Name: טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן ( Linum usitatissimum) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למדו שיטת טרנספורמציה פרחונית-דיפ בפשתן (Linum usitatissimum) באמצעות Agrobacterium ליצירת צאצאים טרנסגניים. שיטה זו פשוטה, יעילה ומציעה שיעור שינוי גבוה יותר משיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי קרן אוגלביי.

<ol><li>Bent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+floral+dip+transformation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana floral dip transformation method.</a> Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).</li>
<li>Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication+assisted+Agrobacterium-mediated+transformation+enhances+the+transformation+efficiency+in+flax+%28Linum+usitatissimum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss+Organ+Cult%22%5BJournal%5D)">Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.).</a> Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).</li>
<li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+environment%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment.</a> New Phytol. 167, 171-180 (2005).</li>
<li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral+dip%3A+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).</li>
<li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Control+of+Rapid+Genomic+Changes+in+Flax%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Bot%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax.</a> Ann Bot. 95, 201-206 (2005).</li>
<li>Dong, J. Z., McHughen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+production+of+transgenic+flax+plants+using+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Sci. 88, 61-71 (1993).</li>
<li>Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+preparing+Agrobacterium+cells+that+simplifies+the+Arabidopsis+transformation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol.</a> Plant Methods. 2 (16), (2006).</li>
<li>Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floral-dip+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+to+examine+pTSO2%3A%3A%CE%B2-glucuronidase+reporter+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::β-glucuronidase reporter gene expression.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -P., Pretova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+Agrobacterium-mediated+gene+transfer+to+flax%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax.</a> Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).</li>
<li>Mu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+maize+female+inflorescence+following+floral+dip+method+mediated+by+agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium.</a> Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).</li>
<li>Trieu, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Medicago+truncatula+via+infiltration+of+seedlings+or+flowering+plants+with+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium.</a> Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).</li>
<li>Yasmeen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Planta+transformation+of+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">In Planta transformation of tomato.</a> Plant Mol Biol Rep. 27, 20-28 (2009).</li>
<li>Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stable+transformation+of+wheat+by+floral+dip+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens.</a> Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).</li>
