Name: טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: למד טכניקת הארכת פריימר מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי נקודות התחלת תעתיק ואתרי חיתוך של RNA בחיידקים. השיטה משתמשת ברצף ג'ל אוטומטי לזיהוי בו-זמני של תוצרי cDNA וסולמות ריצוף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאן ווצ'ל על עזרתה במעבדה ולורה אוגסבורגר על עזרתה ברצף הג'ל האוטומטי. אנו מודים ל-Deutsche Forschungsgemeinschaft על המימון באמצעות מענקים BE4038/2 ו-BE4038/5 במסגרת "תוכניות העדיפות" SPP1316 ו-SPP1617.

<ol><li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+extension+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li>
<li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension%3A+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li>
<li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li>
<li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li>
<li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li>
<li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li>
<li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+interferases%2C+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+molecular+biology+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li>
<li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+MazF-bs+%28EndoA%29+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence%2C+UACAU%2C+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA+interferases%2C+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li>
<li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+MazFSa%2C+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li>
<li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li>
<li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ompA+5%27+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li>
<li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li>
<li>Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.%2C+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.%3A+Three+New+Coagulase-Negative%2C+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 Forthcoming.</li>
<li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li>
<li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף שיהווה ניגוד אינטרסים.

סיומת פריימר ניאון היא שיטה פשוטה ומהירה לקביעת קצוות &quot;5 של RNA, או לTSP- או הזדהות עיבוד RNA משנית. בשל השימוש בצבעי יסוד ניאון, ניתן להגדיר את התגובות ולרוץ ללא אמצעי אבטחה נוסף (שלא כמו במקרה של פריימרים שכותרתו רדיואקטיבית). כדגימות זוהו על ידי הקרינה, הם יכולים להיות צילמו תוך אלקטרופורזה היא בהתקדמות המאפשרת ניתוח מהיר בהשוואה לשיטות רדיואקטיביים שבו צילומי רנטגן משמשים בדרך כלל. באופן כללי, האיכות של ...

