Name: מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: למד שיטה פשוטה ואמינה למדידת תגובת האכלה בהידרה בתגובה לגלוטתיון מופחת. השיטה מודדת את המרחק בין קצה המשושה לפה ומאפשרת חקר מנגנוני חישה כימית ומערכת העצבים הפשוטה של היצור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אסירי תודה ל-K.P. Madhu, Nita Beliappa ולצוות מרכז המדיה של המכון ההודי לחינוך ומחקר מדעי, פונה על עזרתם בהפקת הווידאו. העבודה נתמכה על ידי מימון במסגרת תוכנית מרכז המצוינות של המחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו ל-SG ומלגת פוסט-דוקטורט על ידי המחלקה למדע וטכנולוגיה, ממשלת הודו ל-RK.

1. הידרה תרבות ומדידה של תגובת ההאכלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על פוליפים מפלצת בתרבות על ידי האכלה להם מדי יום עם הארטמיה ולשמור אותם במדיום (חיץ 1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.6, 1 מ"מ NaCl, 1 מ"מ CaCl 2, 0.1 מ"מ KCl, ו0.1 מ"מ MgSO 4) הכלולים ב קערת זכוכית על 18 מעלות צלזיוס תחת מחזורים כהים שעות אור-12 12 שעות כפי שתוארה קודם לכן 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידת תגובת ההאכלה, להעביר את אחד להבשיל פוליפ מפלצת שיש 5 עד 6 זרועות ולבודדות של צלחת 24 גם. הסר את מדיום השייר מהבאר על ידי הטיית אותו, ולאחר מכן להוסיף באופן מיידי 500 μl של מדיום חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון גלוטתיון 9 מיקרומטר במדיום מפלצת. מאז פתרון גלוטתיון הוא נוטה לחמצון, תמיד להשתמש בפתרון גלוטתיון מוכן טרי עבור כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת לפלטפורמת ההדמיה של מיקרוסקופ שיש הפרשות להקלטת תמונה. השתמש ברקע כהה באופן שo ההתנהגותפוליפ מפלצת F ניתן הדמיה בבירור על הרקע המנוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר המשמש לצפייה והדמית ההתנהגות חופשית מפלצת מאורות בעוצמות משתנות, זרמי אוויר ורעש. הפרעות כאלה עלולות לגרום גם פוליפ המפלצת להראות התכווצות של זרועות - גם בהיעדרו של גלוטתיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר פוליפ להירגע במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שפוליפ ממוקם לאורך האזור המרכזי של הבאר, כך שההתנהגות ניתן הדמיה ברורה. אם פוליפ הוא בקצה של הבאר, להביא אותה למרכז על ידי שטיפה הבינוני באמצעות פיפטה ושוב לאפשר לו להירגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד תמונה של מפלצת במצב רגוע. זה יהיה תצפית נקודת אפס-הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות 9 מיקרומטר פתרון גלוטתיון להגיע לריכוז סופי של 3 מיקרומטר בבאר. בהתאם לצורך של הניסוי והתגובה מוצג על ידי מפלצת, לבדוק מגוון של ריכוזים שונים של גלוטתיון וChoose הריכוז המתאים הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל את הטיימר מייד לאחר הוספת פתרון גלוטתיון וללכוד תמונות אחרי כל שניות 15-30 ל4-5 דקות. אין לשנות את הגדרות ההגדלה במהלך ההדמיה הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את פתרון גלוטתיון בעדינות ובזרימה אחידה כך שעמדתו של בעל החיים ובתהיה מוטרדת מינימאלית בשדה הראייה של המיקרוסקופ. עם זאת, אם פוליפ נע בהרחבה לאחר הוספת פתרון גלוטתיון, להזיז את הצלחת בעדינות רבה כדי להביא את פוליפ בשדה הראייה ללכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסוי השליטה, להשתמש במדיום חסר גלוטתיון תוך שמירה על כל הפרמטרים האחרים זהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לבצע את כל שלבי ניסוי מעל במחצית הראשונה של היום - לפני 13:00 להימנע ההשפעה האפשרית של קצב היממה על מידת היענות האכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח כל אחת מהתמונות שנתפסו באמצעות תכנית GNU תמונת מניפולציה (GIMP). </li> השתמש בכלי "מדוד" זמין מתפריט&gt; כלים&gt; למדוד כדי לקבוע את המרחק בין קצה קודקוד של כל אחד מהזרועות וhypostome. אם פתיחת הפה הוא ציין בכל אחת מהתמונות, לקבוע את המרחק בין המרכז של הפה נפתח וסוף הפסגה של הזרוע. עיין במרחק זה כמו התפשטות הזרוע. <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את התפשטות הזרוע הממוצעת לכל פוליפ לפני ואחרי חשיפת גלוטתיון. לחשב את היחס של התפשטות זרוע ממוצעת בנקודת אפס זמן לזה שבכל אחד מנקודתי הזמן שלאחר מכן. יחס זה נקרא התפשטות זרוע היחסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מדידות לפחות 20 פוליפים. </li></ol><img alt="משוואת 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400"> <img alt="משוואה 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450"> 2. שיטת אימות באמצעותדגם רעב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרעב, להעביר כמה פוליפים הידרה לקערת זכוכית נפרדת ולא להאכיל אותם במשך 5 ימים. להאכיל את קבוצת הביקורת של כמה פוליפים יומיים עם הארטמיה בקערה בגודל דומה. לשנות את המדיום משני ניסויי קערות יומיים, כדי למנוע צמיחת פטרייה במדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של הניסוי, להאכיל את קבוצת הביקורת של מפלצת עם הארטמיה עבור שעה 1 ולהשתמש בהידרה אלה לניסויים הבאים לאחר הסרת כל הארטמיה לא נאכלה ומת מהמדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את תגובת ההאכלה של המפלצת הרעבה בהשוואה למפלצת מקבוצת ביקורת בשיטה שתוארה קודם לכן בשלב 1. כדי למנוע כל הטיה בשל זמן של התבוננות, להחליף את המידות של כל אחד מרעב ולשלוט פוליפים מפלצת. </li></ol>

