Name: Ex vivo דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: חקור התקפה של תאי T CD8+ על אוליגודנדרוציטים במודל ex vivo בפרוסות מוח חריפות מעכברים. שיטה זו מאפשרת ללמוד על אפופטוזה של אוליגודנדרוציטים ונוירונים במחלות דמיאליניזציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) במינסטר (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 עד S.G.M. ME3283/2-1 עד S.G.M.) ועל ידי Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB ו-SGM).

כל הניסויים באמצעות עכברים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית, בהתאמה. 1. הערות כלליות לניסויים בעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על העכברים בתנאי הפתוגן ללא ולאפשר להם גישה כלרצונך מזון ומים. הערה: חשוב להשתמש בעכברי גיל והתאמת מין בקבוצות ניסוי כי דפוסים חיסוניים יכולים להשתנות עם גיל ומין. </li></ol> 2. CD8 + T לתאי הכנה והפעלה של OVA ספציפי (OT-I) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע גירוי של תאי OT-T אני כמתואר להלן 5 ימים לפני הכנת פרוסות מוח. הערה: 5 x 10 5 מפעיל מופעל CD8 + OT-אני תאי T ריכוז 5 x (CD8 + T-תאים של עכברים הטרנסגניים הכרת פפטיד OVA 257-264 רק בהקשר של מולקולות MHC-I) יש צורך לכל פרוסה 10 5 נבחר ניסויברית כאופטימלית לטובת אינטראקציה תאי תאים טובה ברגע שהתאים מתחילים נודדים לפרוסה ו, באותו הזמן, את כמות התאים היא לא גבוהה מדי כדי לגרום לתגובת יתר המאפשר תא בודד ספירת 8,18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום לculturing OT-T-תאים. להשלים DMEM 500 מיליליטר עם 5% עוברי עגל בסרום (FCS), 10 מ&quot;מ HEPES, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 50 מיקרומטר 2-mercaptoethanol, חומצות אמינו החיוני 1% ו- 25 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין. אחסן הבינוני על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הטחול של עכברים הטרנסגניים OT-כמו לכל התייחסות 16. העבר אותם למדיום מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור השעיה תא בודדת על ידי רסוק טחולים דרך מסננת השעיה ו צנטריפוגות 70 מיקרומטר ב XG 300 דקות 5, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השעיה תא עם 5 מיליליטר אמוניום כלוריד, אשלגן (ACK) חיץ (150 מ&quot;מ NH 4 Cl, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.1 מ&quot;מ EDTA, pH 7.3) במשך 5 דקות כדי lyse תאי דם אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק incubatiעל עם מדיום 10 מיליליטר ו צנטריפוגות זה שוב כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל השעיה התא בינוני ולחשב מספרים. פלייט תאים בצפיפות של 3 x 10 7 תאים / גם בצלחת 12 גם ו ראש על ידי דגירה עם OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 ננומטר) ואינטרלוקין 2 (IL-2) (500 IU / ml) ל 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 ימים, להוסיף IL-2 בריכוז של 500 IU / ml שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר גירוי, לטהר OT-אני תאי T מהשעית תא באמצעות עכבר סלקציה שלילי מבוסס ערכת בידוד תא T CD8 + הבאים הוראות יצרן. טיהור מבוססת על הדלדול של כל מי שאינו CD8 + התאים באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Class II, Ter-119, וTCRγ / Δ אשר לאחר