<li>Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+flax+plants+transformed+by+Agrobacterium+rhizogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes.</a> Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בחלק ממיני צמחים, כגון פשתן (usitatissimum Linum), שינוי מפעל מוצלח היה מוגבל. בעבר, שינוי בפשתן דרש זיהום Agrobacterium ידי פצע ושיתוף טיפוח, יישום חלקיקי biolistic או באמצעות sonication אולטרסאונד, ואחריו התחדשות; תהליך שהוא גם ארוך ונוטה להיות מלווה באירועי מוטאציות רבים. יתר על כן, תהליך הבחירה של טכניקות אלה מחייב השימוש בסמנים לבחירת אנטיביוטיקה כגון kanamycin. עם זאת, זה כבר ציין בספרות כי שיטה זו של בחירה מייצרת הרבה תוצאות חיוביות שגויות, כפשתן נוטה לברוח ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה 6,9,14. חסרון נוסף של הטכניקות הקודמות בשינוי פשתן היה שיעורי שינוי הנמוכים 2,6. בפרוטוקול המתואר כאן, שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחונית-טבילה הוצגלהביא לשיעור שינוי גבוה לפשתן (50 - 60%). Transformants התקבל מפרחים טבלו ונאספו מענפים ראשיים וצד. בחירה של transformants החיובי פשוט על ידי גידול צמחי T1 על אדמה והקרנת העלים שלהם זמן קצר לאחר שהם נבטו, השימוש באנטיביוטיקת הבחירה עובר-ידי, צעד ששמש בעבר כנורמה בפרחוני לטבול למיני צמחים אחרים. על ידי ביצוע בדיקות PCR ישירות של עלים, ותוך שימוש בפריימרים T-DNA המתאימים, transformants החיובי ניתן לבחור במהירות. טכניקה זו היא פשוטה, זולה וקלה לביצוע, אך תוצאות בשיעור שינוי גבוה בהרבה מאלה שדווחו בעבר לארבידופסיס ומיני צמחים אחרים בשיטה זו 1,10,12. כמו כן, שיעור השינוי המדווח הגבוה ביותר לפשתן. עם זאת, ישנם צעדים קריטיים בהליכים, לרבות הבחירה של שלב הפרח הטוב ביותר ואת ריכוז החומרים פעילי השטח הטוב ביותר, כך שAgrobacterium יכולה לחדור לתוך תאי הצמח בלי להרוג את איברי הפרח. אם שלב מוקדם ניצן משמש (איור 2 א) עם Silwet-77 ריכוז גבוה של יותר מ 0.05%, הפרח לא יתפתח ולא להגדיר זרעים. אם שלב מאוחר ניצן משמש (איור 2 ג), אם כי ייתכן שהשינוי יעבוד, זה יתרחש בקצב נמוך בהרבה. תוצאות דומות התקבלו עם שינוי לטבול פרחוני ארבידופסיס 1,4. לפרוטוקול זה, את כל השלבים פרחוניים נבדקו עם Silwet-77 ריכוזים שונים והבמה הטובה ביותר הייתה נחושה להיות שלב ניצן האמצע (איור 2 ג) עם Silwet-77 על 0.05% לטבילה הראשונה, ואחריו טבילה שנייה ב שלב הניצן המאוחר (איור 2 ג) עם ריכוז Silwet-77 מעט מופחת של 0.03%. השינוי גם עבד היטב באמצעות שלב הניצן המוקדם (איור 2 א) עם silwet-77 ריכוז נמוך של 0.003%, ואחריוטבילה שנייה עם שלב ניצן אמצע (איור 2) בSilwet-77 ריכוז גבוה יותר של 0.05%. בפרוטוקול זה, כמה פרמטרים אחרים ניסו לייעל את שיעור השינוי, אבל מצאו שאין לו השפעה על התוצאה הסופית. דוגמאות כוללות הארכת הזמן לאחר הטבילה שהצמחים שכבו על הצד שלהם ומכוסים בפלסטיק מיום אחד ליומיים; באמצעות OD של יותר מ 1 לתרבות Agrobacterium, במקום 0.5-1; להגדיל את זמן טבילה - 5, 15 דקות במקום 1-2 דקות. שוב אנחנו לא שמתנו לב כל השפעה על שיעור השינוי באמצעות אסטרטגיות אלה. הגורמים היעילים ביותר, עם זאת, נמצאו כי שימוש בצמחים בריאים בשלבי הפרח הנכונים, ובאמצעות ריכוז Silwet-77 הטוב ביותר. שם לב ששני מרווחי טבילה, עובד איכשהו זמן טוב יותר מאשר אחד, אף על פי שטבילת פעם אחת גם עובדת. שינוי לפרוטוקול זה יכול להיות מושגת על ידי reducin<html> g ריכוז Silwet-77 לקטנים כמו 0.003% בטבילה השנייה או שלישית. מאז Silwet-77 הוא רעילים, תוצאות ריכוז גבוהות מדי בפרחים מתפתחות בצורה גרועה, וכתוצאה מכך אין תשואת זרע. תדירות הטבילה יכולה להיות מופחתת לאחד, עם האירועים שני או שלישיים בוטלו אם הצמחים לא מחפשים בריאים והניצנים אינם מתפתחים היטב. מגבלה העיקרית של שיטה זו היא המספר הנמוך של פרחים המיוצרים על ידי הפשתן, המספר המצומצם של זרעים המתקבלים מכל פרח, ומחזור החיים הארוך של פשתן. זה לוקח 6-8 שבועות מזריעת זרע יש ניצנים הראשוניים מוכנים לטבילה הראשונה ו8 נוספים - לאחר טבילה-10 שבועות כדי להגיע לדור T1. בסך הכל, טווח של 5 - יש צורך 6 חודשים כדי לקבל את דור T1. שלא כמו מיני צמחים אחרים, שפרח בכל עת של השנה, איזה פרח זני פשתן טוב יותר בזמנים מסוימים בשנה. תכנון כל כך מתחשב לטכניקה זו הוא חשוב. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; לסיכום, התוצאות שלנו לטבול פרחוני עם שני סוגי פשתן שונים: פשתן הסיבים, סטורמונט Cirrus (פלסטיק מגיב ו), ופשתן השמן, בתון (היציב ושאינו מגיב), מראים כי Agrobacterium - שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול הוא שיטה ישימה ויעילה לשינוי פשתן והוא יכול לשמש כדי להחליף את הטכניקות ששמשו בעבר לשינוי פשתן. השינויים בשיטה הפרחוני לטבול בפרוטוקול זה יהיו ישימים לשימוש עם כל מיני צמחים אחרים ואינו מוגבל לפשתן.