סיומת פריימר 1 היא שיטה מולקולרית כדי לקבוע קצוות '5 של מולקולות RNA ספציפיות עד רזולוציה בסיסית אחד. היתרון לשיטות אחרות כגון 5'-RACE (הגברה מהירה של cDNA מסתיימת) הוא זמן אספקה ​​המהיר והיכולת לנתח תערובת של אורכים שונים של מולקולות RNA בקלות. שיטה זו פועלת על ידי חשיפת מולקולות RNA להפוך תגובות שעתוק באמצעות פריימרים ספציפיים ניאון, יצירה שברי cDNA של אורכים מסוימים. מולקולות cDNA אלה לרוץ לצד תגובות סנגר רצף מסורתי 2 על ג'לים polyacrylamide denaturing ויכולות להיות מזוהות על ידי הקרינה שלהם בשל השימוש בפריימרים שכותרתו fluorescently. האורכים של ברי cDNA מוערכים על ידי השוואה לסולם הרצף, המאפשרים המיפוי של 5 קצות RNA ". באופן מסורתי, תגובות סיומת פריימר משמשות בשילובעם איזוטופים רדיואקטיביים לזיהוי תרכובות cDNA על צילומי רנטגן. בשל סכנות בריאותיות, בעיות סילוק פסולת ולהקל על טיפול, פרוטוקולים חדשים יותר לנצל הקרינה לגילוי סיומת פריימר עם sequencers האוטומטי, אם כי הרגישות שלהם נמוכה במקצת. באמצעות פריימרים שכותרתו fluorescently, ניתן להשמיט את הליך רדיו תיוג החוזר, כצבעי יסוד ניאון הם יציבים במשך זמן רב (יותר משנה בידיים שלנו). השיטה שאנו מתארים כאן מנצלת רצף ג'ל אוטומטי, אך עם שינויים קלים, sequencers נימים יכול לשמש גם להפרדת cDNA וגילוי 3. הטבע המקביל של ניתוח ג'ל מאפשר לזהות אפילו כמות קטנה של מחשוף RNA או עיבוד. יתרון נוסף הוא ברזולוציה הגבוהה של שיטה זו, כמחשוף או עיבוד של אף אחד בסיס מסוף ניתן לאתרם. בהקשר לזיהוי של מחשוף RNA או עיבוד, typically שני סוגים שונים של הרחבות פריימר הם מכובדים. במקרה אחד, הטיפול אנזימטי נעשה במבחנה באמצעות RNA מטוהר ואנזים מטוהר, ואילו במקרה האחר, העיבוד נעשה in vivo ו- RNA וכתוצאה מכך הוא מטוהרים. בשני המקרים RNA הוא נתון לרחבת פריימר בוצעה במבחנה, עם זאת, בהתאם למקור של RNA, השיטה היא גם נקראת סיומת פריימר vivo במבחנה או ב. בפרוטוקול אנו מציגים כאן, אנו מתמקדים אך ורק על in vivo סיומת פריימר, בגלל קלות שימוש (אין חלבונים מטוהרים צורך) ואת האפשרות לקבוע נקודות התחלת תעתיק ועיבוד באותו הזמן. עם זאת, במבחנה הרחבות פריימר באופן עקרוני להגדיר באותה הצורה ופרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת התחלה. השיטה מאוירת כאן יכולה להיות מיושמת על מינים רבים של חיידקים, כל עוד הם ניתנים לגבוהיםהכנת טוהר ותשואה גבוהה של חומצות גרעין. המחקר במעבדה שלנו מתמקד בהיקף הרגולציה של מערכות רעלן-נסיוב (ת א) 4,5, תחום שבו נעשתה שימוש נרחב בשיטת הרחבה פריימר. מדד ת"א מערכות אלמנטים גנטיים קטנים הנמצאים בגנומים פרוקריוטים שמורכבים מחלבון רעיל יציב ואופן אנדוגני פעיל וחיסון אנטי-חלבון או RNA בעיקר לא יציב שמנטרל רעילות 6,7. לפעמים פעילות רעלן מופעלת על ידי עיכוב של שכפול, סינתזת דופן תא או מנגנונים אחרים, אבל לרוב על ידי פעילות RNase 8,9. בדרך כלל, סגוליות RNase נקבע על ידי ביצוע בדיקות שונות, שאחד מהם היא שיטת סיומת פריימר. תגובות סיומת פריימר הם גם מתאימות ליישום זה, כתערובת של שברי אורך בקעו ומלאים ניתן לנתח בו זמנית כדי לקבוע את '5 מסתיים. באמצעות שילוב של במבחנה וברחבות פריימר vivo,מחשוף RNase רעלן ספציפי, לדוגמא, ניתן לקבוע סגוליות רצף 10-13. <img alt="הארכת פריימר, בידוד RNA, סינתזת cDNA, ריצוף סנגר, דיאגרמת אלקטרופורזה של ג'ל." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="איור 1"> איור 1. סקירה כללית של הליך סיומת פריימר. תרבויות חיידקים מודגרת וטופלו בהתאם לצרכי הניסוי. RNA סה"כ מופק מהתאים, שטופל בDNase אני כדי להסיר עקבות DNA ונתונים לתגובת שעתוק לאחור באמצעות פריימרים יעד ספציפיים ניאון DNA מניב cDNA. DNA או פלסמידים הגנומי מופקים ולאחר מכן משמש לתגובות סנגר רצף ניאון להשוואת גודל עם שברי cDNA. מוצרי סיומת פריימר מנוהלים על צד מוצרים סנגר רצף על ג'ל polyacrylamide האוריאה denaturing וניתחו עם לייזר ומיקרוסקופ אוטומטיים. בסיס הרצף ששורות עם להקת cDNA הוא להרח בסיס של 5 סוף cDNA '(החץ הכחול). מידע נוסף ב Fekete, et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ניתן למצוא סקירה של ההליך כולו סיומת פריימר באיור 1. בקצרה, תאי חיידקים בתרבית, שנקטפו, התא גלולה lysed וRNA חילוץ. RNA המטוהר לאחר מכן טופל בDNase אני כדי להסיר עקבות של מולקולות DNA אשר יכול לפעול כתבניות לטרנסקריפטאז ההפוך. פריימרים ניאון ספציפיים מתווספים ל- RNA, כלאה אל האזור של עניין, ולאחר מכן להפוך את תמלילי עדויות, וכתוצאה מכך דנ"א יחיד שנתקע משלים (cDNA). סולם רצף נוצר על ידי סנגר רצף מסורתי העסקת פריימרים ניאון ומופרד על ג'ל polyacrylamide denaturing צד של שברי cDNA סיומת פריימר. וכתוצאה מכךג'ל מנותח על ידי השוואת להקות ניאון, המאפשרת זיהוי של קצוות '5 של עניין. נקודות התחלת תעתיק ואתרי עיבוד מוערכים בנפרד על-ידי השוואות רצף.