<ol><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+control+of+the+specific+feeding+reactions+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Ny.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra.</a> Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).</li>
<li>Beckmann, A., Ozbek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nematocyst%3A+a+molecular+map+of+the+Cnidarian+stinging+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle.</a> Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).</li>
<li>Venturini, G., Carolei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+receptors+in+Hydra.+Pharmacological+and+biochemical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).</li>
<li>Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+and+GABAnergic+control+in+the+tentacle+effector+systems+of+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris.</a> Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+GABA+and+glycine+in+the+modulation+of+chemosensory+responses+in+Hydra+vulgaris+%28Cnidaria%2C+Hydrozoa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiology%22%5BJournal%5D)">Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa).</a> Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+NMDA+receptors+in+Hydra%3A+a+biochemical+and+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study.</a> Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).</li>
<li>Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allatotropin%3A+An+ancestral+myotropic+neuropeptide+involved+in+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+Hydra+glutathione+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins.</a> FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).</li>
<li>Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Glutathione+in+the+Nervous+System%22">Glutathione in the Nervous System</a>. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).</li>
<li>Venturini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydra+GSH+receptor.+Pharmacological+and+radioligand+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).</li>
<li>Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+and+phylogenetic+characterization+of+common+hydra+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Description and phylogenetic characterization of common hydra from India.</a> Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).</li>
<li>Horibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+catabolic+pathway+of+glycosphingolipids+in+a+hydrozoan%2C+Hydra+magnipapillata.+Involving+endoglycoceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase.</a> J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).</li>
<li>Koizumi, O., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rise+of+feeding+threshold+in+satiated+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rise of feeding threshold in satiated Hydra.</a> J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).</li>
<li>Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+and+detergent+solubilization+of+the+putative+glutathione+chemoreceptor+from+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra.</a> Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).</li>
<li>Morita, H., Hanai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+receptor+proteins+in+invertebrates+-+with+special+reference+to+glutathione+receptor+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra.</a> Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).</li>
<li>Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+involvement+in+Hydra+vulgaris+very+primitive+olfactory-+like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system.</a> Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).</li>
<li>Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+homologous+subunits+form+a+high+affinity+peptide-gated+ion+channel+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra.</a> J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).</li>
<li>Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+family+C+G-protein-coupled+receptors+by+the+tripeptide+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione.</a> J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).</li>
<li>Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+in+hydra+is+modulated+by+glycine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).</li>
<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