פשתן (usitatissimum Linum) הוא יבול חשוב גדל באופן נרחב לסיבים ושמניה. הפיכתו של הגנום הפשתן אפשרית עם טכניקות כגון פציעה, זיהום Agrobacterium, ושיתוף טיפוח בתרבית רקמה, יישום חלקיקי biolistic או sonication אולטרסאונד ואחריו התחדשות. עם זאת, יש טכניקות אלה חסרונות רבים, כולל נטייה לאירועי מוטאציות רבות וזמן ממושך כדי להשיג את הקווים מהונדסים. חלק משיטות אלה יכולים להיות גם יקר ודורש מניפולציה מיומנת ויעילה של המכשירים, וכתוצאה מכך שתילי התאוששות נמוכים. והכי חשוב, טכניקה אלה לעתים קרובות מובילה לשיעורי שינוי נמוכים 2,6. שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחוני לטבול הוא גישה פשוטה ויעילה ליצירת צמחים מהונדסים. כבר זה באופן שיגרתי ומשמש בהצלחה למיני צמחים רבים כגון ארבידופסיס thalian1,4, truncatula Medicago 11, עגבניות 12, חיטה ותירס 13 10. עם זאת, זה לא היה נחשב כטכניקה מעשית עבור שינוי פשתן בשל מספר גורמים, כגון מספרים הנמוכים של פרחים המיוצרים על ידי פשתן, מספר מצומצם של זרעים המתקבלים מכל פרח, גודל הזרע הגדול, והמעייל העבה, אשר יכול גם להיות בעייתי עבור תהליך שינוי גנטי כזה. בנוסף, מגזר הבחירה של הטכניקה הפרחונית לטבול דורש נובט זרעים הפכו בתקשורת צמח המכילה אנטיביוטיקה, עם progenies הפך מכובד המבוסס על היכולת שלהם לנבוט ולהישאר ירוקים, בעוד שאינו הופך progenies גם לא לנבוט או לנבוט אבל אקונומיקה במהירות ולמות. בספרות הנוכחית, זה כבר ציין כי פשתן wild-type נוטה לברוח ריכוז גבוה של בחירות אנטיביוטיקה, לייצר תוצאות חיוביות שגויות, ומה שהופך את הבחירה של progenies T1 מבוססעל עמידות לאנטיביוטיקה קשה 6,14 יותר. כמו כן, כאשר ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה נוסף לבחירה בינונית, שיעור השינוי שנצפה ירידה דרמטית 9. בפרוטוקול זה, השתמשנו Agrobacterium והשיטה הפרחונית לטבול להפוך קו של פשתן סיבים, נוצה סטורמונט (תגובה ופלסטיק), אשר הוכח להגיב ללחצים בסביבה על ידי שינוי הגנום שלו 3.5. כדי להתגבר על הבעיה בריחת האנטיביוטיקה, בחרנו לעשות בדיקות PCR ישירות של DNA מעלי T1, במקום בחירה על ידי הוספת האנטיביוטיקה לתקשורת הצמח. אנחנו ניצלנו את האנטומיה הפשוטה של ​​פשתן כדי לעקוב אחר פרחים ספציפיים בעת הטיפול. מערכת מעקב זה אפשרה בחירה של זרעים מפרחים מסוימים ונביטה על אדמה מבלי להוסיף אנטיביוטיקה. transformants החיובי פשוט זוהו על ידי בדיקות DNA המתקבל מעלים באמצעות o השיטה מהירה והיעילהPCR הישיר f. התוצאות שלנו מראות כי השיטה הפרחונית לטבול עבדה טוב מאוד בקו הזה של פשתן והביאה באופן מפתיע בשיעור גבוה מאוד שינוי (50 - 60%), גבוה מאלו שנצפו בעבר עבור thaliana ארבידופסיס, אשר דווח להיות 0.1-1 1%, וגבוהים גם ממיני צמחים אחרים 10,12. גם בדקנו מגוון נוסף של פשתה (פשתן שמן), בתון (יציב ושאינם מגיב), ונתונים הראשוניים שלנו מצביעים על כך שפרחים לטבול פועל גם עבור מגוון זה של פשתן. המטרה של פרוטוקול זה היא להראות שAgrobacterium ופרחונית לטבול יכולים לשמש כדי ליצור פשתן מהונדס. אנו מראים כי טכניקה זו היא פשוטה, זולה, ומהירה יותר מאשר שיטות אחרות של שינוי פשתן. יותר חשוב זה תוצאות בשיעור שינוי גבוה בהרבה מהשיטות האחרות של שינוי פשתן 2,6. האנטומיה של thaliana ארבידופסיס, שיש לו סניפים ופרחים רבים, maKES זה קשה להבחין טבל ולא טבל פרחים על אותו הצמח. לכן, מספר גדול של זרעים, כ -20,000 זרעים לכל צמח, צריכים להיות מוקרנים לזהות transformants החיובי 8. פשתן, לעומת זאת, יש פחות סניפים (סניף אחד עיקרי ומעט תופעות סניפים) ופחות פרחים, הפקה כ -100 זרעים לצמחים, המאפשרים לעקוב אחר פרחים בודדים וכדי לבחור זרעים מסוימים במהלך הקרנת תהליך. אנו מציעים כי פרחוניים לטבול הוא שיטה ישימה כדי להפוך כל מינים קרובים של פשתן, סוג של כ -200 מינים. שיטה זו נותנת שיעור שינוי גבוה בהרבה מאשר שיטות אחרות של שינוי פשתן. כמו כן, אנו מציעים שהקרנת PCR הישירה של T1 עלה DNA היא דרך יעילה כדי להתגבר על הבעיה של בריחת עמידות לאנטיביוטיקה, כי לעתים קרובות מייצרת הרבה תוצאות חיוביות שגויות. הקרנת PCR ישירה יכולה להיות מיושמת על כל מיני צמחים אחרים ואינה מוגבלת to פשתן. טכניקת מעקב זרע הפשוטה המועסקות בפרוטוקול זה יכול להיות מיושמת על כל מיני צמחים אחרים עם הסתעפות האנטומיה דומה לפשתן.

