טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases In vivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות נקודות התחלה של שעתוק ואתרי מחשוף RNA in vivo מחיידקים באמצעות תגובת הארכת פריימר פלואורסצנטי. זה מושג על ידי גידול חיידקים כמו אי קולי או S aria, ובידוד מולקולות ה-RNA. לאחר מכן, ה-RNA מתומלל לאחור באמצעות פריימרים פלואורסצנטיים ספציפיים וטרנסקריפטאז הפוך וכתוצאה מכך מקטעי CD NA.

לאחר מכן מבודדים DNA או פלסמידים מתאי החיידקים, וסולם ריצוף סנגר פלואורסצנטי נוצר מתבנית ה-DNA באמצעות ערכת ריצוף. לבסוף, שברי ה-CDNA וסולמות הריצוף מופרדים ומתגלים בו זמנית על ג'ל פולי אקרילאמיד באמצעות רצף ג'ל אוטומטי ומושווים זה לזה. בסופו של דבר, הרחבת פריימר פלואורסצנטי משמשת למיפוי חמשת הקצוות הראשוניים של מולקולות RNA עד לרזולוציית בסיס אחת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות כגון גזע או הרחבה ראשונית מבוססת רדיואקטיביות הוא זיהוי מהיר של חמש מקצוות מולקולות RNA כאשר הזיהוי מתרחש בו זמנית במהלך אלקטרופורזה. הרגישות דומה להרחבות ראשוניות מבוססות פעילות אדומה, אך מאפשרת לאנשי המעבדה להשתמש בשיטה זו ללא צורך בהדרכת בטיחות קרינת קצב. השתמשנו בהצלחה בטכניקת הרחבה ראשונית פלואורסצנטית זו כדי לחקור את מרכיבי ה-RNA של מערכות אנטי-רעלנים

סטפילוקוקים שידגים את ההליך יהיה כריסטופר שוסטר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר הכנת תפוקה גבוהה של RNA ותכנון פריימרים על פי פרוטוקול הטקסט, בצע את תגובת הארכת הפריימר על ידי חימום מוקדם של התרמו-ציקלר ל-95 מעלות צלזיוס. עבור כל דגימת RNA מערבבים את התרכובות הבאות בצינור PCR, מנטרלים את הדגימות למשך דקה אחת ב-95 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הניחו את הצינורות על קרח למשך חמש דקות כדי להכליא את הפריימרים ואת ה-RNA. לאחר מכן, הגדר את מכונת ה-PCR ל-47 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכינו את תערובת מאסטר התמלול ההפוך כמתואר כאן.

הוסף ארבעה מיקרוליטר, תערובת מאסטר שעתוק הפוך לכל דגימת RNA היברידית ודגר את הצינורות למשך שעה ב-47 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את התגובה, מחממים את הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן הוסיפו שישה מיקרוליטרים של צבע לטעינת אמיד ואחסנו למשך הלילה או עד שבועיים בחושך במינוס 20 מעלות צלזיוס.

לאחר הכנת ה-DNA הגנומי או הפלסמידים, על פי פרוטוקול הטקסט, הרכיבו את תגובת הריצוף של סנגר על ידי ערבוב של 12 מיקרוליטר של כ-10 עד 15 מיקרוגרם של DNA גנומי או 100 עד 500 ננוגרם של DNA פלסמיד עם מיקרוליטר אחד של פריימר עם תווית פלואורסצנטית ומיקרוליטר אחד של פיפטה DMSO. מיקרוליטר אחד מכל תערובת ריצוף לצינורות PCR נפרדים המסומנים מראש. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטר מתערובת הפריימר D-N-A-D-M-S-O לכל צינור.

הגדר את מכונת ה-PCR לתוכנית הבאה והפעל אותה לאחר הנחת הדגימות במכונה. לאחר הריצה, הוסף שישה מיקרוליטרים של צבע טעינה לדגימות ולאחר מכן על קרח. אם משתמשים מיד או במינוס 20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך באמצעות לוחות נקיים ונטולי אבק של 25 סנטימטרים, הנח מרווחים של 0.25 מילימטר על לוחית הזכוכית האחורית והורד את לוחית הזכוכית המחורצת בחלק העליון כשהקצה המחורץ של לוחות הזכוכית ונווטי הכניסה למסילה פונים שניהם כלפי מעלה.

חבר את מסילות הג'ל לשני צידי לוחות הזכוכית והדק קלות את הכפתורים כדי להטיל את הג'ל. שלב את התרכובות המפורטות כאן בכוס עם מוט ערבוב והניח על צלחת ערבוב מגנטית. מיד לאחר הוספת PS וצוות, השתמש במזרק של 50 מיליליטר כדי לקחת את תמיסת האקרילאמיד ולהניח פילטר של 0.45 ננומטר על הקצה.

