טכניקה חדשה לניתוח כמותי של נשירת שיער בעכברים באמצעות ניתוח גווני אפור
9 במרץ 2015
התקרחות היא צורה נפוצה של נשירת שיער שיכולה להתרחש במצבים רבים ושונים, כולל כתופעת לוואי של כימותרפיה. פיתחנו שיטה לכימות נשירת שיער בעכברים, תוך שימוש בהדמיית ג'ל סטנדרטית לביצוע ניתוח גווני אפור, כדי להקל על מחקר של טיפולים חדשים ומבטיחים להתקרחות.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק כימות של צפיפות השיער באמצעות ספיגת אור. זה מושג על ידי צילום ראשוני של בעלי חיים על הדמיית ג'ל. השלבים הבאים הם הגדרת אזור עניין בתצלום וקביעת ספיגת האור באזור העניין.
ואז משווים את ספיגת האור לתקן צילום. בסופו של דבר, ניתן לחשב ממוצע של ספיגת אור בין בעלי חיים שטופלו באופן דומה כדי להראות את ההשפעות של התערבות על צמיחת שיער. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא בלתי מוטה, ניתנת לכימות וניתנת לשחזור.
זה חשוב ביותר מכיוון שהוא מאפשר לך להשתמש בסטנדרטים, טכניקות סטטיסטיות כמו Inova כדי לקבוע את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות. עבור פרוטוקול זה, השתמש בהדמיית ג'ל עם מקור אור מובנה לצילום רפלקטיבי. זה מבטיח אחידות אור טובה, בעוד שתאורת טרנס יוצרת צללית שאינה מתאימה לניתוח.
התחל בהכנת הדמיית הג'ל, הגדר את המיקוד ואת שדה הראייה. באמצעות טקסט מודפס כלשהו, העכבר יכול להיות מעט לא ממוקד מכיוון שזה באמת עובד. כדי להפחית שגיאות קוונטיות באזורי עניין קטנים, ודא את אחידות מקור האור על פני האזור המצולם במטרה לממוצע אופטי מצוין באזור העניין.
לאחר מכן, הכינו את החיה. בחר חומר הרדמה עם התחלה מהירה ומשך פעולה קצר וספק בדיוק מספיק כדי לשמור על בעלי החיים דוממים לצילום. כעת הניחו את החיות על ההדמיה בצורה אנכית וקרוב ככל האפשר למקביל.
לצילומי גב, הניחו את בעלי החיים במצב שכיבה עם גפיים מושטות. עבור צילומי גחון, הנח את החיות במצב שכיבה. ודא שהם לא מסובבים לרוחב.
ניתן למשוך ערכי ספיגה בין תמונות, אך לא לשם כך תוכננה המכונה. אז הוספת תקן בקנה מידה אפור מאפשרת לנו לנרמל את ערכי הספיגה בעת איסוף הנתונים. כעת מקם את תקן הגווני האפור באזור המצולם.
לאחר מכן סגור את החדר והפחת את תאורת הסביבה שעלולה להיכנס לתא במצלמה. הגדר את נקודת העצירה F לחשיפה שגורמת לאזור העניין לא להיות רווי יתר על המידה או לא חשוף יתר על המידה. לאחר מכן צלם.
אם נקודת העצירה F נבחרת כך שהתמונה רוויה, ערך הסולם האפור יתקבע בערך ו-B ללא שימוש כלל. לאחר מכן שנה את ה-F.Stop באחד, תוך שמירה על אזור העניין והסטנדרט בטווח חשיפה ליניארי, וצלם תמונה שנייה עם השלמת הצילום. הניחו את בעלי החיים על שולחן חימום ועקבו אחריהם עד שהם מתאוששים.
שכיבת עצם החזה. לאחר מכן החזירו את בעלי החיים לכלובים שלהם ובסופו של דבר לוויווריום להחלמה מלאה. כדי לכמת את ספיגת האור באמצעות תוכנת הדמיית הג'ל, סמן את אזורי העניין בתמונות של בעלי החיים למבט גבי של בעל חיים שלם.
השתמש בתמונה מלבנית, בתמונה אליפסה או בכלי יד חופשית כדי לשרטט רווח מהגפיים העליונות לגפיים התחתונות, הנמשך לרוחב ככל האפשר. שמור בשולי החלק האחורי של החיה למבט גחוני של בעל חיים שלם. השתמש בשני מלבנים.