<table><tbody><tr><td>זרעי פשתן מזן Stormont Cirrus המקורי (PL)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>5 אינץ' עציצים</td> אדמת עציצים <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממה עם הגדרת</td><td></td><td></td><td></td>אור מתאימה</tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> אלקטרופרזיס ג'ל Thermocycler <td></td><td></td><td></td></tr> Agarose <tr><td>הגדרת הדמיה דיגיטלית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet-77</td><td>LEHLE SEEDS</td><td>VIS-01</td><td>רעיל, ללבוש כפפות</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>Part# 9PIM712</td><td></td></tr><tr><td>Terra PCR Direct Polymerase Mix</td><td>Clontech</td><td>639270</td><td></td></tr><tr><td>וקטור בינארי PRI 909</td><td>Takara</td><td>3260</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td><td>Takara</td><td>9115</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA ערכת שיבוט</td><td>Invitrogen</td><td>K4595-01</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורטור וקובטות</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2092</td><td></td></tr><tr><td>שייקר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספינר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניילון נצמד ונייר אלומיניום לעטוף</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מהירותSTAR DNA פולימראז</td><td>Takara</td><td>RR070A/B</td><td></td></tr><tr><td>QlAQuick ערכת מיצוי ג'ל Qiagen</td><td></td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני פלסמיד QIAGEN</td><td>Qiagen</td><td>12123</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF אנזים</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>SacI-HF אנזים</td><td>NEB</td><td>R3156S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ערכת קשירת DNA</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog</td><td>סיגמא</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A360-500</td><td></td></tr></tbody></table>

