הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח טכניקת מיצוי DNA חדשה המשלבת הומוגניזציה מכנית של DNA עם הסרת מעכבי PCR ותקן הזהב ושיטת המיצוי הסומטי לדגימות סביבתיות לאורך רצף ייצור העופות. זה מושג על ידי חלוקה תחילה של דגימה סביבתית לצינורות מיקרו צנטריפוגות המכילים תערובת של חרוזים כדי להומוגניזציה יעילה של הדגימות הסביבתיות המורכבות. השלב השני הוא למקם את הצינורות בהומוגנייזר בעל עוצמה גבוהה כדי לשחרר ביעילות חומצות גרעין מתאי החיידקים ומהמטריצה הסביבתית.

לאחר מכן, ההומוגנאט משמש כחומר המוצא לשיטת מיצוי ה-DNA האנזימטי בתקן הזהב באמצעות שלב קשירת עיכוב ה-PCR. השלב האחרון הוא למקם את הדגימות בתחנת עבודה רובוטית לחילוץ DNA כדי לספק למשתמש דגימות DNA שחולצו הניתנות לשורה של יישומים במורד הזרם, בסופו של דבר ניתוח PCR ומיקרוביום כמותי באמצעות פלטפורמת MiSeq מאלומיניום, שימשו כדי להראות ששיטה היברידית חדשה זו מספקת את השילוב הטוב ביותר של הערכות איכותיות וכמותיות של סך קהילות החיידקים בהשוואה לעיבוד דגימות בשיטת מיצוי מכני או אנזימטי לבד. שיטה זו מספקת תובנה לגבי ניתוח קהילות מיקרוביאליות לאורך רצף ייצור העופות, אך ניתן ליישם אותה גם על מערכות חקלאיות אחרות כגון בקר חזירים או ייצור יבולים המכילים דגימות סביבתיות מורכבות דומות.

שתדגים את ההליך הזה היום תהיה קייטלין גריפין, סטודנטית במעבדה שלי. כדי להתחיל בניסוי, הגדר אמבט מים ל 95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שקלו שלושה שכפולים של 0.33 גרם כדי לנתח בסך הכל גרם אחד של טמפרטורת החדר, אדמה או חומר צואה לכפפות החלפת צינור ET של מטריצת ליזינג של שני מיליליטר בין דגימות.

הוסף 825 מיקרוליטר של מאגר נתרן פוספט ו-275 מיקרוליטר של תמיסת קדם ליזה או PLS לצינור דגימה. לאחר מכן מערבל את הדגימות למשך 15 שניות לאחר ערבוב הצנטריפוגה של הצינורות ב-14,000 Gs למשך חמש דקות. שפכו את הסופרנטנט והוסיפו 700 מיקרוליטר של חיץ A SL. לאחר מכן מערבב את הצינור למשך חמש שניות.

פתח צינור אחד בכל פעם כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, ודא שיש מרווח ראש של 10% מהנפח הכולל בצינור החרוטי לפני הכנסת הדגימות למכשיר ההכנה המהירה 24. הומוגניזציה של הדגימות במהירות של שישה מטרים לשנייה למשך 40 שניות.

שימו לב להבדל בין הכנה מהירה 24 למערבולת לאחר הומוגניזציה. צנטריפוגה את הדגימה ב-14,000 Gs למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של שני מיליליטר לדגימה הנותרת בצינור ה-ET של מטריצת הליזינג ב-700 מיקרוליטר נוספים של מאגר SL הומוגניזציה וצנטריפוגה.

באמצעות ההגדרות הקודמות, הניחו תפסי נעילה מפלסטיק על צינורות הדגימה כדי להבטיח שהם לא ייפתחו וידגרו את הסופרנטנטים באמבט מים של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, פתח כל צינור מיקרו צנטריפוגה כדי לשחרר את הלחץ, כסה מחדש את הצינורות ומערבל אותם למשך 15 שניות. צנטריפוגה את הדגימות ב-14,000 GS למשך דקה אחת.

לאחר הצנטריפוגה העבירו 1.2 מיליליטר של הסופרנטנט לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של שני מיליליטר. לאחר מכן הנח את חבילת השלפוחית המכילה את הלשונית ישירות מעל צינור המיקרו צנטריפוגה הפתוח ודחף בעדינות את הלשונית החוצה מחבילת השלפוחית לתוך הצינור. כדי למנוע מגע בין לשונית העיכוב X לשפופרת, הוסף לשונית עיכוב X אחת לכל דגימה.

לאחר מכן, מערבל את הצינורות עד שהדגימות הופכות לנוזל לבן אחיד. דגרו את הדגימות למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וצנטריפוגה אותן ב-14,000 גבינה למשך חמש דקות תוך הימנעות מחלקיקים שנותרו בתחתית הצינורות. העבירו את כל הנוזל לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר.

ואז צנטריפוגה את הצינורות במלוא המהירות למשך חמש דקות. לפני שתתחיל בטיהור DNA אוטומטי, ודא שתחנת העבודה מכילה את הכמות המתאימה של קצות מסננים ומאגרים. לאחר מכן, הוסף צינורות אלוציאן וצינורות סינון למתאמי הרוטור והוסף 400 מיקרוליטר מכל דגימה לחריץ האמצעי של מתאם הרוטור.

הנח את מתאמי הרוטור בצנטריפוגה של תחנת העבודה וודא שכל מכסי צינור המיקרו צנטריפוגה מאובטחים כראוי בתוך מתאם הרוטור. הוסף תמיסת חלבון K לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי של 1.5 מיליליטר והנח אותו בחריץ A בתחנת העבודה. הוסף שני צינורות מיקרו צנטריפוגה עם נעילה בטוחה של מיליליטר לחלק השייקר של תחנת העבודה, וודא שהמכסים של צינורות הדגימה ממוקמים היטב.

באמצעות מסך המגע בתחנת העבודה, בחר את פרוטוקול זיהוי פתוגנים של צואה אנושית של צואה DNA וקרא את המסכים הבאים כדי לוודא שתחנת העבודה נטענה כהלכה. לאחר העברת כל מסכי הבדיקה, בחר התחל כדי להפעיל את הפרוטוקול. לאחר מכן הסר את הדגימות ממתאמי הרוטור.

שלב את שלושת טיהורי השכפול עבור דגימה בודדת באמצעות מערכת מבוססת אידוי צנטריפוגה. הוצא מחדש את הדגימה לנפח סופי של 100 מיקרוליטר עם מאגר טריס EDTA. לבסוף, כסו את הדגימות והניחו אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהן נחוצות לניתוח במורד הזרם.

גרף זה מדגים כי השיטה המכנית סיפקה באופן עקבי את הערכות השפע הגבוהות ביותר של גנים מנורמלים חיידקים עבור דגימות צואה ופסולת. לשיטה האנזימטית היו ההערכות הנמוכות ביותר בכל המקרים. שיטת המיצוי ההיברידית החדשנית ייצרה את השילוב הטוב ביותר של הערכות איכותיות וכמותיות של קהילת החיידקים הכוללת.

מבין שלוש שיטות המיצוי שנבדקו. כעת אמורה להיות לך הבנה טובה יותר כיצד לבצע את שיטת מיצוי ה-DNA ההיברידית האוטומטית למחצה הזו ולראות את התועלת שלה בהערכה איכותית וכמותית של קהילות מיקרוביאליות מדגימות סביבתיות מורכבות.