גזירה ואפיון ללא transgene האדם המושרה pluripotent גזע קו סלולארי והמרה לתנאי כיתה קלינית מוגדרים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק תאי גזע פלוריפוטנטיים נטולי גורמים מתוכנתים מבוססי לנטי-ויראלי ולהמיר תאים אלה לתנאים קליניים משוערים. זה מושג על ידי תכנות מחדש של פיברובלסטים אנושיים עוריים בוגרים עם קלטת תאי גזע לנטיוויראלית אחת גדולה או מכונית גזע לתוך PSCs HI. לאחר מכן, ה-HI PSCs שתוכנתו מחדש נחשפים לנגיף הגרגור של אדנו קרי לצורך כריתה מלאה והסרה של מכונית גזע מהגנום המארח.

לאחר מכן מיצוי DNA גנומי מ-HI PSCs ללא מזין, ואחריו ניתוח אגל מאשר כריתה נכונה של מכונית גזע. לבסוף, גורם 3 H IPCs מומרים לתנאים משוערים בדרגת GMP על ידי מתודולוגיית המרה איטית לתנאים נטולי קסנו מוגדרים במלואם. בסופו של דבר, תכנות מחדש מבוסס ויראלי של פיברובלסטים עוריים בוגרים אנושיים והמרה מלאה של H IPCs למצבים בדרגה קלינית מדגישים את הישימות הרחבה של מתודולוגיה זו לתכנות מחדש של תאים אנושיים בוגרים והמרתם למצבים רלוונטיים מבחינה קלינית.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על יישומים קליניים של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם מכיוון שהם נטולי גורמים לחלוטין ומומרים לתנאים קליניים, מה שהופך אותם לתואמים לטיפולים בבני אדם. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד תכנות מחדש של כריתה ושלבי המרה בדרגה קלינית בגלל ההליכים המורכבים והספציפיים העיקריים שיש לבצע כדי להניב פקטור שלוש ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים בדרגה קלינית כדי להתחיל בהפשרה. פיברובלסטים אנושיים עוריים בוגרים או HAFs באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.

הקפידו לא לטבול את החלק העליון של הבקבוקון במים. הנח את תרחיץ התאים של מיליליטר אחד לתוך בקבוקון כרוניקה של 15 מיליליטר כדי להשעות מחדש את התאים ולדלל את ה-DMSO בצורה טיפתית. מוסיפים לאט לאט ארבעה מיליליטר צנטריפוגה בינונית מחוממת מראש את הסגול 200 פעמים G למשך 10 דקות של טמפרטורת החדר.

לאחר מכן שאפו את הסופ, נסנט וראוס. השעו את התאים בבינוני עד 100,000 תאים למיליליטר לבאר אחת של צלחת שש בארות עד 0.2% ג'לטין. הוסף שני מיליליטר ממתלה התא, ואז הוסף שני מיליליטר מתלה לשנייה.

ובכן, כדי לשמש למדידת ריבוי זיהום או MOI נדנד את הצלחת מצד לצד וקדימה ואחורה כדי לפזר את התאים באופן שווה לפני הדגירה שלהם למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בתא לח. 24 שעות לאחר ספירת התאים מפשירים פעמיים מרכז את שמונה יחידות ההתמרה או S של תרכיז לנטי-ויראלי שווה ערך והשתמש במדיום huff כדי לדלל אותו ל-10 פעמים לשמונה TS למיליליטר באמצעות חצי מדיום בתוספת שמונה מיקרוגרם למיליליטר של מגיב טרנספקציה. להמיר את התאים ביחס של 10 ריבוי זיהום.

מערבבים את בארות התמרה באופן שווה ודוגרים למשך הלילה כ-24 שעות לאחר התמרה לנטי-ויראלית. הסר את מדיום ה-huff והחלף אותו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים סטנדרטיים או מדיום PSC. שנה את המדיום מדי יום בימים השני עד השישי ביום השישי לשני צלחת כלים מצופה ג'לטין 10 סנטימטר 1.5 עד 1.75 כפול 10 לששת הפיברובלסטים העובריים של העכברים שמקורם בגורם רכיב המשלים אחד או CF עכבר אחד בחצי מדיום ביום השביעי.

הוסף נסיעות בטמפרטורת החדר לבאר אחת מתוך צלחת שש בארות של הפיברובלסטים שתוכנתו מחדש. היא מרימה בעדינות את התאים ומסובבת 100 פעמים G עם צלחת בינונית טרייה של PSC אנושי את כל התאים ביחס של 1 ל-16 על שתי צלחות CFI מת' של 10 סנטימטרים. מחלקים את האגרגטים בתנועה ספירלית בכיוון השעון ודוגרים כ-48 שעות לפני החלפת המדיום.

לאחר שלושה עד ארבעה שבועות, השתמש במחט בגודל 21 כדי לבחור שמונה עד 10 חתיכות בודדות של מושבות ספציפיות עם מורפולוגיה כמו ESC טיפוסי ולשכפל אותן לבארות בודדות של CFI MFS לאחר הרחבה. אשר שהתאים הם פלוריפוטנטיים על ידי היווצרות גוף העובר וניתוח ביטוי הסמנים לאחר אימות אתר אינטגרציית מכונית הגזע כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. מכונית גזע בלו על ידי שאיבת מדיום ה-PSC האנושי הישן לשלושה מיליליטר של מדיום PSC סטנדרטי ביחד.