התנהגות אכילה בהידרה מייצגת את אחת ממערכות chemosensory האבות ביותר בmetazoans. למרות הנוכחות של GSH בנוזל הסרטנים שוחרר לאחר לכידת טרף בסיוע nematocyst זוהתה מזמן 1, לא חלבון GSHR ולא את גן הקידוד המשוער / s מתאפיינת ממפלצת עד כה. ניסיונות מעטים שנעשו לאפיין GSH מחייב חלבונים במפלצת 8, 14, 15. עם זאת, זהותם של חלבוני הקולטן המשוערים אלה נשאר רכיבים מעורפלים ומעט מאוד אחרים מולקולריים, אשר עשוי לתרום לתגובת ההאכלה, כבר דיווחו ל תאריך 16, 17. GSHR ה...

הידרה הוא האורגניזם הפרימיטיבי ביותר בעל מערכת עצבים וכימותרפיה לזיהוי גלוטתיון מופחת (GSH) ללכידת הטרף1. הוא ניזון ממגוון בעלי חיים כגון נמטודות, סרטנים, זחלי חרקים, ראשנים ודגים שזה עתה בקעו1. התנועה של אורגניזמי הטרף האלה גורמת לפריקה מכנית-חושית של הקפסולות הצורבות הנקראות נמטוציסטים מהידרה, המוחדרות לטרף2. GSH הקיים בנוזל המשתחרר מהטרף הפצוע מפעיל לאחר מכן את תגובת ההזנה בהידרה הכוללת סלסול של הזרועות כדי להביא את הטרף לכיוון הפה, פתיחת הפה וכתוצאה מכך בליעת הטרף. מולקולות מרובות, כגון דופמין3, גלוטמט4, GABA, גליצין5, קולטני NMDA6 ואלטוטרופין7, הוכחו כמעורבות בתגובת ההזנה בהידרה. כמו כן, הוכח כי התגובה הכימו-סנסורית הנגרמת על ידי GSH מווסתת על ידי מצב ההזנה של בעל החיים כך שההידרה המורעבת הפגינה תגובת הזנה משופרת1. עלייה כזו ברגישות ל-GSH רלוונטית מבחינה ביולוגית מכיוון שתחת רעב הידרה צריכה למצוא את הטרף שלה ברגישות גבוהה יותר. 
למרות שניתן לראות בבירור את תגובת ההזנה הנגרמת על ידי GSH במיקרוסקופ, השיטות המשמשות בדרך כלל למדידת תצפיות תגובת ההזנה אינן כמותיות. ברוב המקרים, הזמן שבו הפה של ההידרה נשאר פתוח נלקח כמדד לתגובת ההזנה8,9; ואילו במקרה אחר, הכימות התבסס על מספר ההידרה מתוך אוכלוסייה המציגה את תגובת ההזנה10. עם זאת, התבוננות בזמן פתיחת הפה של פוליפי ההידרה היא מסורבלת ונתונה לשינויים הנגרמת על ידי פרמטרים בלתי נשלטים כגון כיוון כיוון הפה במהלך תצפיות. באופן דומה, מכיוון שתגובת ההזנה היא פרמטר כמותי, גישות מבוססות אוכלוסייה נתונות לשינויים/שגיאות הנגרמות על ידי דעה או הטיה תצפיתית של הצופה הבודד. כדי לעקוף את הבעיות הללו פיתחנו שיטה לכימות יחסי של תגובת ההזנה בהידרה (Hydra vulgaris Ind-Pune11) המבוססת על המרחק של הקצה האפיקלי של הזרוע מהפה של פוליפ ההידרה.