מכן הושלך על ידי שימוש בעמודות מגנטיות עבור elution של CD8 + T לתאים המטוהרים. הערה: צעדים קריטיים בprocedu זהמחדש מסומנים על ידי מייצר: חשובה שהתגובה כרוכה רק תאים בודדים, כי הנוכחות של גושים יכולה לחסום את הטור במהלך שלב elution; הספירה של התא לפני הוספת קוקטייל Byotin חשובה לתואר של טוהר של המדגם וההליך צריכה להתבצע על קרח כדי למזער איגודי נוגדן נוקבים. </li></ol> 3. הכנת פרוסות המוח חריפה ושיתוף התרבות עם OT-אני תאי T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת המוח החריף פרוס 19, להכין פתרון placedine קר כקרח פיסיולוגי מלוח באמצעות 200 סוכרוז מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ צינורות, 2.5 מ&quot;מ KCL, 1.25 דקסטרוז 0.5 CaCl 2 ו -10 מ&quot;מ לאא 2 PO 4, 10 מ&quot;מ MgSO 4, ומלאכותי נוזל השדרתי (ACSF) באמצעות 125 mM NaCl, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 24 מ&quot;מ NaHCO 3, 2 מ&quot;מ MgSO 4, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 10 מ&quot;מ דקסטרוז. התאם את ה- pH של כל פתרון ל7.35 על ידי using NaOH. לפני התאמת pH של ACSF, פתרון חייב להיות בועות בתערובת של 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לקרר את הפתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי 8 - עכברים 10 שבוע ישנים (למשל, C57Bl / 6 כשליטה או עכברי ODC-OVA מהונדסים 17 עם שאיפה באמצעות isoflurane 5.0%, 5.0% halothane או להזריק 100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ&quot;ג / xylazine קילוגרם משקל גוף באמצעות ה- IP חכה להרדמה ולהשתמש בקמצוץ הבוהן כדי להעריך את הרמה של הרדמה ולערוף אותם בבת אחת. להרדים את העכברים כמו לכל טיפול בבעלי חיים מוסדי ולהשתמש בקריטריוני וועדה להמתת חסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים עכבר בעמדת הגחון. לחטא ולחתוך קרקפת sagittally. פתח את עצם גולגולת sagitally, להסיר את המוח במהירות בעזרת סקופ ולתקן אותה על הצלחת של vibratome באמצעות דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצלחת עם הפתרון מוכן placedine קר כקרח הפיזיולוגי מלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 300 מיקרומטר פרוסות העטרה עם vibratome. הערה: הליך זה הוא יודעn להניב דגימות רקמה שלמות קיימא מתאימות ללימודים סלולריים פונקציונליים בתוך פרק זמן של לפחות 8 שעות 19-21 זמן. ואכן, לאחר פרק זמן זה, כבר מתחיל לאחר 6 שעות, הכנת תערוכות איכות מופחתת, כלומר שינויים במאפיינים בסיסיים ופונקציונליים כמו דור פוטנציאל פעולה והפצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חתך, להעביר פרוסה אחת מייד לבאר כל צלחת 12 גם מלא בACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 5 x 10 5 תאי OT-T אני לכל פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסות לתקופה של עד 8 ​​שעות בחממה (37 ° C, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה, פרוסות קציר ולהטביע אותם על ידי שימוש ברקמה-tek מתחם OCT ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. לאחסן אותם ב -20 ° C ללימודים היסטולוגית נוספים לדוגמה, להעריך מבנה עצבי (למשל, אנטי-MAPII באמצעות או נוגדנים נגד synaptophysin) או אפופטוזיס (למשל, באמצעות אנטי caspase-3 נוגדנים ואנטי-אנטי NeuNגופים) על פי נהלים קבועים. </li></ol>