טרנספורמציה הפרחוני-dip של פשתן ( linum usitatissimum) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

שינוי צמח בתיווך Agrobacterium באמצעות פרחוני לטבול הוא טכניקה המשמשת באופן נרחב בתחום של שינוי צמח וכבר דווח כמוצלח עבור מיני צמחים רבים. עם זאת, פשתן שינוי (Linum usitatissimum) על ידי פרחוני לטבול כבר דווח. לא המטרה של פרוטוקול זה היא להקים Agrobacterium ושהשיטה הפרחונית לטבול יכולה לשמש כדי ליצור פשתן מהונדס. אנו מראים כי טכניקה זו היא פשוטה, זולה, יעילה, ויותר מכך, נותנת שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות של שינוי פשתן. לסיכום, תפרחות של פשתן היו טבולות בתמיסה של Agrobacterium ביצוע פלסמיד ינארי וקטור (בר T-DNA בתוספת רצף הכנסת Linum, LIS-1) 1 - 2 דקות. הצמחים הונחו שטוחים בצד שלהם למשך 24 שעות. לאחר מכן, צמחים נשמרו בתנאי גידול נורמלים עד הטיפול הבא. לעיבודים של טבילה חזר על עצמו 2-3 פעמים, עם כ 10 - מרווחי יום 14 בין הטבילה. זרעי T1 נאספו ומונבטים על אדמה. לאחר כשבועיים, progenies טופל נבדקו על ידי PCR הישיר; 2-3 עלים שמשו לכל צמח בתוספת פריימרים T-DNA המתאימים. transformants החיובי נבחרו וגדל לפדיון. שיעור השינוי היה באופן בלתי צפוי גבוה, עם 50 - 60% מהזרעים מצמחים שטופלו להיות transformants החיובי. זהו שיעור שינוי גבוה יותר מאלו שדווחו לthaliana ארבידופסיס ומיני צמחים אחרים, באמצעות שינוי פרחוני לטבול. זה גם הגבוה ביותר, אשר כבר דיווח עד כה, לשינוי פשתן בשיטות אחרות לשינוי.