אחד לכיסוי אזור האגן, המטופח, ואחד לכיסוי אזור החזה, שאינו מטופח. ניתן לסמן גם אזורי עניין קטנים יותר כמו היכן ניתנה תרופה כנדרש. שנית, סמן את אזור העניין בתקן הקליטה בקנה מידה אפור.
לאחר מכן רשום את הספיגה מכל אזור עניין מסומן להשוואה בין תצלומים. לנרמל את רמות הספיגה לתקן הרקע באמצעות קשר לוג של חשיפה לספיגה. לשם כך, שרטט עקומה של יומן החשיפה כנגד יומן הקליטה.
השתמש בערכים המתקבלים מתקן הקליטה בקנה מידה אפור, ולאחר מכן התאם לשינויים בתקן של כל תצלום כדלקמן. ראשית, בחר את ה-F-stop לקריאת ה-ROI ואת ה-F-stop עבור הייחוס וחשב את הספיגה הממוצעת של התקן בכל התמונות בקריאת F-stop. ממוצע זה הוא ערך תקן הייחוס או ה-RSV.
לאחר מכן, חשב את ההבדל בספיגה בין הגדרות הקריאה והייחוס F-Stop בכל תצלום ובצע את אותם חישובים עבור התקן ועבור כל החזר ROI מוגדר. כעת באמצעות נתונים מסטופ F אחד, חשב את הספיגה המתוקנת עבור כל החזר ROI באמצעות הנוסחה המוצגת. לאחר מכן, יש ליישם שיטות סטטיסטיות סטנדרטיות לניתוח הנתונים של עכברים מושתלים C3 HHEJ, אשר מודלים התקרחות ADA נותחו בשיטה המתוארת בחשיפות שונות.
השינויים בהחזר ההשקעה הלא חופף היו בקורלציה הדוקה כצפוי. השוואות דומות הניבו את אותו מתאם הדוק על פני תקופה של שלושה שבועות. העכברים צולמו כדי לכמת את נשירת השיער הצפויה שלהם.
80% מהעכברים שצולמו הראו נשירת שיער בפרק זמן זה. לשם השוואה, שישה עכברים שחורים רגילים C 57 לא הראו נשירת שיער באותה מסגרת זמן. במחקר שני, התקרחות הנגרמת על ידי כימותרפיה כומתה באמצעות הטכניקה המתוארת.
עכברים טופלו בציקלופוספאמיד במשך שלושה שבועות ולאחר חודשיים הם הראו נשירת שיער משמעותית בהשוואה לביקורת. לאחר השליטה, ניתן לנתח כל תמונה בפחות מחמש דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת את כמות צמיחת השיער במכרסמים באמצעות מערכת הדמיית ג'ל סטנדרטית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
אלופציה (הקרחה) היא צורה נפוצה של איבוד שיער שיכולה להתרחש עקב מצבים שונים, כולל כימותרפיה. מחקר זה מציג שיטה לכימות איבוד שיער בעכברים באמצעות מדמיינ ג'ל (gel imager) לניתוח גווני אפור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מחקר על נשירת שיער
רקע
- אלופציה (התקרחות) עשויה לנבוע מגורמים מרובים, כולל טיפולים רפואיים.
- כימות של נשירת שיער הוא חיוני להערכת טיפולים חדשים.
- טכניקות דימות סטנדרטיות יכולות לשפר את דיוק המחקר.
- שיטה זו שואפת לספק גישה הניתנת לשחזור למדידת צפיפות השיער.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לכימות צפיפות שיער בעכברים.
- סיוע במחקר של טיפולים חדשים להמראות (alopecia).
- שימוש בבליעת אור לצורך מדידה מדויקת.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- צילום בעלי חיים באמצעות מדמיית ג'ל.
- הגדרת אזור עניין בתצלומים.
- מדידת בליעה של אור בתוך האזור שהוגדר.
- השוואת בליעת האור לסטנדרט צילומי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מספקת תוצאות בלתי מוטות וכמותיות.
- ניתן לחשב ממוצע של בליעת האור עבור בעלי חיים שעברו טיפול דומה.
- הטכניקה היא הדירה להשגת תוצאות עקביות.