<ol><li>Moll, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+in+PML+and+MS%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences.</a> Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).</li>
<li>Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transected+neurites%2C+apoptotic+neurons%2C+and+reduced+inflammation+in+cortical+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).</li>
<li>Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpial+demyelination+in+the+cerebral+cortex+of+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).</li>
<li>Babbe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansions+of+CD8%28%2B%29+T+cells+dominate+the+T+cell+infiltrate+in+active+multiple+sclerosis+lesions+as+shown+by+micromanipulation+and+single+cell+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction.</a> J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).</li>
<li>Junker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+T-cell+receptor+expression+in+distinct+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions.</a> Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).</li>
<li>Skulina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+brain-infiltrating+CD8%2B+T+cells+persist+as+clonal+expansions+in+the+cerebrospinal+fluid+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).</li>
<li>Friese, M. A., Fugger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+multiple+sclerosis%3A+a+new+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy.</a> Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).</li>
<li>Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+and+neuronal+damage%3A+direct+and+collateral+mechanisms+of+cytotoxicity+and+impaired+electrical+excitability%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability).</a> FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).</li>
<li>Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+analysis+of+T+lymphocyte+subsets+in+the+central+nervous+system+in+chronic+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+the+cellular+infiltrate+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions.</a> Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).</li>
<li>Hoftberger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules+on+the+different+cell+types+in+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions.</a> Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+neuronal+apoptosis+in+CNS+gray+matter+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%28%2B%29+T+cell+attack%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack.</a> Glia. 58, 469-480 (2010).</li>
<li>Melzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+cell+death+during+an+oligodendrocyte-directed+CD8%2B+T+cell+attack+in+the+CNS+gray+matter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter.</a> J Neuroinflammation. 10, 121(2013).</li>
<li>Huseby, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenic+role+for+myelin-specific+CD8%28%2B%29+T+cells+in+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis.</a> J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).</li>
<li>McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+killing+of+neurons+by+cytotoxic+T+cells+specific+for+a+glial+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen.</a> Glia. 53 (5), 457-466 (2006).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76 (1), 17-27 (1994).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+transgenic+mice+expressing+ovalbumin+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes.</a> Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).</li>
<li>Göbel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+CD25%28%2B%29+FoxP3%28%2B%29+regulatory+T+cells+suppress+cytotoxicity+of+CD8%28%2B%29+effector+T+cells%3A+implications+for+their+capacity+to+limit+inflammatory+central+nervous+system+damage+at+the+parenchymal+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level.</a> J Neuroinflammation. 9, 41(2012).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Meuth, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+TWIK-related+acid-sensitive+K%2B+channel+1+%28TASK1%29+and+TASK3+channels+to+the+control+of+activity+modes+in+thalamocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons.</a> J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).</li>
<li>Misgeld, U., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+viability+of+neurons+in+hippocampal+slices+on+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply.</a> Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).</li>
<li>Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+activation+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+presence+of+antigen+in+organotypic+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices.</a> J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מודלים של בעלי חיים שונים תוארו בעשורים האחרונים לטיפול במאפייני פתולוגיים של הפרעות demyelinating דלקתיות כמו טרשת נפוצה. בvivo מודלים עכבר והחולדה נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקות את תכונות pathophysiological של המחלה, כלומר, ניתוח של ההשלכות של תהליכי demyelination וחידוש יצירת המיאלין ושל פרקים מתמזגים של דלקת וניוון של מערכת עצבים. עם זאת, רק גישה vivo לשעבר מאפשרת לנתח את המנגנונים העומדים בבסיס המדויק. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direc...