<table><tbody><tr><td>חממה מקוררת</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>מיקרוסקופ MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה למיקרוסקופ</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>גלוטתיון מופחת</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס הביאו את הבקבוק לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה כדי למנוע חמצון</td></tr><tr><td>תוכנית עריכת תמונות</td><td>GIMP</td><td>גרסה 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

הידרה היא בין האורגניזמים הפרימיטיביים ביותר בעלי מערכת עצבים וכימותרפיה לזיהוי גלוטתיון מופחת (GSH) ללכידת הטרף. התנועה של אורגניזמים טרף גורמת לפריקה מכנית-חושית של התאים הצורבים הנקראים נמטוציסטים מהידרה, המוחדרים לטרף. תגובת ההזנה בהידרה, הכוללת סלסול של הזרועות כדי להביא את הטרף לכיוון הפה, פתיחת הפה וכתוצאה מכך בליעת הטרף, מופעלת על ידי GSH הקיים בנוזל המשתחרר מהטרף הפצוע. כדי להיות מסוגל לזהות את המנגנון המולקולרי של תגובת ההזנה בהידרה שאינו ידוע עד כה, יש צורך לקבוע בדיקה למדידת תגובת האכילה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לכימות תגובת ההזנה שבה נמדד המרחק בין הקצה האפיקלי של הזרוע לפה של ההידרה ונקבע היחס בין מרחק כזה לפני ואחרי הוספת GSH. היחס, הנקרא התפשטות הזרוע היחסית, נמצא כנותן מדד לתגובת האכלה. בדיקה זו אומתה באמצעות מודל רעב שבו הידרה מורעבת מראה תגובת הזנה משופרת בהשוואה להידרה המוזנת מדי יום.

גלוטתיון גורם מפלצת להציג סלסול של זרועות לכיוון הפה לצורך שוטף את הטרף. סלסול כזה של זרועות מביא קצות הפסגה של זרועות קרובה יותר לhypostome. התוצאה היא ההפחתה במרווח הזרוע, או את המרחק ליניארי בין סוף הפסגה של הזרוע וhypostome (איור 1). ההתפשטות היחסית הזרוע, או היחס של זרוע ממוצעת להתפשט לפני ואחרי הוספת גלוטתיון, בממוצע על פני פוליפים מרובים מפחיתה לאורך זמן. התפשטות הזרוע היחסית לאחר תוספת של המדיום חסר גלוטתיון, לעומת זאת, מפחיתה רק זמנית ומשיגה ערך יחידה בתו...

כאן אנו מתארים בדיקה פשוטה לכימות תגובת ההזנה בהידרה הנגרמת על ידי הצורה המופחתת של גלוטתיון. בדיקה זו מסתמכת על מדידת המרחק בין הקצה האפיקלי של הזרוע לפה של ההידרה.

