Name: גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: למד פרוטוקול יעיל לגזירת תאי RPE מאיכות גבוהה מתאי גזע מושרים באמצעות גורמים מוגדרים. שיטה זו מאיצה את ההתמיינות ומגבירה את התפוקה ליישומים תרפויטיים ומחקריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לאנשים הבאים: ד"ר טים קרון וד"ר אייל בנין (יחד עם ד"ר מנדי להמן ודיוויד פרידלנדר) על עזרתם הנדיבה בפיתוח פרוטוקולי ההתמיינות. ד"ר פליסיטס בוכר סייעה בהתמיינות תאי ה-RPE ששימשו במחקר זה. אנו מודים גם למכון העיניים הלאומי (מענקי NEI EY11254 ו-EY021416), למכון קליפורניה לרפואה רגנרטיבית (מענק CIRM TR1-01219) ולמכון המחקר הרפואי Lowy (LMRI) על מימון נדיב מאוד לפרויקט זה.

1. בימוי התמיינות של הרשתית המופק מתאי גזע הערה: כל שלבי הדגירה מתבצעות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קווי הס או ירכיים (להאכיל יומי) בתקשורת תחזוקה (MM; טבלת 1). ברגע שהקווים הגיעו סטנדרטים מספקים של בקרת איכות, לשמור אותם בשכבה של תאים מזינים עכבר עוברי (MEFs) זורעים בצפיפות של 250,000 / גם צלחת גם שש. יכולות גם להיות שנוצרו תרבויות ללא קסנו הבא הפרוטוקול שהוקם על ידי et al טאקר. 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר למושבות של תאי גזע להגיע confluency. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לתקשורת בידול עם Nicotinamide (DM / NIC; טבלת 1); להאכיל יומי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה שבועות בתרבות, לעבור לתקשורת בידול עם nicotinamide וגם Activin-או IDE-1 (DM / NIC / AA או DM / NIC / IDE1; טבלת 1) כדי לשפר את בידול הרשתית. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי חמישה שבועות בתרבות, לחזור לDM / NIC. האכלות יומיות אינן נחוצות עוד פעם אינדיקטורים pH בתחנת התקשורת הופכת צהוב ביום שלאחר ההאכלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה לאיים של תאי פיגמנט להופיע כי הם גדולים מספיק כדי לחתוך ולהסיר (ראו איורים 2D-F ו3A). </li></ol> 2. איי פיגמנט בידוד <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל הבארות של צלחת 24 גם עם מטריצה ​​המחקה את סביבת התא הטבעית (ללא קסנו עדיף). הערה: להבי קרנית ומלקחיים חדים, קנס שקצו הם מאוד שימושיים לקטיף. גיליון השלם של תאים מובחנים יכול לנתק תוך קטיף. למנוע זאת על ידי עבודה בזהירות ובהתחלת קטיף מושבות במרכז הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא בארות רבות של הצלחת 24 גם עם תקשורת בידול (DM; טבלת 1) במידת צורך. החלטה זו תהיה תלויה במספר מושבות פיגמנטשנאסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף תרבית תאים עם היקף לנתח, לחתוך באופן ידני את איי פיגמנט. לקצוץ את כל איון בתחתית הצלחת המקורית באמצעות אזמל בכ 2-6 חתיכות ולתפוס את חלקי פיגמנט עם מלקחיים חדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1-2 חתיכות פיגמנט לכל 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין לשנות תקשורת במשך 3-5 ימים, עד שתאים לדבוק, אז להתחיל לשנות מדיה שלוש פעמים בשבוע. (אם הם לא לדבוק בתום תקופה זו, הסבירות היא טובה כי הם לעולם לא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב תאים במשך 3-4 שבועות בתקשורת בידול (DM; טבלת 1) - תמונה של תרבות טיפוסית מוצגת באיור 3. תאים עדיין לא יכולים למלא את כל טוב אבל מחכים כבר לא נראים כדי לעזור. להאכיל את תאים שלוש פעמים בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 3 שבועות, להסיר באופן ידני אשכולות של תאים לבנים בגושים במידת צורך עם מלקחיים חדים. אל תעשו את הצעד הזה, אלא אם כן יש צורך - זה קל להציג את המזהמים. הוא אידיאלי לאנסה להשיג אוכלוסיות הטהורות ביותר של הרשתית ממושבות פיגמנט המקוריות בשלב 1.6. </li></ol> מקורן בתאי גזע 3. Passaging הרשתית <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים עם 200 μl עם פתרון תא דיסוציאציה (רצוי לא טריפסין-מגיב כי יכול להיות מובטל בדילול עדיף) במשך 5-8 דקות על 37 מעלות צלזיוס, ולהשבית אותו על ידי דילול עם DM. השתמש פיפטה 200 μl כדי לשטוף את כל התאים וresuspend אותם (אם נבחר גם מכיל רק כמה תאים, שוקלים איגום התאים משני 24 בארות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (800 XG במשך 5 דקות), להשליך supernatant, וגלול בתקשורת DM 3 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים-צלחת מחדש מאחד (או שתיים) 24 בארות למטריצה ​​אחד 6-גם מצופה ב 3 מיליליטר של DM בכל טוב (1: 5 הרחבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב במשך 1-2 שבועות עד שהתאים הם ~ ומחוברות 90%; דמותה של התרבות הטהורה מובחנת באופן מלא מוצגת באיור 3 ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים עם ד תא 1 מיליליטרפתרון issociation כ 5-8 דקות על 37 מעלות צלזיוס, להשבית אותו על ידי דילול עם DM, להשתמש 1,000 פיפטה μl כדי לשטוף את כל התאים, וresuspend אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה (800 XG במשך 5 דקות), להשליך supernatant, וגלול בתקשורת DM 18 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים-צלחת מחדש מאחד 6-גם כל לשש מטריצה ​​מצופה 6-בארות ב 3 מיליליטר של DM בכל טוב (1: 6 הרחבה) או אחד מצופי 75cm 2 בקבוק (1: 7.5 הרחבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.4-3.8 צריכים, עד שמספיק תאים מתקבלים. הערה: נסה לאסוף מושבות רבות ככל האפשר להרחבה ולא מתכנן להגביר את התרבויות באמצעות passaging מאז כל קטע גורם dedifferentiation הרשתית. </li></ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Congdon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+prevalence+of+visual+impairment+among+adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Causes and prevalence of visual impairment among adults in the United States.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 477-485 (2004).</li>