מוות של אוליגודנדרוציטים והרס מעטפת המיאלין המלווה באובדן נוירונים ואקסונים הם ממצאים פתולוגיים אופייניים בנגעי חומר אפור אצל אנשים הסובלים מטרשת נפוצה (MS)1,2. ניתן לחלק את הנגעים בקליפת המוח עד כה לשלושה תת-סוגים שונים2: נגעים תת-פיאליים, תוך-קורטיקליים ולויקוקורטיקליים. בהשוואה לפלאק החומר הלבן, ההסתננות מאופיינים בדומיננטיות של תאי T CD8+, מה שמרמז על תפקידם המכריע האפשרי בדלקת בחומר האפור3. יתר על כן, ניתן למצוא התרחבות אוליגוקלונלית בדם, בנוזל המוח השדרתי (CSF) ובתוך נגעים דלקתיים עבור תאי CD8+ T עצמם4-6. 
בהתאם לכך, ההנחה היא שתאי CD8+ T עשויים להיות ספציפיים לחלבוני מיאלין שונים7,8. ואכן, תאי T CD8+ נמצאים ליד אוליגודנדרוציטים ומעטפות מיאלין9,10 המראים ביטוי MHC I11 ולכן עשויים להיות אחראים לאובדן מעטפת המיאלין. תהליך זה נראה לעתים קרובות יחד עם נזק עצבי ואקסונלי "משני" נרחב בתוך החומר האפור של מערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2. למעשה, מוות ישיר ועקיף של אוליגודנדרוציטים ונוירונים נגרם על ידי תאי T CD8+ באמצעות שני מנגנונים שונים: (i) נפיחות וקרע בקרום התא עקב היווצרות גרגירים ציטוטוקסיים בעקבות שחרור פרפורינים וגראנזימים ו-(ii) קשירה לקולטני Fas או חשיפה של FasL על פני השטח שלהם8,12,13.
סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקור את המנגנון הבסיסי של התהליכים שהוזכרו. מבחינה זו, תאי CD8+ T דרוכים ספציפיים לאוטואנטיגנים עם ביטוי מושרה בתאי גליה של מערכת העצבים המרכזית, כמו אוליגודנדרוציטים או אסטרוציטים, יכולים להיות מועברים באופן אימוץ כדי לנתח מוות עצבי ואקסונלי "משני" בחומר אפור לאחר מכן14,15. ביצוע ניסויים כאלה in vivo הוא עזרה גדולה לחקות כמה היבטים פתופיזיולוגיים של טרשת נפוצה, עם זאת, גישה זו אינה מתאימה לפתור את המנגנון והקינטיקה הבסיסיים של נזק אקסונלי ואפופטוזיס עצבי.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, הוקמה גישת ex vivo לחקר המנגנונים ומהלך הזמן של מוות תאי עצב לאחר מתקפת תאי T CD8+ מכוונת אוליגונדנדרוציטים. מכיוון שרק אוליגודנדרוציטים ולכן ייצור מעטפת המיאלין צריכים להיות ממוקדים על ידי תאי חיסון, נעשה שימוש בתאי OT-I מוגבלים מסוג I, תגובת אובאלבומין (OVA)16. תאים אלה מועברים לאחר מכן לפרוסות מוח המתקבלות מעכברים המבטאים באופן סלקטיבי OVA באוליגודנדרוציטים (עכברי ODC-OVA)17.