<table><tbody><tr><td>AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/&micro; l)</td> <td>NEB / Roche</td><td>NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase free)</td> <td>אמביון (טכנולוגיות חיים)</td> <td>AM2222</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 מכשיר&nbsp;</td><td>MPBio</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים עם תווית פלואורסצנטית</td><td>Biomers</td><td>n/a</td><td>5' שינוי DY-681 של " "רגיל" אוליגונוקלאוטידים של DNA. צבעים תואמים כגון LICOR IRDye 700/800 זמינים גם מספקים אחרים כגון IDTdna.</td></tr><tr><td>Li-Cor 4200 Sequencer כולל ImagIR תוכנה לאיסוף נתונים</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>מוצר הופסק</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion (טכנולוגיות חיים)</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הכנת מיני פלסמיד</td><td>QIAGEN</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>RapidGel-XL-40% תרכיז</td><td>USB</td><td>US75863</td><td></td></tr><tr><td>מאגר אחסון RNA</td><td>אמביון (טכנולוגיות חיים)</td><td>AM7000</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Aqua-P/C/I</td><td>קארל</td><td>רוט X985.3</td><td>אלטרנטיבה: " חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 (עם IAA, 125:24:1)" מאמביון (AM9720)</td></tr><tr><td>SUPERase&bull; ב RNase Inhibitor</td><td>Ambion (טכנולוגיות חיים)</td> <td>AM2696</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Sequenase עם תווית פלואורסצנטית ערכת ריצוף מחזור פריימר עם 7-deaza-dGTP</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2538</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>טכנולוגיות חיים</td> מגיב <td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זירקוניה/סיליקה 0.1 מ"מ</td><td>BioSpec</td><td>11079101z</td><td></td></tr></tbody></table>

טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של rnases in vivo

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

הארכת הקרינה מבוססת פריימר (FPE) היא שיטה מולקולרית כדי לקבוע נקודת התחלת שעתוק או אתרי עיבוד של מולקולות RNA. זו מושגת על ידי שעתוק לאחור של ה- RNA של עניין באמצעות פריימרים שכותרתו fluorescently ספציפיים וניתוח בדיעבד של שברי cDNA וכתוצאה מכך על ידי denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. במקביל, תגובה סנגר רצף מסורתי מנוהלת על הג&#39;ל למפות את הקצוות של שברי cDNA לבסיסים המקביל המדויקים שלהם. בניגוד ל5&#39;-RACE (Rapid ההגברה של קצות cDNA), שבו המוצר חייב להיות משובט ומספר מועמדים רבים רצף, התפזורת של שברי cDNA נוצרו על ידי סיומת פריימר יכולה להתגלות בו זמנית בטווח ג&#39;ל אחד. בנוסף, ההליך כולו (משעתוק לאחור לניתוח סופי של התוצאות) ניתן להשלים ביום עבודה אחד. על ידי שימוש בפריימרים שכותרתו fluorescently, השימוש באיזוטופ רדיואקטיבי מסוכן שכותרתו חומרים כימייםניתן להימנע וזמני עיבוד צומצמו ניתן לאתר מוצרים במהלך הליך אלקטרופורזה. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים שיטת סיומת פריימר ניאון in vivo באופן מהיר כדי לזהות קצוות &#39;5 של RNAs להסיק תעתיק נקודות התחלה ואתרי עיבוד RNA (למשל, על ידי רכיבי מערכת רעלן-אַנְטִיטוֹקסִין) בס aureus, E. coli וחיידקים אחרים.

כפי שמתואר באיור 6, תגובת סיומת פריימר ניתן להשתמש כדי לקבוע את נקודות התחלת תעתיק של תמלילים של עניין ויכולה לעזור להסיק אזורי אמרגן (מזוהה בדרך כלל על ידי -10 ו-35 אלמנטים). בר cDNA העליון (הארוך ביותר) מייצג את הקצה 5 'של ה- mRNA, ולכן יכול להיות ממופה בקלות בהשוואה לסולם הרצף. <img alt="התחלת שעתוק ompA, מחשוף mRNA; אלקטרופורזה של ג'ל, תרשים ניתוח ביטוי גנטי." src="/files/ftp_upload/52134/5213...

אנו מתארים כאן שיטת הארכת פריימר מבוססת פלואורסצנטיות לקביעת נקודות התחלה של שעתוק מתעתיקי חיידקים ועיבוד RNA in vivo באמצעות רצף ג'ל אוטומטי.

טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases In vivo

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות נקודות התחלה של שעתוק ואתרי מחשוף RNA in vivo מחיידקים באמצעות תגובת הארכת פריימר פלואורסצנטי. זה מושג על ידי גידול חיידקים כמו אי קולי או S aria, ובידוד מולקולות ה-RNA. לאחר מכן, ה-RNA מתומלל לאחור באמצעות פריימרים פלואורסצנטיים ספציפיים וטרנסקריפטאז הפוך וכתוצאה מכך מקטעי CD NA.לאחר מכן מבודדים DNA או פלסמידים מתאי החיידקים, וסולם ריצוף סנגר פלואורסצנטי נוצר מתבנית ה-DNA באמצעות ערכת ריצוף. לבסוף, שברי ה-CDNA וסולמות הריצוף מופרדים ומתגלים בו זמנית על ג'ל פולי אקרילאמיד באמצעות רצף ג'ל אוטומטי ומושווים זה לזה. בסופו של דבר, הרחבת פריימר פלואורסצנטי משמשת למיפוי חמשת הקצוות הראשוניים של מולקולות RNA עד לרזולוציית בסיס אחת.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות כגון גזע או הרחבה ראשונית מבוססת רדיואקטיביות הוא זיהוי מהיר של חמש מקצוות מולקולות RNA כאשר הזיהוי מתרחש בו זמנית במהלך אלקטרופורזה. הרגישות דומה להרחבות ראשוניות מבוססות פעילות אדומה, אך מאפשרת לאנשי המעבדה להשתמש בשיטה זו ללא צורך בהדרכת בטיחות קרינת קצב. השתמשנו בהצלחה בטכניקת הרחבה ראשונית פלואורסצנטית זו כדי לחקור את מרכיבי ה-RNA של מערכות אנטי-רעלנים רעלנים.סטפילוקוקים שידגים את ההליך יהיה כריסטופר שוסטר, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. לאחר הכנת תפוקה גבוהה של RNA ותכנון פריימרים על פי פרוטוקול הטקסט, בצע את תגובת הארכת הפריימר על ידי חימום מוקדם של התרמו-ציקלר ל-95 מעלות צלזיוס. עבור כל דגימת RNA מערבבים את התרכובות הבאות בצינור PCR, מנטרלים את הדגימות למשך דקה אחת ב-95 מעלות צלזיוס.לאחר מכן הניחו את הצינורות על קרח למשך חמש דקות כדי להכליא את הפריימרים ואת ה-RNA. לאחר מכן, הגדר את מכונת ה-PCR ל-47 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הכינו את תערובת מאסטר התמלול ההפוך כמתואר כאן.הוסף ארבעה מיקרוליטר, תערובת מאסטר שעתוק הפוך לכל דגימת RNA היברידית ודגר את הצינורות למשך שעה ב-47 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את התגובה, מחממים את הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן הוסיפו שישה מיקרוליטרים של צבע לטעינת אמיד ואחסנו למשך הלילה או עד שבועיים בחושך במינוס 20 מעלות צלזיוס.לאחר הכנת ה-DNA הגנומי או הפלסמידים, על פי פרוטוקול הטקסט, הרכיבו את תגובת הריצוף של סנגר על ידי ערבוב של 12 מיקרוליטר של כ-10 עד 15 מיקרוגרם של DNA גנומי או 100 עד 500 ננוגרם של DNA פלסמיד עם מיקרוליטר אחד של פריימר עם תווית פלואורסצנטית ומיקרוליטר אחד של פיפטה DMSO. מיקרוליטר אחד מכל תערובת ריצוף לצינורות PCR נפרדים המסומנים מראש. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטר מתערובת הפריימר D-N-A-D-M-S-O לכל צינור.הגדר את מכונת ה-PCR לתוכנית הבאה והפעל אותה לאחר הנחת הדגימות במכונה. לאחר הריצה, הוסף שישה מיקרוליטרים של צבע טעינה לדגימות ולאחר מכן על קרח. אם משתמשים מיד או במינוס 20 מעלות צלזיוס לטווח ארוך באמצעות לוחות נקיים ונטולי אבק של 25 סנטימטרים, הנח מרווחים של 0.25 מילימטר על לוחית הזכוכית האחורית והורד את לוחית הזכוכית המחורצת בחלק העליון כשהקצה המחורץ של לוחות הזכוכית ונווטי הכניסה למסילה פונים שניהם כלפי מעלה.חבר את מסילות הג'ל לשני צידי לוחות הזכוכית והדק קלות את הכפתורים כדי להטיל את הג'ל. שלב את התרכובות המפורטות כאן בכוס עם מוט ערבוב והניח על צלחת ערבוב מגנטית. מיד לאחר הוספת PS וצוות, השתמש במזרק של 50 מיליליטר כדי לקחת את תמיסת האקרילאמיד ולהניח פילטר של 0.45 ננומטר על הקצה.