איור 1 - 4 להמחיש כמה הצעדים בתוך הפרוטוקול. באיורים 1 ו -2, העלים סביב ניצני התפרחת נחתכים לחשוף אותם לתאי Agrobacterium והשלבים השונים הניצן ששמשו לפיתוח הפרוטוקול. איור 3 מציג את התהליך של פרחים לטבול פשתן. איור 4, תערוכות דוגמא לאופן שיכול להיות מתויגים הענפים העיקריים ולוואי וכיצד פרט פרחים יכול להיות במעקב ומזוהה. איור 5 מראה כיצד ניתן מונבטים progenies T1 בתקשורת צמח MS ולאחר מכן הושתל בקרקע לבגרות. איור 6 מדגים כיצד רושף פשתן סוג יכול לברוח ריכוזים גבוהים של kanamycin, המאשר ממצאים קודמים בספרות 6,9,14. איור 7 מראה דוגמא של ההגברה PCR ישירה מtransformants T1 החיובי. פרחי T1 נאספו ממ ' יורה עין והצד השני של מפעל T0 יחיד. כפי שניתן לראות מPCR הישיר, 8/12 צמחי T1 נבדקו חיוביים על ידי PCR והעצימו אזורים השונים ברחבי T-DNA. פריימרים שלנו גם נועדו בין LIS-1 הכנס ומספר אתרי שיבוט (איור 7 ו- C). אנחנו השתמשנו פריימרים נוספים מהווקטור בינארי הצמח כדי להגביר מגזרים שונים של T-DNA, כגון הגבול השמאלי ושליחות קטלנית NOS (מידע לא מוצג) או גבול הימני ואתר מרובה שיבוט (איור 7D). פריימרים ספציפיים להוספת LIS-1 גם בשימוש בפרוטוקול זה (מידע לא מוצג). רשימה של פריימרים מסופקת בטבלה 1. עם זאת, הרצפים של פריימרים אלה תלויים ברצף של הווקטור בינארי צמח T-DNA ולהוסיף המשמש את הפרחים לטבול. אנחנו גם ציינו כי לא היה הבדל משמעותי בשיעור השינוי בין הפרחים שנאספו מהענפים הראשיים וצד. p-together.within-page = "תמיד"&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg"> איור 1. חיתוך העלים סביב ניצני התפרחת העיקריים לחשוף אותם לתאי Agrobacterim. () הניצנים מכוסים על ידי עלים. עלים (ב) קוצצו סביב הניצנים לחשוף אותם. (ג) מוגדל תמונה ממפעל ב (א) לאחר החיתוך לחשוף ניצנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg"> איור 2. שלבי הניצן השונים ששמשו בפרוטוקול זה כדי לקבוע את השלב הטוב ביותר לשימוש עבור לטבול הפרחוני. () ניצן השלב מוקדם הוא approxima tely 2 מ"מ. ניצן שלב ביניים (B) הוא כ 5 מ"מ. (C) ניצן השלב המאוחר הוא כ כ 1 סנטימטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg"> איור 3. התהליך של פרחים-טבילת פשתן. () התפרחות העיקריות הם טבלו בתקשורת החדירה המכילה את תאי Agrobacterium. (B) מוגדל מ(). (ג) הצמחים טבולים מונחים שטוחים עד ליום המחרת, והסניפים טבלו מכוסים בפלסטיק כדי לשמור על לחות גבוהה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> jove_content "fo: לשמור-together.within-page =" תמיד "&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg"> סניפי איור 4. התהליך של אוספי מעקב פרחים וזרעים, מצמחי T0 טופל () דוגמא של הצמח כולו עם הסניף הראשי (הסניף הגבוה ביותר במרכז) והן בצד (B - D).. . דוגמא של פרחים מהענפים השונים (E) דוגמא של הזרעים שנאספו מפרחים בודדים (שכותרתו - k). מהסניף הראשי <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg"> איור 5. שתילי T1 גדלים ללא בחירת אנטיביוטיקה. (א) זרעי T1 הםמונבטים על תקשורת צמח MS. (B) transformants חיובי, כפי שנקבע על ידי PCR הישיר, מושתלים לאדמה וגדל לפדיון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg"> איור 6. בריחה אנטיביוטיות, בעיה לבחירת T1, הוא להתגבר על ידי הקרנת PCR ישירה. זרעי פשתן () Wild הסוג מונבטים בתקשורת צמח MS ללא אנטיביוטיקה. זרעי פשתן (B) Wild הסוג מונבטים בתקשורת צמח MS + ריכוזי הגדלת של kanamycin (200 מיקרוגרם / מיליליטר, 600 מיליליטר / ק"ג, 1 מ"ג / מיליליטר). הזרעים (C) Wild סוג פשתן מונבטים בתקשורת צמח MS עם 2 מ"ג / מיליליטר kanamycin. (ד) PCR מפשתן wild-type וT1 שתיל באמצעות פריימרים kanamycin, כל amplified גן kanamycin (אגדות: EZ1: סמן DNA, FlaxS, flaxS wild-type, C: לשלוט שאינו טבול סניף, מא: צאצאי T1 מפרח "" שנאסף מהסניף הראשי, Sc, SD, Se, מדע בדיוני: progenies T1 של פרחים שונים "ג, ד, ה, ו" שנאספו מהענף הצדדי, W:. לא-DNA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg"> איור 7. דוגמא של amplifications PCR המוצלח של progenies T1 בשיטת PCR הישירה. (א) תרשים של הווקטור בינארי הצמח + להוסיף LIS-1 המשובט. חיצים כחולים מציינים את המיקום של פריימרים PCR משמשים בהקרנה הישירה PCR (שונה מTakara). (ב) PCR עם פריימרים M13F + 3 '(C) PCR עם פריימרים M13R + 18a אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מקור רצף פריימר קדימה </td><td> רצף 5'-3 " </td><td> מקור רצף פריימר הפוך </td><td> רצף 5'-3 " </td><td> טמפ חישול (° C) </td><td> הארכת זמן (שניות) </td><td> גודל צפוי (נ"ב) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 '(LIS-1 להוסיף) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18 א (LIS-1 להוסיף) </td><td> TATTTTAACCC </td><td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. חלק מפריימרים המשמשים לבדיקת PCR הישירה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפוך פשתן באמצעות Agrobacterium שינוי צמח בתיווך באמצעות פרחוני לטבול. פרוטוקול זה הוא פשוט לביצוע ולא יקר, עדיין מניב שיעור שינוי גבוה יותר מאשר בשיטות הזמינות הנוכחיות לשינוי פשתן.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן ( Linum usitatissimum) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