<table><tbody><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>קורנינג</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>ג'יבקו</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2-מתילבוטן</td><td>רוט</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; m מסננת</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>סידן כלורי</td></tr><tr><td>CD8+-בידוד ערכת בידוד</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-859</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז</td><td>Merck</td><td>1.08337.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-151</td><td>סרום עגל עובר</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td>אשלגן כלורי</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td>אשלגן מימן פחמתי</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td>מגנזיום גופרתי</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>נתרן כלורי</td></tr><tr><td>NaH2PO4 * H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td>נתרן מימן פוספט</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>נתרן מימן פחמתי</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>נתרן הידרוקסיד</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>213330</td><td>אמוניום כלוריד</td></tr><tr><td>חומצת אמינו לא חיונית</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>OVA (257-264)</td><td>Genscript</td><td>RP10611</td><td>ovalbumin</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Merck</td><td>1.07687.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>סאקורה</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo דגם של התקפת t-cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

מוות של אוליגודנדרוציטים המלווה בהרס של נוירונים ואקסונים הם ממצאים היסטופתולוגיים אופייניים בנגעי חומר אפור בקליפת המוח והתת-קורטיקלית בהפרעות דמיאלינטיות דלקתיות כמו טרשת נפוצה (MS). בהפרעות אלו נמצאים בעיקר תאי CD8+ T בעלי ספציפיות משוערת לאנטיגנים הקשורים למיאלין ואוליגודנדרוציטים, כך שאפופטוזיס עצבי בנגעי חומר אפור עשוי להיות אפקט משני של תאים אלה. סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקור את המנגנונים הבסיסיים של התהליכים הפתופיזיולוגיים שהוזכרו. עם זאת, למרות שהם מחקים היבטים מסוימים של טרשת נפוצה, אי אפשר לנתח את המנגנון המדויק ואת מהלך הזמן של מוות תאי עצב "אגבי". כדי לעסוק בקורס זה, אנו מראים פרוטוקול לחקר המנגנונים ותגובת הזמן של נזק עצבי לאחר התקפת תאי CD8+ T מכוונת אוליגודנדרוציטים. כדי להתמקד רק במעטפת המיאלין ובאוליגודנדרוציטים, תאי CD8+ T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים המופעלים במבחנה מועברים לפרוסות מוח מבודדות באופן חריף. לאחר תקופת דגירה מוגדרת, ניתן לנתח נזק למיאלין ולתאי עצב באזורי עניין שונים. יידונו יישומים ומגבלות פוטנציאליים של מודל זה.

לאחר הדגירה של פרוסות מוח עם CD8 + תאי T-מכוון oligodendrocyte, oligodendrocytes כמו גם נוירונים עוברים אפופטוזיס (2A דמויות ו1C, בהתאמה). סימנים היסטולוגית של אפופטוזיס (למשל, caspase-3, Tunel) ניתן לאתרם מוקדמים לאחר 3 שעות של דגירה. תקופת דגירה לא צריכה להיות ארוכה יותר מ- 8 שעות על מנת להבטיח את איכות טובה של ההכנה ותוצאות לשחזור. ניתן למצוא תאים אפופטוטיים בכל רחבי פרוסה עם עליונות באזורי myelinated. צביעה היסטולוגית למופת של הפרוסה לשלמות...

כדי לטפל במנגנונים של דה-מיאלינציה ואפופטוזיס עצבי בנגעים בקליפת המוח של הפרעות דמיאלינטיות דלקתיות, נעשה שימוש במודלים שונים של בעלי חיים. אנו מתארים כאן גישה ex vivo על ידי שימוש בתאי CD8+ T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים על פרוסות מוח, וכתוצאה מכך מוות אוליגודנדרוגליאלי ועצבי. נדונים יישומים ומגבלות פוטנציאליים של המודל.