45 מיקרוליטר של אדנו קרי פור או וירוס מרוכז עם שמונה מיקרוגרם למיליליטר של חומרי טרנספקציה. לאחר מכן מוסיפים לתאים ודוגרים במשך 24 שעות לאחר הדגירה, שואבים את הנגיף supinate גורם למדיום PSC אנושי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן הוסף מדיום HPSC עם שני מיקרוגרם למיליליטר של מיצין טהור והחלף מדי יום לאחר חמישה ימים, שכפל את המושבות הנותרות והרחיב אותן כפי שתואר קודם לכן בסרטון.

לאחר מכן יש להפשיר בקבוקון אחד של מטריצת קרום הבסיס של pre Eloqua על קרח ולדלל את המדיום הבסיסי הקר לריכוז סופי של אחד עד 30. השתמש במיליליטר אחד לבאר כדי לצפות את מספר הבארות הרצוי של צלחת שש בארות ותן לצלחת לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן בעזרת מחט בגודל 18, הצליבו לפחות 20 עד 30 מושבות מבאר שהייתה מצופה בעבר ב-mes.

הקפד להפחית את ההתרוממות והעברת התאים מהצלחת. לאחר הדגירה של שעה, שאפו את המטריצה מהבאר המצופה בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר. הסר חתיכות מהמושבות על ידי גירוד עדין מהצלחת הישנה והניח אותן בזהירות לשלושה מיליליטר של מדיום משולב טרי, אחד בצלחת מצופה מטריצה.

לאחר דגירה של 48 שעות, החלף את המדיום מדי יום כאשר ה-PSCs שהומרו ללא כריתה ומזין מגיעים לשטף של 80%. השתמש בערכת מיצוי DNA מסחרית כדי לחלץ את ה-DNA הגנומי באמצעות הפריימרים המוצגים כאן הספציפיים לאינטגרציות אקסוגניות של נגיף ה-lentivirus של מכונית הגזע. לנתח את ה-DNA על ידי PCR לצורך כריתה נכונה כדי להעביר את ה-PSCs שלאחר כריתת HI לתנאי דרגת GMP.

מערבבים HPSC משולב בינוני אחד ובינוני תואם GMP בדרגה קלינית או בינוני משולב שניים ביחס של 80 עד 20 טרום חימום ל-37 מעלות צלזיוס. שאפו את המדיום המשולב הישן מהתאים והחליפו בשלושה מיליליטר של תמיסת המדיום החמה החדשה. החלף את המדיום מדי יום למשך שלושה ימים במעבר לפי פרוטוקול הטקסט כדי לשמור על גודל וצפיפות מושבה נאותים ביום הרביעי, החלף את המדיום בתערובת של 50 50 של מדיות משולבות חמות אחת ושתיים דגירה למשך שלושה ימים.

החלפת המדיום היומי ביום השביעי, עבור ליחס של 20 עד 80 של מדיות משולבות מחוממות 1 ו-2 בהתאמה והחלף מדי יום למשך שלושה ימים. ביום ה-10, עברו ל-100% משולב בינוני והחליפו מדי יום. התאים נמצאים כעת בתווך נטול קסנו מוגדר לחלוטין.

לאחר מכן, לאחר שימוש במצע מוגדר נטול קסנו לציפוי באר אחת של צלחת שש בארות, החלף את המדיום החופשי קסנו בבאר של תאי מפגש במדיום טרי המכיל סלע x אחד. לאחר דגירה של שעה, השתמש במחט בגודל 18 כדי מכנית את התאים לתוך הטרי שהוכן . ובכן, אפשר לתאים לדגור ללא הפרעה במשך יומיים כדי לאפשר התקשרות מקסימלית לפני אפיון התאים על פי פרוטוקול הטקסט.

איור זה מציג תמונה מייצגת של שלושה קווי H-I-P-S-C שונים שנכרתו מראש לאחר תכנות מחדש עם גישת מכונית הגזע על שכבת MES המוצגת כאן היא ג'ל PCR שעתוק הפוך לאחר כריתה המציג תת-שיבוט מסוים אחד נקי לחלוטין מווירוס ה-lentivirus של מכונית הגזע, כפי שמעיד היעדר פס אמפליקון ספציפי לרצף מסוים אנדוגני למכונית גזע. באיור זה, IPCs שהומרו מראש על מטריצה המכילה קסנו ו-IPCs ללא GMP ללא קסנו בדרגה H על מטריצה סינתטית מוצגים כימות של גורמים הקשורים לפלוריפוטנטיות סטנדרטית, כולל SOX שתיים, OCT ארבע ונאנוג. השימוש ב-QPCR מתואר כאן.

לבסוף, כפי שניתן לראות כאן, PSCs HI שהומרו לפני ואחרי המרה לתנאי דרגת GMP נבדקו באמצעות ציטומטריית זרימה עבור חומצה סיאלית וחומצה עצבית גליקול המעידה על אנטיגנים לא אנושיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנת מחדש פיברובלסטים עוריים אנושיים בוגרים עם וירוס התכנות מחדש של stemco, להוציא את הנגיף מהגנום, ולאחר מכן להמיר באופן מלא את ה-PSCs הללו לתנאים בדרגה קלינית התואמים לחלוטין לטיפולים בבני אדם. אל תשכח שעבודה עם staca, וקטור אנטי-ויראלי מהדור השלישי יכולה להיות מסוכנת ביותר ואמצעי זהירות.

יש להשתמש ב- PPE תקין כזה ובחדר תרבית רקמות VSL שניים פלוס בעת ביצוע הליך זה.