הניחו את הצלחות הסנדוויץ' בזווית של 10 עד 20 מעלות והוציאו לאט את תמיסת הג'ל בין לוחות הזכוכית תוך הזזה רציפה של קצה המזרק מצד אחד למשנהו. הפסק לחלק את תמיסת הג'ל ברגע שהיא פוגשת את הקצה התחתון של לוחות הזכוכית. בעזרת וו בועות, הסר את כל הבועות שאולי נוצרו.

לאחר מכן החלק את מרווח כיס הג'ל בין לוחות הזכוכית בקצה המחורץ, טבל אותו בתמיסת הג'ל, וקבע אותו על ידי הצמדת לוחית היציקה, הדק קלות את ברגי המסילה העליונה ואפשר לג'ל להתייצב למשך שעה עד שעתיים. לפני הסרת צלחת היציקה ומרווח הכיס, השתמש במים מזוקקים נטולי יונים כדי לנקות את הכיס משאריות מלח וג'ל כדי להפעיל את הג'ל. החלק את מחזיק מיכל החיץ לתוך מסילות הג'ל בלוחות הזכוכית הקדמיים והדק את הכפתורים.

הנח את הג'ל למיכל הג'ל התחתון של הדמיית הג'ל האוטומטית כנגד לוחית החימום וקבע על ידי החלקת נווט כניסת המסילה לתוך תושבות המכשיר. השתמש במאגר XTBE אחד כדי למלא את תאי חיץ הג'ל העליונים והתחתונים. לאחר מכן סגור את תא החיץ התחתון והשתמש בכבל החשמל כדי לחבר את תא החיץ העליון לחשמל.

אם יש מלח בכיס הג'ל, השתמש במאגר כדי להכניס שוב ושוב פיפטה לכיס כדי לנקות אותו. לאחר מכן השתמש במכסה המאגר העליון כדי לסגור את תא מיכל החיץ העליון. לאחר הפעלת המצלמת והמחשב והפעלת תוכנת איסוף נתוני ה-IR של תמונת הבסיס בהתאם לפרוטוקול הטקסט, השתמש בהגדרות המפורטות כאן כדי להגדיר את פקד הסורק.

לאחר מכן, הפעל מראש את הג'ל הריק למשך 20 דקות על ידי בחירת מתח מופעל ולחיצה על Enter. בינתיים, באמצעות מכונת PCR, מחממים את סולם הרצף ואת מוצרי הארכת הפריימר ל-90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות לפני הקירור על קרח, עצור את האלקטרופורזה, פתח את רצף הג'ל האוטומטי והסר את מכסה מיכל החיץ העליון. לאחר מכן הכנס את מסרק שיני הכריש בין לוחות הזכוכית ועם שיני הכריש.

חודרים מעט את פיפטת הג'ל 1-2 מיקרוליטר ממוצרי הארכת הפריימר או רצף תגובות סולם לכל כיס ג'ל. לכל כיס ריק. השתמש בצבע טעינה כדי למלא אותם כדי למנוע התנהגות ריצה לא עקבית, סגור את מיכל החיץ ואת הדלת של רצף הג'ל.

לאחר מכן התחל את האלקטרופורזה על ידי בחירת מתח מופעל עבור הלייזר, בחר את מצב הסריקה מופעל ולחץ על Enter. לאחר שאזור העניין עבר את הלייזר, עצור את האלקטרופורזה כפי שמוצג כאן. ניתן להשתמש בתגובת הרחבת פריימר כדי לקבוע את נקודות ההתחלה של השעתוק או TSP של תמלילים מעניינים ויכולה לעזור להסיק אזורי מקדם.

בדוגמה זו, ה-TSP של MPE mRNA זוהה כ-G בהתאם לנתונים שפורסמו קודם לכן. מרכיבי המקדם מינוס 35 ומינוס 10 הוסקו כ-T-T-G-T-A-A ו-T-A-G-A-C-T, ומוטיבים אלה נבדלים רק לבסיסים מכל אחד מרצפי הקונצנזוס שלהם המשתמשים בהרחבת פריימר לזיהוי תוצרי מחשוף mRNA. מיפוי ה-RNA של מחשוף קרוב ל-START על ידי ה-RNA Ybi SEC 2 מוצג כאן כאשר ה-RNAs אינם קיימים או לא פעילים, לא נוצרים תוצרי הרחבה של פריימר קרוב ל-START כתוצאה מפעילות RNAs.

עם זאת, שתי רצועות חזקות מופיעות ממש במורד הזרם של שכבת ההתחלה באיור זה מראה ניסוי הארכת פריימר כושל עקב עודף RNA בתגובת השעתוק ההפוכה המונעת זיהוי של רצועות בודדות. זה מדגים כי יש להתאים את הכמות הכוללת של RNA תבנית לשפע ה-RNA המעניין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבהיר נקודות התחלה של שעתוק ואתרי מחשוף RNA in vivo באמצעות פריימרים פלואורסצנטיים ורצף ג'ל אוטומטי עם קצת תרגול.

שיטה זו מהירה וקלה לביצוע. בהצלחה בניסויים שלך.