מטרת הניסוי הבא היא לשנות את הגמישות באמצעות שיטת טבילה פרחונית בתיווך אגרובקטריום. זה מושג על ידי גידול הצמחים הגמישים לשלב פריחה מתאים עם בחירת ראשוני בניצנים פלואורסצנטיים. לאחר מכן, הפרחים טובלים במדיום ההסתננות המורכב מתאי אגרובקטריום הנושאים את הפלסמיד המתאים.לאחר מכן הצמחים המטופלים נשמרים כרגיל עד שהם מניחים זרעים. הזרעים נובטים וישירים. PCR מבוצע מהעלים שלהם, DNA, על מנת לזהות ולבחור טרנספורמציות חיוביות לצמיחה לבגרות.התוצאות מראות כי על ידי שימוש באגרובקטריום וטבילת פרחים על פשתן, ולאחר מכן בדיקת PCR ישירה, טרנספורמציה ובחירה של טרנספורמטורים חיוביים היא קלה וחסרה. ישנם מספר יתרונות לטכניקה זו על פני שיטות רבות קיימות. טבילת פרחים באמצעות אגרובקטריום היא פשוטה, זולה, יעילה, והכי חשוב, נותנת קצב טרנספורמציה גבוה יותר מהשיטות הקיימות כיום להתמרת פשתן.מי שתדגים את ההליך תהיה nsma baki, דוקטורנטית מהמעבדה שלי, שישה שבועות לפני טבילת הפרחים. התחל לגדל את הצמחים. הכינו עציצים של חמישה סנטימטרים עם אדמה, וכך זרעי הפשתן בעומק של רבע סנטימטר.קברו ארבעה בכל סיר. ודא שהאדמה מעל הזרעים ארוזה היטב. לאחר מכן השקו את העציצים באופן קבוע וגידלו את הצמחים במחזור יומי של 14 שעות ביום.תחזוקה שומרת על הטמפרטורה בין 23 ל-27 מעלות צלזיוס. בדוק באופן קבוע אם יש עלים חתוכים ראשוניים בפלואורסצס לפי הצורך כדי לחפש את הניצנים הללו כאשר הניצנים זה עתה נוצרו. הפלואורסצ'ים מוכנים לטרנספורמציה.שינוי בשלב זה הוא קריטי מאוד לפרוטוקול זה. לטיפול העיקרי, השתמש בענף הראשי לטיפולים אחרים ובקרות לא טבולות. השתמש בענפים הצדדיים המייצרים פחות פרחים.הקפידו לתייג את הענפים והפרחים עם התאריך וסוג הטיפול שהם מקבלים לפני הטבילה הפרחונית. הכן תאי אגרובקטריום הנושאים את הפלסמיד המעניין במקרה זה, BRI 9 0 9. שלבי הכנה אלה המתחילים בשיבוט מפורטים בפרוטוקול הטקסט.יומיים לפני טבילת הפרחים, יש להפשיר את האגרובקטריום המותמר המאוחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ב-50% גליצרול לגדל את התאים הללו עד לשלב הנייח בבקבוקונים של חמישה עד 20 מיליליטר עם LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה. שלב זה נעשה בדרך כלל בן לילה. OD בין 0.5 לאחד מקובל מהשלב הנייח.חסנו 1 עד 100 דילולים על ידי שפיכת חמישה מיליליטר מהתאים שגדלו בעבר לתוך 500 מיליליטר LB וגידלו אותם בן לילה. 28 עד 30 מעלות צלזיוס רעדו ב-150 סל"ד. כאשר ה-OD של התרבית הוא בין 0.5 ל-1, באופן אידיאלי 0.8, אסוף את התאים בסיבוב של 5,000 גרם של חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן השעו מחדש את התאים במדיום הסתננות, המורכב מ-500 מיליליטר של מי חיטוי עם 5% סוכרוז. כאשר התאים מושעים במלואם, מוסיפים לתערובת 0.05% צללית 77 ומערבבים. לאחר מכן יוצקים את התערובת לכלי כמו צלחת זכוכית פיירקס בגודל שמונה אינץ 'על שמונה אינץ'.בסבבי טבילה מאוחרים יותר, הפחיתו את ריכוז הצללית 77 ל-0.03% באמצעות שלב הפרחים והצללית הטובים ביותר. ריכוז 77 הם שניהם גורמים קריטיים מאוד לתשואה מוצלחת של שנאים חיוביים. עכשיו בצעו את טבילת הפרחים.ראשית, הניחו את הצמח על צדו. לאחר מכן טבלו את הניצנים הגלויים במדיום ההסתננות למשך דקה עד שתיים. לאחר הטבילה, השאירו את הצמח הצידה, למשך הלילה, וכסו אותו בניילון כדי לשמור על הצמח לח.למחרת, החזירו את הצמח למצבו הרגיל. לאחר 10 עד 14 יום, הניצן אמור לגדול. לאחר מכן חזור על הטבילה הפרחונית על אותם ענפים עם ריכוז צללית מופחת.77, תוך שימוש בתוויות הענפים כדי לשמור על דיוק. מאוחר יותר, העריכו את הצמח כאשר הזרעים בוגרים ומוכנים לאיסוף. קח זרע אחד מכל פרח כדי להתחיל לבדוק טרנספורמטורים חיוביים.יש לגדל את הזרע כמתואר קודם לכן. שתילת שלושה עד שישה זרעים בכל עציץ של חמישה אינץ '. הזרעים ינבטו תוך ארבעה עד שישה ימים לאחר הזריעה.כאשר מגדלים תחת 14 שעות אור בכ-10 עד 14 ימים לאחר הנביטה, יתפתחו עלים אמיתיים, שניתן להשתמש בהם לבדיקת הצמח. באמצעות PCR ישיר בחרו חמישה עד 10 מיליגרם עלים מכל שתיל לתוך צלחת שקילה. כאשר בודקים את המשקל, הכניסו את העלים לצינור צנטריפוגה.הוסף 180 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 50 מילי-מולרי לכל צינור. לאחר מכן דגרו את הצינורות למשך 10 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה בחום, יש לנטרל כל תגובה עם 20 מיקרוליטר של הידרוכלוריד טוחנת אחת ב-pH 8.0.יש להשתמש בפריימרים TD NA או פריימרים להכנסה כדי ליצור רפליקון ספציפי מצמחים טרנספורמציה. לאחר מכן השתמש במיקרוליטר אחד מכל תמצית כתבנית לתגובת ה-PCR הישירה. לאחר הערכת תוצאות ה- PCR, יש לגדל את השתילים החיוביים לבגרות.אם לא התקבלו טרנספורמטורים חיוביים, קוטפים זרעים חדשים מאותם פרחים של הצמחים הטבולים וחוזרים על המסך. במקרים מסוימים, לא כל הזרעים מפרח ישתנו. פרחים אחד נאספו מהנבטים הראשיים והצדיים של צמח T אפס יחיד.מספר זוגות פריימר שימשו ל-PCR ישיר. מיקומם של פריימרים אלה מסומן בחצים כחולים. בבדיקת PCR ישירה, שמונה מתוך 12 צמחי T נבדקו חיוביים.שני הג'לים הראשונים מראים פריימרים שמייצרים אמפליקונים מאזורים בין TDNA לגן המעניין. בסך הכל, לא היה הבדל משמעותי בטרנספורמציה של פרחים שנאספו מהענפים הראשיים והצדיים המצוינים כ-m ו-S, ג'ל זה מראה שימוש בפריימר מתוך אזור TD NA בלבד. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור ללבוש כפפות בזמן שאתה מכין את מדיום ההסתננות ועמעום הצמחים מכיוון שמוצק 77 הוא רעיל ועלול להזיק לעור שלך.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפוך פשתן או כל צמח אחר בעל אנטומיה מסועפת דומה לפשתן, באמצעות אגרובקטריום וטבילת פרחים. אנטומיה מסועפת זו מאפשרת מעקב פשוט אחר פרחים במהלך הטיפול, ובכך מקלה על הבחירה והבדיקה של שנאים חיוביים.