Ex vivo דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור התקפה מכוונת אוליגודנדרוציטים של CD שמונה תאי T ex vivo. זה מושג על ידי בידוד תאי CD שמונה T מהטחול של עכברים. השלב השני הוא הכנת פרוסות מוח חריפותלאחר מכן פרוסות המוח מודגרות עם תאי CD 8 T מופעלים למשך עד שש שעות, ולאחר מכן שימור קריו ומחקרים היסטולוגיים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית כדי לחקור את מיקומם של תאי T כמו גם אפופטוזיס של אוליגודנדרוציטים. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני טכניקות קיימות כמו דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית, מודל של בעלי חיים של טרשת קלה הוא הנזק לתאי העצב.לאחר CD ניתן ללמוד בפירוט התקף אוליגודנדרוציטים בתיווך שמונה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-אימונולוגיה, כגון סחר בתאי חיסון ברקמות, או ניוון של נוירונים ואוליגודנדרוציטים. מדגים את ההליך אלכסנדר האמאן, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי חמישה ימים לפני הכנת פרוסות המוח מגרות את תאי ה-OT 1 T להפעיל את התאים.ראשית, עקוב אחר פרוטוקול הראייה כדי להסיר את הטחול של מספר עכברים טרנסגניים O OT אחד. אוספים את הטחול במדיום טרי שהוכן. לאחר מכן, צור תרחיף תא יחיד על ידי ריסוק הטחול דרך מסננת של 70 מיקרון, ולאחר מכן צנטריפוגה את המתלה ב-300 Gs למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מאגר אשלגן אמוניום כלוריד. תנו לתאים לדגור במאגר הזה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לליז את כדוריות הדם האדומות. לאחר מכן סיים את התגובה על ידי הוספת 10 מיליליטר של חומר משלים בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, אסוף את התאים שוב על ידי סיבובם כלפי מטה כמו קודם. לאחר מכן אוספים את התאים הגלולים, מחזירים אותם לחיים, משעים אותם במדיה וסופרים אותם כאשר צפיפותם ידועה. העבירו את התאים לצלחת של 12 בארות ב-30 מיליון תאים לבאר.לאחר מכן הוסיפו מדיה עם OVA ואינטרלוקין שתיים ודגרו על התאים למשך ארבעה ימים. לאחר ארבעה ימים מוסיפים עוד אינטרלוקין שניים בריכוז של 500 יחידות למיליליטר. לאחר מכן דגרו על התאים ליום נוסף.כעת באמצעות ערכת בידוד תאי T חיוביים CD שמונה, טהר את תאי ה- O OT one T מהתאים המתורבתים. על רגל אחת. שמונה תאים חיוביים שאינם CD מתרוקנים על ידי שימוש בקוקטייל של נוגדנים ומופרדים באמצעות עמודה מגנטית. בכך, הכינו את הדגימה על קרח וודאו שהתגובה מערבת רק תאים בודדים, כך שהעמודה לא תיחסם.לאחר מכן ספור את התאים. לניסוי הזה. יש עכברים טרנסגניים בני שמונה עד 10 שבועות, O-D-C-O-V-A, עכברים וגיל ומין תואמים C 57 שחור שש בקרות.כרגיל, שיכנו את העכברים בסביבה נטולת פתוגנים עם גישה חופשית למזון ומים. לאחר הרדמת עכבר, השתמש בצביטה בכף הרגל האחורית כדי להעריך את רמת ההרדמה ולאחר מכן המתת חסד מיד. כעת מקם עכבר בגחון וחטא את הקרקפת וערוף את ראשו.לאחר מכן, חתכו את הקרקפת במהירות, פתחו את הגולגולת והוציאו את המוח. מקבעים את המוח במקומו באמצעות דבק ומעבירים אותו לצלחת ויברם. לאחר מכן מלאו את הצלחת במי מלח קרים כקרח ופיזיולוגיים.לאחר ההכנה חותכים פרוסות 300 מיקרון. מעבירים את הפרוסות לבארות בודדות של צלחת 12 או 24 בארות במילוי CSF. לאחר מכן הוסיפו בזהירות חצי מיליון תאי OT אחד לכל פרוסה.חצי מיליון תאים פעילים מותאמים אישית מספקים אינטראקציה טובה בין תאים. ברגע שהתאים, התאים מתחילים לנדוד לתוך הפרוסה. יחד עם זאת, כמות התאים אינה גבוהה מדי כדי לגרום לתגובת יתר, ולכן ספירת תאים בודדים אפשרית.לאחר העמסת כל הבארות, יש לדגור על התרבות המשותפת עד שמונה שעות לאחר הדגירה, לקצור את הפרוסות ולהטמיע אותן בתרכובת OCT. לאחר מכן הקפיאו את הפרוסות המוטבעות בחנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס להמשך מחקרים היסטולוגיים. לאחר דגירה של פרוסות מוח עם אוליגודנדרוציטים מכוונים CD שמונה תאי T חיוביים, אוליגודנדרוציטים עברו אפופטוזיס.נוירונים עברו גם אפופטוזיס. הסימנים המוקדמים ביותר של אפופטוזיס נראו לאחר שלוש שעות של דגירה והיו חזקים בשמונה שעות. אפופטוזיס נצפתה יותר בתאי O-D-C-O-V-A שנחשפו לתאי OT One T מאשר בכל מצב אחר.בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות נוספות כדי לענות על שאלות הנוגעות להתנהגות נדידה של תאי T, או מעורבות של תעלות יונים בפטוזיס המעבדה שלך. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להכין פרוסות מוח חריפות וכיצד לתרבית אותן במשותף עם תאי T.

an-ex-vivo-model-an-oligodendrocyte-directed-t-cell-attack-acute

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקת ex vivo לגרימת מוות של תאי מוח המתווכים באמצעות תאי T ציטוטוקסיים CD8+. עם קבלת פרוסות המוח, תאי CD8+ T מופעלים המכוונים אוליגודנדרוציטים מועברים לפרוסות כדי להתמקד במעטפת המיאלין ובאוליגודנדרוציטים. לאחר הדגירה, הנזק למיאלין ומוות עצבי ניתן להעריך היסטולוגית באזורי עניין.