הניחו את הצלחות הסנדוויץ' בזווית של 10 עד 20 מעלות והוציאו לאט את תמיסת הג'ל בין לוחות הזכוכית תוך הזזה רציפה של קצה המזרק מצד אחד למשנהו. הפסק לחלק את תמיסת הג'ל ברגע שהיא פוגשת את הקצה התחתון של לוחות הזכוכית. בעזרת וו בועות, הסר את כל הבועות שאולי נוצרו.לאחר מכן החלק את מרווח כיס הג'ל בין לוחות הזכוכית בקצה המחורץ, טבל אותו בתמיסת הג'ל, וקבע אותו על ידי הצמדת לוחית היציקה, הדק קלות את ברגי המסילה העליונה ואפשר לג'ל להתייצב למשך שעה עד שעתיים. לפני הסרת צלחת היציקה ומרווח הכיס, השתמש במים מזוקקים נטולי יונים כדי לנקות את הכיס משאריות מלח וג'ל כדי להפעיל את הג'ל. החלק את מחזיק מיכל החיץ לתוך מסילות הג'ל בלוחות הזכוכית הקדמיים והדק את הכפתורים.הנח את הג'ל למיכל הג'ל התחתון של הדמיית הג'ל האוטומטית כנגד לוחית החימום וקבע על ידי החלקת נווט כניסת המסילה לתוך תושבות המכשיר. השתמש במאגר XTBE אחד כדי למלא את תאי חיץ הג'ל העליונים והתחתונים. לאחר מכן סגור את תא החיץ התחתון והשתמש בכבל החשמל כדי לחבר את תא החיץ העליון לחשמל.אם יש מלח בכיס הג'ל, השתמש במאגר כדי להכניס שוב ושוב פיפטה לכיס כדי לנקות אותו. לאחר מכן השתמש במכסה המאגר העליון כדי לסגור את תא מיכל החיץ העליון. לאחר הפעלת המצלמת והמחשב והפעלת תוכנת איסוף נתוני ה-IR של תמונת הבסיס בהתאם לפרוטוקול הטקסט, השתמש בהגדרות המפורטות כאן כדי להגדיר את פקד הסורק.לאחר מכן, הפעל מראש את הג'ל הריק למשך 20 דקות על ידי בחירת מתח מופעל ולחיצה על Enter. בינתיים, באמצעות מכונת PCR, מחממים את סולם הרצף ואת מוצרי הארכת הפריימר ל-90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות לפני הקירור על קרח, עצור את האלקטרופורזה, פתח את רצף הג'ל האוטומטי והסר את מכסה מיכל החיץ העליון. לאחר מכן הכנס את מסרק שיני הכריש בין לוחות הזכוכית ועם שיני הכריש.חודרים מעט את פיפטת הג'ל 1-2 מיקרוליטר ממוצרי הארכת הפריימר או רצף תגובות סולם לכל כיס ג'ל. לכל כיס ריק. השתמש בצבע טעינה כדי למלא אותם כדי למנוע התנהגות ריצה לא עקבית, סגור את מיכל החיץ ואת הדלת של רצף הג'ל.לאחר מכן התחל את האלקטרופורזה על ידי בחירת מתח מופעל עבור הלייזר, בחר את מצב הסריקה מופעל ולחץ על Enter. לאחר שאזור העניין עבר את הלייזר, עצור את האלקטרופורזה כפי שמוצג כאן. ניתן להשתמש בתגובת הרחבת פריימר כדי לקבוע את נקודות ההתחלה של השעתוק או TSP של תמלילים מעניינים ויכולה לעזור להסיק אזורי מקדם.בדוגמה זו, ה-TSP של MPE mRNA זוהה כ-G בהתאם לנתונים שפורסמו קודם לכן. מרכיבי המקדם מינוס 35 ומינוס 10 הוסקו כ-T-T-G-T-A-A ו-T-A-G-A-C-T, ומוטיבים אלה נבדלים רק לבסיסים מכל אחד מרצפי הקונצנזוס שלהם המשתמשים בהרחבת פריימר לזיהוי תוצרי מחשוף mRNA. מיפוי ה-RNA של מחשוף קרוב ל-START על ידי ה-RNA Ybi SEC 2 מוצג כאן כאשר ה-RNAs אינם קיימים או לא פעילים, לא נוצרים תוצרי הרחבה של פריימר קרוב ל-START כתוצאה מפעילות RNAs.עם זאת, שתי רצועות חזקות מופיעות ממש במורד הזרם של שכבת ההתחלה באיור זה מראה ניסוי הארכת פריימר כושל עקב עודף RNA בתגובת השעתוק ההפוכה המונעת זיהוי של רצועות בודדות. זה מדגים כי יש להתאים את הכמות הכוללת של RNA תבנית לשפע ה-RNA המעניין. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבהיר נקודות התחלה של שעתוק ואתרי מחשוף RNA in vivo באמצעות פריימרים פלואורסצנטיים ורצף ג'ל אוטומטי עם קצת תרגול.שיטה זו מהירה וקלה לביצוע. בהצלחה בניסויים שלך.