- היא מראה ביעילות את השפעות ההתערבויות על צמיחת שיער.
מסקנות
- השיטה שפותחה מהווה כלי בעל ערך למחקר בתחום האלופציה (התקרחות).
- היא משפרת את היכולת להעריך טיפולים חדשים.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על טכניקת כימות זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של איבוד שיער במודלים פרה-קליניים היא קריטית להערכת התערבויות טיפוליות במחקר על אלופציה. טכניקה זו מספקת שיטה אובייקטיבית וניתנת לשחזור למדידת צפיפות השיער באמצעות ניתוח גווני אפור, ובכך מאפשרת תיקוף של מטרות מבוסס נתונים והפחתת סיכונים מכניסטיים במסלולים פרה-קליניים. באמצעות סטנדרטיזציה של כימות איבוד השיער, היא תומכת בביטחון ניבוי בשלבי הגילוי המוקדמים ומשפרת את קבלת החלטות ה-go/no-go עבור תוכניות המכוונות לטיפול באלופציה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות אספקת מדדים כמותיים של איבוד שיער במודלים גנטיים ומודלים מושריים של אלופציה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה אובייקטיבית וסטנדרטית של השפעות ההתערבות על צמיחת השיער.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח באמצעות יצירת נתונים בני השוואה וניתחים סטטיסטית עבור טיפולים בתרכובות שונות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה בהמשך, באמצעות קביעת ערכי בסיס וערכי בליעה של שיער שעבר טיפול.
- שחזוריות: הבטחת סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות נורמליזציה לסטנדרט גווני אפור והגדרה עקבית של אזור העניין (ROI).
- יכולת הרחבה: מאפשרת הערכה אמינה של תרכובות באמצעות ניתוח תמונות מהיר (פחות מ-5 דקות לתמונה) באמצעות מכשירים נפוצים לדימוי ג'ל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה אלופציה מושרית כימותרפיה, אלופציה אראטה (Alopecia areata) והסרת שיער מכנית, ובכך תומך ביישור ביו-מרקרים תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: מקשר בין כימות איבוד שיער בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות מעקב אlongitudinal עקבי.
- קידום מותאם סיכון: מספק בסיס להחלטות על קידום השלב הטיפולי על ידי קורלציה בין שינויים בצפיפות השיער לבין יעילות טיפולית במודלים של אלופציה.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתחים סטטיסטית על איבוד שיער.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי מדידת בליעת אור כמדד לצפיפות השיער בבעלי חיים שעברו טיפול לעומת קבוצת ביקורת.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה ותוצרי כמות באמצעות ערכי בליעה מנורמלים המאפשרים השוואות בין בעלי חיים ובין קבוצות.
- אנליזה: מייצר מדידות התואמות לשיטות סטטיסטיות סטנדרטיות (ANOVA, T-test) להערכת המובהקות של השפעות ההתערבות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי כך שמאפשר מעקב ארוכי טווח אחר איבוד שיער וצמיחה מחודשת במודלים של עכברים הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת הניתנת לשימוש חוזר במגוון מודלים של אלפציה (הקרחה), בשל ההסתמכות על ציוד סטנדרטי לדימוי ג'ל וצורך מינימלי בהכשרה מיוחדת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באפיון הפנוטיפ של מודלי אלופציה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות נורמליזציה של גווני אפור ופרוטוקולים מוגדרים לאזורי עניין (region-of-interest).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לקבלת החלטות מוקדמות המבוססות על נתונים לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) של טיפולים לאלופציה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות אספקת מדדי יעילות כמותיים וניתנים להשוואה על פני אטיולוגיות שונות של אלופציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בבעלי חיים, רכישת תמונות וניתוח תמונות בסיסי באמצעות תוכנה לדימות ג'לים.
- תלוי בגישה למכשיר דימות ג'לים בעל יכולת תאורה מחזירה וכלים לסטנדרטיזציה של סקאלת גווני אפור.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרת אזורי העניין (ROI) והגדרות חשיפה כדי להבטיח תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על זני עכברים שונים, צבעי פרווה או שיטות שונות להשראת אלופציה.
- מוגבל למדידות יחסיות של צפיפות השערה; אינו מספק פרטים היסטולוגיים או מולקולריים על מצב זקיקי השערה.
