אוטומציה של ניסויי שבב seq כדי ליצור פרופילים אפיגנטיים על 10,000 תאים הלה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק לחוקרים פלטפורמה אוטומטית המסוגלת לבצע ניסויי כרומטין על 10,000 תאים בלבד. זה מושג על ידי הכנת כרומטין גזוז באיכות גבוהה למשקעים החיסוניים של הכרומטין. בשלב השני, נוצר ניסוי אוטומטי של משקעים חיסוניים של כרומטין וספריות אוטומטיות מופעלות עם ה-DNA המשקע החיסוני.

ה-DNA המשקע החיסוני מנותח על ידי PCR כמותי וריצוף הדור הבא. בסופו של דבר, ניתן לאמת את הצלחת הטכנולוגיה האוטומטית באמצעות השוואה של פרופילי רצף המשקעים החיסוניים של כרומטין שנוצרו על דגימת התאים המקורית של 10,000 עם ניסויים שבוצעו על 100,000 תאים ומערכי נתונים קיימים לעיון. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטי כדי לקדם את הבנתנו את התפקודים של סמנים ביולוגיים ספציפיים ברקמות שונות.

שלבי התפתחות ומצבי מחלה. לטכניקה זו יש השלכות על אבחון מחלות מרובות מכיוון שהיא תעזור לזהות סמנים ביולוגיים אפיגנטיים בבריאות ומחלות, מדויקים ואמינים. טכנולוגיות אוטומטיות הן כלים חשובים לחוקרים בניתוח אפיגנטי של סוגי תאים ספציפיים, תת-אוכלוסיות וביופסיות.

עבור ניסוי חיסון אוטומטי סטנדרטי של כרומטין התחל בהוספת 120 מיקרוליטר של מאגר חיסון כרומטין H ל-100 מיקרוליטר של כרומטין גזוז ממיליון עד 2 מיליון תאים, תוך שמירת שניים עד 20 מיקרוליטר כרומטין לדגימת הקלט. לאחר מכן, כדי להגדיר את הניסוי האוטומטי בכוכב ה-IP, בחר פרוטוקולים ולחץ על סמל הכרומטין. בחר את השיטה הישירה של כרומטין immunoprecipitation, ולאחר מכן במסך הבא, בחר את פרוטוקול chromatin immunoprecipitation 200 מיקרוליטר וציין את מספר הדגימה.

הגדר את הפרמטרים הניסיוניים של כרומטין לארבע שעות עבור ציפוי הנוגדנים. שלב 15 שעות לשלב המשקעים החיסוניים, וחמש דקות לכל שלב כביסה. לאחר מכן הגדר את הריאגנטים בהתאם להוראות המוצגות במסך מידע הפריסה, והוסף את הריאגנטים המתאימים ונוגדנים בדרגת ChIP-seq מאומתים מאוד.

לאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר חלבון, חרוזים מגנטיים מצופים A לכל תגובה, ודגימות הכרומטין לאחר פרוטוקול השבב הלילה והקישור ההפוך הסתיימו. טהר את ה-DNA עם ערכת טיהור DNA מבוססת חרוזים מגנטיים. השתמש בבדיקה פלואורומטרית מסחרית רגישה ביותר כדי לכמת את ה-DNA המשקע החיסוני.

לאחר מכן, שימוש בפריימרים לפחות לאזור גנומי חיובי אחד ושלילי אחד. לנתח את איכות ה-DNA המשקע החיסוני על ידי PCR כמותי על פי הפרמטרים המתאימים של החומרים לניתוח. התוצאות מבוטאות כאחוז ההתאוששות של הקלט עבור ריצוף הדור הבא תחת פרוטוקולים.

כעת לחץ על סמל הכנת הספרייה, ולאחר מכן בחר את טכנולוגיית הכנת הספרייה המועדפת והגדר את הריאגנטים בהתאם להוראות במסך מידע הפריסה. לדוגמה, בניסוי זה, נוצרו פרופילי ריצוף לשישה שינויים שונים בהיסטון הקשורים לביטוי גנים. מתאם השיא הגבוה שנצפה בין סמני היסטון אלה מצביע על יכולתה של המערכת האוטומטית לייצר נתונים מדויקים ואמינים.

יתר על כן, גרפים אלה מראים את התפלגות הפסגות עבור שינויי ההיסטונים השונים באזורים גנומיים ספציפיים. לבסוף, עבור ניסוי אוטומטי של כרומטין אימונו-משקעים עבור דגימות עם מספר תאים נמוך, הגדר את פרוטוקול כרומטין אימונו-משקעים אוטומטי של 200 מיקרוליטר במערכת האוטומציה כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, טען את המערכת ב-ChIP-seq, דרג נוגדנים וריאגנטים אופטימליים לעבודה על כמויות כרומטין בין 10,000 ל-100,000 תאים תוך שימוש ב-10 מיקרוליטר חלבון בלבד, חרוזים מגנטיים מצופים לכל תגובה.

לאחר השבב, הפעל את הכנת הספרייה, בחר את פרוטוקול ההכנה של ספריית המיקרו plex והגדר את הריאגנטים בהתאם להוראות המוצגות במסך מידע הפריסה. ב-PCR כמותי מייצג זה של משקע חיסוני כרומטין מדגימה התחלתית של 10,000 תאים, נצפו העשרה משמעותית עם נוגדנים אנטי-היסטונים באזורי הבקרה החיוביים ואותות זניחים באזורי הבקרה השליליים. כאן מוצגת סדרה של 10 תגובות אימונו-משקעים שהיו ניתנות לשחזור ודומות מאוד לניסוי ידני של כרומטין אימונו-משקעים המדגימות את יכולתה של המערכת האוטומטית לעבוד עם כמויות תאים נמוכות ללא עלייה נראית לעין בניסוי לניסוי שונות בהשוואה למשקעים חיסוניים ידניים.

נתונים אלה ממחישים את הניתוחים הביואינפורמטיים של ספריות הרצפים של 10,000 ו-100,000. הוא תאי S3 לאחר משקעים חיסוניים של כרומטין, המדגימים תוצאות יוצאות דופן מדגימות אימונו-משקעים של כרומטין במספר תאים נמוך. מערך נתונים זה, המתאים לניסוי עם 10,000 תאים של חומר מוצא, מכיל רעש רקע נמוך עם שיאי העשרה אמינים ביותר המאושרים הן על ידי מערך הנתונים של 100,000 תאים והן על ידי מערך נתוני הייחוס של מכון ברוד.

עבור פרויקט הקידוד, חשוב לציין כי נתוני 10,000 התאים מציגים שיאים כמעט זהים לנתוני מכון ברוד עם יחס חפיפה של 98% של 40% הטובים ביותר מהפסגות המדורגות על ידי הציון המשמעותי כפי שנעשה בו שימוש בפרויקט קוד הקצה. המערכת האוטומטית של כוכב ה-IP דורשת התערבות מינימלית של המפעיל, מה שמפחית את זמן ה-HandsOn של המשקעים החיסוניים של הכרומטין לשעה עד שעתיים בלבד. בנוסף, התהליך האוטומטי מחליף את השלבים הרבים המועדים לשגיאות של משקע חיסוני כרומטין ידני, ומספק תוצאות עקביות ביותר.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי משקעים חיסוניים טובים של כרומטין ומבחר טוב של נוגדנים ספציפיים ורגישים ביותר הם המפתח להצלחת הניסוי. טכנולוגיה זו סללה את הדרך לחוקרים בכל תחום בביולוגיה לשפר את הדיוק, השחזור והעקביות של הטיפול. מחקרי אפיגנטיקה.