טכניקת Ex Vivo לגרימת מוות עצבי באמצעות תאי T ספציפיים לאוליגודנדרוציטים CD8+

מקור: Kennedy, L. H., et. al. הדמיה והדמיה חיה של אברוני אוליגודנדרוציטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות באמצעות וירוס הקשור לאדנו ומיקרוסקופיה קונפוקלית. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את ההדמיה של מיטוכונדריה אוליגודנדרוציטים בפרוסות מוח אורגנוטיפיות של עכבר. הפרוסה מונחת בתוך תא אמבטיה עם זרימת נוזלים רציפה וטמפרטורה מבוקרת. לאחר הגדרת פרמטרים שונים של המיקרוסקופ הקונפוקלי, נלכדות תמונות זמן-lapse של מיטוכונדריה עם פלואורסצנטיות אדומה, ואחריהן תמונות Z-stack של האוליגודנדרוציטים עם...

הדמיה קונפוקלית של תנועה מיטוכונדריאלית בתוך אוליגודנדרוציטים בתרביות פרוסות מוח אורגנוטיפיות

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן.  שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

תאים גלובואידים הם מאפיין פתולוגי מגדיר של מחלת קראב, לויקודיסטרופיה שכיום חסר טיפול יעיל לטווח ארוך. פיתחנו מודל תרבית תאים כדי לחקור את הביולוגיה המולדת והפוטנציאל הפתוגני של מיקרוגליה מופעלת והפיכתם לתאים גלובואידים.

במבחנה דגם לחקר נייד פתופיזיולוגיה בLeukodystrophy הסלולרי Globoid

Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

Oligodendrocytes להפוך Myelinating לקדם הפצת פוטנציאל הפעולה מהירה והישרדות עצביים. המתוארים כאן הוא פרוטוקול ספציפי אוליגודנדרוציטים ביטוי של חלבונים פלורסנט ב organotypic פרוסות המוח עם הדמיה בצילום מואץ עוקבות. עוד, מוצג הליך פשוט להמחשת המיאלין וללא רבב.

ויזואליזציה והדמיה בשידור חי של Organelles אוליגודנדרוציטים בפרוסות Organotypic המוח באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ומיקרוסקופיה קונפוקלית

אנו מציגים שיטה אשר יכול לספק עוד תובנות האירועים בתחילת שבבסיס הקשורים ניוון מוחיים, המבוססת על הטכניקה המוח הוקמה לשעבר-vivo , המשלב את היתרונות של ניסויים ב- vivo ו- in vitro לקשרי . יתר על כן, הוא מייצג הזדמנות ייחודית השוואה ישירה של קבוצת טיפול ללא טיפול באותו מישור אנטומיים.

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח, להגיב במהירות עם שינויים מורפולוגיים שינויים של סביבתם. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש מיקרוסקופ שני הפוטונים כדי לחקור את המשיכה של תהליכים microglial לכיוון סרוטונין או ATP פרוסות המוח חריפה של עכברים.

שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

חקור התקפה של תאי T CD8+ על אוליגודנדרוציטים במודל ex vivo בפרוסות מוח חריפות מעכברים. שיטה זו מאפשרת ללמוד על אפופטוזה של אוליגודנדרוציטים ונוירונים במחלות דמיאליניזציה.

Ex vivo דגם של התקפת T-Cell-מכוון oligodendrocyte בפרוסות המוח חריף

גלה סרטונים נוספים