<li>Friedman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+age-related+macular+degeneration+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of age-related macular degeneration in the United States.</a> Arch Ophthalmol. 122 (4), 564-572 (2004).</li>
<li>Resnikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year.</a> Bull World Health Organ. 82 (11), 844-851 (2002).</li>
<li>Bird, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targets+in+age-related+macular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targets in age-related macular disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (9), 3033-3041 (2010).</li>
<li>Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 355 (14), 1474-1485 (2006).</li>
<li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+In+Retinal+And+Eye+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+of+the+RPE+in+AMD%22%5BJournal%5D)">Progress In Retinal And Eye Research.</a> Transplantation of the RPE in AMD. 26 (5), 516-554 (2007).</li>
<li>Cruz, L., Chen, F. K., Ahmado, A., Greenwood, J., Coffey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+transplantation+and+its+role+in+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+And+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">RPE transplantation and its role in retinal disease.</a> Progress In Retinal And Eye Research. 26 (6), 598-635 (2007).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+human+iPS-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+transplantation+in+the+retinal+dystrophic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat.</a> PLoS One. 4 (12), e8152(2009).</li>
<li>Idelson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Klimanskaya, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+comparative+assessment+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+using+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation and comparative assessment of retinal pigment epithelium from human embryonic stem cells using transcriptomics.</a> Cloning Stem Cells. 6 (3), 217-245 (2004).</li>
<li>Krohne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+small+molecules+and+OCT4-reprogrammed+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4-reprogrammed human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (2), 96-109 (2012).</li>
<li>Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8, 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Algvere, P. V., Berglin, L., Gouras, P., Sheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+fetal+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration+with+subfoveal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232 (12 ), 707-716 (1994).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+age-related+macular+degeneration%3A+a+prospective+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (11), 4151-4160 (2004).</li>
<li>Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+autologous+retinal+pigment+epithelium+in+eyes+with+foveal+neovascularization+resulting+from+age-related+macular+degeneration%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study.</a> Am J Ophthalmol. 133 (2), 215-225 (2002).</li>
<li>Falkner-Radler, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+transplantation%3A+outcome+after+autologous+RPE-choroid+sheet+and+RPE+cell-suspension+in+a+randomised+clinical+study%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomised clinical study.</a> British Journal of Ophthalmology. 95 (3), 370-375 (2011).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+human-induced+pluripotent+stem+cell+%28iPS%29+grafts+in+a+preclinical+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+%28Cambridge%2C+Mass%29%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of human-induced pluripotent stem cell (iPS) grafts in a preclinical model of retinitis pigmentosa.</a> Molecular Medicine (Cambridge, Mass). 18, 1312-1319 (2012).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Safety+and+Function+of+RPE+from+Human+Embryonic+Stem+Cells+in+Preclinical+Models+of+Macular+Degeneration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Long-Term Safety and Function of RPE from Human Embryonic Stem Cells in Preclinical Models of Macular Degeneration).</a> Stem Cells. 27 (9), 2126-2135 (2009).</li>
