויים נבדלים זה מזה בכמות הזיהום הציטופלזמי. זה נצפה בכמויות שונות של אנזים הגבס rubis. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להיות עדין ככל האפשר לכל הפחות כדי להימנע מגרימת נזק לרקמות או זיהום ציטופלזמי לאחר הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספקטרומטריית מסה של חלבון או מטבוליט על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות להרכב הנוזל האפלסטי. נוזל כביסה אפלסטי יכול לשמש גם כמדיום גס לחקר ההשפעה של כימיקלים אפלסטיים על המיקרואורגניזמים המאכלסים רקמות צמחים.