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

בסרטון זה אנו מתארים שיטה למדידת התנהגות האכילה בהידרה. בתגובה לצורה מופחתת של גלוטתיון, הידרה ניזונה ממגוון בעלי חיים, נמטודות, סרטנים ודגים שזה עתה בקעו. בשכבה החיצונית של בעל חיים זה בעל שתי שכבות תאים, ישנם תאים מיוחדים הנקראים נמטוציסטים.לנמטוציסטים יש טריגרים, שכאשר הם מופעלים על ידי תנועת הטרף בנוזל שמסביב גורמים לפריקת חוטי המיתרים. החוטים הצורבים מוכנסים לטרף. הטרף הפצוע משחרר גלוקוז גלוט.ליונים הידרו יש תחושה כימותרפית לזיהוי הגלוטתיון בנוזל שמסביב. זה מעורר התנהגות האכלה המערבת את מערכת העצבים שלו. התנהגות האכילה בהידרה כוללת סלסול של הזרועות כדי להביא את הטרף לעבר פתיחת היפרסקופ של הפה ובליעת הטרף.למעשה, הוספת יון עודף בסביבה גורמת לתגובת ההזנה בהידרה, גם בהיעדר טרף. כדי להבין את יחסי הגומלין בין תחושת כימותרפיה ומערכת העצבים, עלינו לכמת את ההתנהגות וליצור מדדים מדויקים ומהימנים. בכמה דיווחים קודמים, הזמן שבו הפה נשאר הידרו פתוח נלקח כמדד לתגובת ההזנה, אך התבוננות במשך פתיחת הפה בהידרו פוליפים היא מייגעת ונתונה לשינויים הנגרמת על ידי פרמטרים בלתי נשלטים כגון כיוון הפה עקב תצפיות.שיטה נוספת לכימות ההתנהגות מבוססת על מספר ההידרה באוכלוסייה המציגה את תגובת האכילה. עם זאת, מכיוון שתגובת האכלה היא פרמטר כמותי אינדיבידואלי, הגישות המבוססות על אוכלוסייה הן וריאציות סובייקטיביות הנגרמות על ידי דעתו של הצופה הבודד. היתרונות העיקריים של השיטה האלטרנטיבית שאנו מתארים כאן הם שהיא קלה מאוד לביצוע וניתנת לשחזור מאוד.שמרו על הידרה בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס מתחת לאור של 12 שעות. מחזורי חושך של 12 שעות במדיום מכילים בקערת זכוכית ומאכילים אותם מדי יום עם אמיה למדידת תגובת האכילה. העבירו פוליפ הידרו בוגר אחד לבאר של צלחת 24 בארות, הסירו את המדיום השיורי מהבאר באמצעות ציר.זה מקל על ידי הטיית הצלחת, השליכו את המדיום העודף ואז הוסיפו מיד 500 מיקרוליטר של מדיום טרי הכנת תמיסת גלוטתיון. מכינים תמיסה של תשעה מיקרו-מולרים של גלוטתיון באמצעות מדיום הידרו. זכרו כי תמיסת גלוטתיון נוטה לחמצון, לכן השתמשו תמיד בתמיסת גלוטתיון טרייה.עבור כל ניסוי, העבירו את הלוח לפלטפורמת ההדמיה של מיקרוסקופ. לאחר מתן אפשרות להקלטת תמונה השתמש ברקע כהה כך שניתן יהיה לדמיין בבירור את התנהגות ההידרו פוליפ על הרקע המנוגד. וודא שהפוליפ ממוקם לאורך החלק המרכזי של הבאר שצולמה תמונה של הידרה במצב רגוע.זו תהיה תצפית נקודת זמן אפס. הוסף במהירות תשע תמיסות גלוטתיון מיקרו-מולריות, כדי להגיע לריכוז סופי של שלוש מיקרו-מולריות. הפעל את הטיימר מיד לאחר הוספת תמיסת גלוטתיון וצלם תמונות לאחר כל 15 או 30 שניות למשך ארבע עד חמש דקות מבלי לשנות את הגדרות ההגדלה.