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה ממחיש את הפרחים, טובלים...

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

גידול כמה סוגים פשתן תחת תוצאות מתח מזין וריאציה גנומית בתוך משנה של הגנום ושונות פנוטיפי. הכניסה מורכבים באתר מסוים מזוהה עם צמיחה תחת משטרי תזונה שונים עם שינויים בביטוי הגנים סביב באתר זה.

מושרה לסביבה תורשתי שינויים פשתן

בסרטון זה אנו מדגימים יצירה של צמחי ארבידופסיס טרנסגניים המבטאים טרנסגן יציב באמצעות טרנספורמציה גנטית בינארית בינארית מבוססת כרומוזומים מלאכותיים בתיווך אגרובקטריום.

טרנספורמציה גנטית בינארית חיידקית מבוססת וקטור כרומוזום מלאכותי בצמחי Arabidopsis: טכניקה ליצירת צמחים טרנסגניים עם החדרת עותק יחיד

בליס, פרוטוקול תיוג כפול ללמוד דינמיקה lignification, פותחה. שימוש monolignol סינתטי כתבים ושילוב רציפים של bioorthogonal SPAAC, CuAAC לחץ תגובות, מתודולוגיה זו סוללת את הדרך כדי ניתוח מעמיק של הגורמים המסדירים את להן של lignins ב הפיסקו.

להמחיש Lignification Dynamics בצמחים עם לחץ על כימיה: תיוג כפולה היא האושר!

באמצעות pBIBAC-GW וקטור בינארי הופך ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד ללא פגע, תהליך קל ופשוט. . הנה, סדרה של פרוטוקולים מוצג מדריך את הקורא לאורך התהליך הטרנסגניים תודרנית מפעלים לייצור, ובדיקות את הצמחים על intactness, להעתיק מספר התוספות.

ייצור הטרנסגניים צמחים עם הוספות עותק יחיד באמצעות וקטור בינארי BIBAC-ג'י

פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

שינוי בתיווך Agrobacterium באמצעות שיטת פרחוני-מח ש יכול להיות מועסק בהצלחה כדי ליצור שורות הטרנסגניים יציב של המודל extremophyte Schrenkiella parvula. אנו מציגים פרוטוקול שונה מזו עבור תודרנית לבנה, בהתחשב גידול שונים והרגלי הפיזיולוגיות של extremophyte.

צמח צמיחה ושינוי בתיווך Agrobacterium פרחוני-מח ש של Extremophyte Schrenkiella parvula

כאן, אנו מתארים את הדור, יישום של קבוצת הטרנסגניים תודרנית לבנה קווי המאפשרת ביטוי inducible, רקמות ספציפיות את meristems הראשי שלוש, את meristem apical לירות, meristem apical את שורש ו את cambium.

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

הפרוטוקול מתאר השראת שורשים שעירים באמצעות גבעולי תפרחת ראשוניים Arabidopsis והיפוקוטיל Brassica napus . ניתן לגדל את השורשים השעירים ולהשתמש בהם כצמחים להתחדשות צמחים טרנסגניים.

טרנספורמציה והתחדשות של שורשים שעירים ב-Arabidopsis thaliana וב-Brassica napus

למדו שיטת טרנספורמציה פרחונית-דיפ בפשתן (Linum usitatissimum) באמצעות Agrobacterium ליצירת צאצאים טרנסגניים. שיטה זו פשוטה, יעילה ומציעה שיעור שינוי גבוה יותר משיטות מסורתיות.

טרנספורמציה הפרחוני-Dip של פשתן ( Linum usitatissimum) כדי ליצור progenies טרנסגניים עם שיעור שינוי גבוה

גלה סרטונים נוספים