fluorescence-based-primer-extension-technique-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטות photobleaching כולל שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) והפסד הקרינה photobleaching (FLIP) כדי לעקוב אחר הדינמיקה חלבון הכרומטין בתוך גזע עובריים (ES) התאים. הכרומטין הדינמיקה חלבון, אשר נחשב אחד האמצעים ללמוד פלסטיות הכרומטין, מוגברת בתאים pluripotent.

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

Exonucleases ממלאים תפקידים קריטיים בהבטחת יציבות הגנום. אובדן תפקוד האקסונוקלאז של WRN גורם להזדקנות מוקדמת. חקר מצעים ודרישות אחרות של הנוקלאז במבחנה יכול לעזור להבהיר את תפקידו in vivo. כאן אנו מדגימים בדיקה מבוססת פלואורסצנטית מהירה וניתנת לשחזור כדי למדוד את פעילות הנוקלאז שלו.

Assay exonuclease הקרינה מבוסס לאפיין DmWRNexo, Orthologue של האדם Progeroid WRN exonuclease, ויישומו nucleases אחר

משואות bimolecular ratiometric (RBMBs) יכולות לשמש לתעתיקים בודדים תמונה מהונדסת RNA בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את ההכנה וטיהור של RBMBs, מסירה של RBMBs לתוך תאים על ידי microporation ודימות פלואורסצנטי של מולקולות RNA אחת בזמן אמת.

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

בעבודה זו אנו מספקים זרימת עבודה ניסיונית כיצד ניתן לזהות משפרים פעילים ולאמת אותם בניסוי.

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

פלואורסצנטיות RNA מולקולה אחת בהכלאה במקום (smFISH) היא שיטה לכימות מדויק של רמות ולוקליזציה של RNAs ספציפיים ברמת התא הבודד. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקולי המעבדה המאומתים שלנו לעיבוד ספסל רטוב, הדמיה וניתוח תמונה לכימות תאים בודדים של RNAs ספציפיים.

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

מתיל-טרנספראזות דנ"א הן מטרות פוטנציאליות לתרופות לסרטן. כאן מוצג פרוטוקול להערכת מולקולות קטנות לעיכוב מתיל-טרנספראז של DNA. בדיקה זו משתמשת באנדונוקלאז למתילציה זוגית של דנ"א ליצירת פלואורסצנציה ומאפשרת לנטר את פעילות האנזים בזמן אמת.

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

מחקר זה מציג בדיקת FRET רציומטרית פשוטה וידידותית למשתמש לאיתור והערכה כמותית של פעילות DNase, ומדגים את יישומו בניתוח נוקלאז חלש.

הערכת פעילות DNase על ידי העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית רציומטרית

פרוטוקול זה מודד כמותית את היציבות ומחצית החיים של RNA מגביר בין-גני ותוך-גני בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות טיפול אקטינומיצין D, RT-qPCR וניתוח רגרסיה לא ליניארית. אסטרטגיות נרמול ספציפיות למיקום משולבות כדי למודל במדויק את דינמיקות דעיכת eRNA באופן תלוי הקשר.

הערכה כמותית אופטימלית של יציבות RNA משפר בתאי גזע עובריים בעכבר

למד טכניקת הארכת פריימר מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי נקודות התחלת תעתיק ואתרי חיתוך של RNA בחיידקים. השיטה משתמשת ברצף ג'ל אוטומטי לזיהוי בו-זמני של תוצרי cDNA וסולמות ריצוף.

טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases In vivo

גלה סרטונים נוספים