למדידות אנו משתמשים בגרסת gim שתיים, gim. תוכנית מניפולציה של תמונות גנו היא תוכנה הניתנת להורדה חופשית מהאינטרנט. פתח כל אחת מהתמונות שצולמו ב- gim.לתוכנית זו יש כלי מדידה זמין מכלי התפריט. ניתן למדוד את המרחק בין היפר, סטומה, קצה אפיקלי של כל אחד מהזרועות באמצעות כלי זה. מרחק זה נקרא התפשטות זרועות.חשב את התפשטות הזרוע הממוצעת עבור כל פוליפ לפני ואחרי גלוטתיון. חשב את היחס בין התפשטות זרועות ממוצעת בזמן אפס. הצביעו על כך בכל אחת מנקודות הזמן הבאות.הבה נקרא לזה התפשטות זרועות יחסית. בצע מדידות כאלה עבור לפחות 20 פוליפים לרעב. העבירו כמה פוליפים הידרו לקערת זכוכית נפרדת ואל תאכילו אותם במשך חמישה ימים.האכילו את פוליפי הביקורת מדי יום בארטיה ביום הניסוי. האכילו את קבוצת הביקורת של הידרה בארטיה עבור R אחד והשתמשו בהידרה זו לניסויים הבאים. מדוד את תגובת ההזנה של ההידרה המורעבת בהשוואה להידרה מקבוצת הביקורת בשיטה שתוארה קודם לכן בסרטון זה כדי למנוע כל הטיה עקב זמן של זמן לסירוגין, המדידות של כל אחד מהפוליפים ההידרו המורעבים והמבוקרים.גלוטתיון גורם להידרה להפגין סלסול של הזרועות לכיוון הפה. סלסול כזה מקרב את הקצוות האפיקליים של הזרועות לסערת ההיפו. התוצאה היא הפחתה במרחק הליניארי בין הקצוות האפיקליים של הזרוע לבין התפשטות היפר סערה או זרוע.הזרוע היחסית התפשטה לאחר הוספת מדיום. מחסור בגלוטתיון מפחית רק באופן חולף. הוא חוזר לאחד תוך כדקה.ידוע כי רעב גורם לשיפור התנהגות האכילה הנגרמת על ידי גלוטתיון. התפשטות הזרוע דקה לאחר הוספת גלוטתיון הייתה נמוכה משמעותית עבור קבוצת הצוות בהשוואה לקבוצה ששבעה מהם. כל בעלי החיים משתמשים בתחושת כימותרפיה לזיהוי מזון.הידרה משתמשת באות כימי בצורת גלוטתיון המשתחרר מהטרף הפצוע, בעלת מערכת עצבים פשוטה ללא מבנה דמוי מוח, כך שהמנגנון המולקולרי של תחושת הכימותרפיה והאפנון התלוי במצב ההזנה שלה עשויים להיות פשוטים גם הם. הבנת מנגנון זה עשויה לשפוך אור על האבולוציה של ויסות האכלה בבעלי חיים גבוהים יותר. עם זאת, לא הקולטן שיכול לקשור גלוטתיון ולא כל מרכיב אחר של מפל האיתות במורד הזרם לא דווח בהיידה עד היום.מעכבים פרמקולוגיים של מסלולי איתות חושיים כימותרפיים נפוצים ושימוש בטכניקות ביולוגיות מולקולריות מתקדמות לשינוי הביטוי של חלבוני איתות וקולטני גלוטתיון כאלה יכולים להתגלות ככלים רבי עוצמה להבנת המנגנון המולקולרי של הזנה. בהידרה, לעומת זאת, יש צורך במדד אמין של התנהגות האכלה משתנה כדי להבין את היקף השינויים שנגרמו על ידי חקירות ניסיוניות כאלה. כאן הצגנו שיטה שהיא לא רק אמינה, אלא גם קלה לביצוע וניתנת לשחזור רב.

measuring-glutathione-induced-feeding-response-in-hydra

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים שיטה להערכת ההשפעות הנוירוטוקסיות של ננו-חלקיקים באמצעות מיקרוגליה. הוא מתאר את השלבים להפעלת מיקרוגליה עם ננו-חלקיקים, סינון מדיה מותנית לבידוד ציטוקינים פרו-דלקתיים שמקורם במיקרוגליה, ובדיקת רעילות נוירונים היפותלמיים עם המדיה המותנית.

קביעת רעילות הנגרמת על ידי ננו-חלקיקים בתאי עצב באמצעות מיקרוגליה כביו-חיישן חלופי

מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.

גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

באמצעות טיפול כפול עם קולצ'יצין, רעלן הנגזרות מן הצמח הורג תאים מחולקים, הידרה ללא עצה הידראולית יכול להיות שנוצר. הידרה אלה לא יכולים להאכיל או egest בעצמם. מאמר זה מתאר שיטה משופרת עבור תחזוקה לטווח ארוך של העצב חינם הידרה vulgaris במעבדה.

דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא<em&gt; הידרה</em

מבחני צריכת המזון כמותיים באוכל צבוע לספק חזקים, תפוקה גבוהה אומר להעריך את המוטיבציה האכלה. שילוב וזמינותו צריכת מזון עם thermogenetic ו optogenetic המסכים היא גישה רב-עוצמה כדי לחקור את המעגלים העצביים שבבסיס התיאבון למבוגרים melanogaster דרוזופילה.

שילוב של צריכת המזון כמותיים מבחני והפעלת בכפייה נוירונים ללמוד תיאבון בשנת דרוזופילה

כתב יד זה מתאר את השימוש fluorogenic מקודד גנטית כתבים ביישום של הדמיה לחיות תאים עבור הבחינה של xenobiotic-induced סטרס חמצוני. זו גישה נסיונית מציע רזולוציית ייתכן ללא תחרות, רגישות וספציפיות תוך הימנעות רבים את חסרונותיה של שיטות קונבנציונליות המשמש את הגילוי של רעילות סטרס חמצוני.

הדמיה גישות הערכות של רעילות לחץ חימצוני באמצעות חיישנים Fluorogenic מקודד גנטית

מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.

גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

להלן פרוטוקול המאפשר כימות צבעוני של כמות המזון הנאכל בתוך פרק זמן מוגדר על ידי זחלי מלנוגאסטר דרוזופילה שנחשפו לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. מבחנים אלה מתבצעים בהקשר של מסך תרמוגנטי עצבי.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

כימות של צורות מחומצנות ומופחתות של גלוטתיון (GSSG ו-GSH, בהתאמה) הושג באמצעות שימוש באורתו-פתאלדהיד (OPA). OPA הופך להיות פלואורסצנטי מאוד ברגע שהוא מצומד ל-GSH אך אינו מסוגל להצמיד GSSG עד שהוא מופחת. כאן, אנו מתארים בדיקה רב-פרמטרית לכימות שניהם באמצעות כימות חלבונים לנורמליזציה.

כימות מהיר של צורות מחומצנות ומופחתות של גלוטתיון באמצעות אורתו-פתאלדהיד בתאי יונקים בתרבית במבחנה

פרוטוקול זה מתאר בדיקה לכימות קצב ההזנה של Caenorhabditis elegans בהתבסס על מדידת פינוי החיידקים בתרבית נוזלית.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

באמצעות הדמיית טיימ-לפס, ניתן לעקוב אחר תהליך ההתחדשות המלא של ספרואידים של הידרה . פרוטוקול זה מתאר את יצירת ספרואידים של הידרה , דן במגוון אסטרטגיות התקנה, ומפרט כיצד לבצע הדמיה חיה ארוכת טווח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב וכן מיקרוסקופיית פלואורסצנציה של יריעת אור.

הכנה והדמיה חיה של ספרואידים מתחדשים של הידרה

למד שיטה פשוטה ואמינה למדידת תגובת האכלה בהידרה בתגובה לגלוטתיון מופחת. השיטה מודדת את המרחק בין קצה המשושה לפה ומאפשרת חקר מנגנוני חישה כימית ומערכת העצבים הפשוטה של היצור.

מדידת תגובת האכלה מושרה גלוטתיון בהידרה

גלה סרטונים נוספים