<li>Peyman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation+for+age-related+macular+degeneration+secondary+to+extensive+subfoveal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for retinal pigment epithelium transplantation for age-related macular degeneration secondary to extensive subfoveal scarring.</a> Ophthalmic Surgery. 22 (2), 102-108 (1991).</li>
<li>Schwartz, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> The Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Wang, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89 (8), 911-919 (2010).</li>
<li>Cruz, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+receptor+tyrosine+kinase+gene+Mertk+in+the+retinal+dystrophic+RCS+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat.</a> Human Molecular Genetics. 9 (4), 645-651 (2000).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+functional+retinal+pigmented+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).</li>
<li>Hirami, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+retinal+cells+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Generation of retinal cells from mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Neurosci Lett. 458 (3), 126-131 (2009).</li>
<li>Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (39), 16698-16703 (2009).</li>
<li>Osakada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+by+small-molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction.</a> J Cell Sci. 122 (17), 3169-3179 (2009).</li>
<li>Carr, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+functional+analysis+of+phagocytosis+by+human+embryonic+stem+cell-derived+RPE+cells+using+a+novel+human+retinal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and functional analysis of phagocytosis by human embryonic stem cell-derived RPE cells using a novel human retinal assay.</a> Mol Vis. 15, 283-295 (2009).</li>
<li>Kokkinaki, M., Sahibzada, N., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem-Derived+Retinal+Pigment+Epithelium+%28RPE%29+Cells+Exhibit+Ion+Transport%2C+Membrane+Potential%2C+Polarized+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion%2C+and+Gene+Expression+Pattern+Similar+to+Native+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem-Derived Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Exhibit Ion Transport, Membrane Potential, Polarized Vascular Endothelial Growth Factor Secretion, and Gene Expression Pattern Similar to Native RPE.</a> Stem Cells. 29 (5), 825-835 (2011).</li>
<li>Westenskow, P., Friedlander, M. Ch. 111. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWestenskow%2C+P+%22The+New+Visual+Neurosciences%22">The New Visual Neurosciences</a>. Werne, J. S., Chalupa, L. M. , The MIT Press. Cambridge, MA. 1611-1626 (2013).</li>
<li>Westenskow, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (10), 6282-6290 (2012).</li>
<li>Algvere, P. V., Gouras, P., Dafgard Kopp,, E, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+outcome+of+RPE+allografts+in+non-immunosuppressed+patients+with+AMD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Long-term outcome of RPE allografts in non-immunosuppressed patients with AMD.</a> Eur J Ophthalmol. 9 (3), 217-230 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Bok, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+and+immune+response+in+the+subretinal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of retinal pigment epithelial cells and immune response in the subretinal space.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 39 (6), 1021-1027 (1998).</li>
<li>Gamm, D. M., Phillips, M. J., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+retinal+degenerative+diseases+with+human+iPS-derived+cells%3A+current+status+and+future+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+Of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Modeling retinal degenerative diseases with human iPS-derived cells: current status and future implications.</a> Expert Review Of Ophthalmology. 8, 213-216 (2013).</li>
<li>Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cell+modeling+of+Best+disease%3A+insights+into+the+pathophysiology+of+an+inherited+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration.</a> Hum Mol Genet. 22 (3), 593-607 (2013).</li>
<li>Buchholz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Fuhrmann, S., Levine, E. M., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+mesenchyme+patterns+the+optic+vesicle+during+early+eye+development+in+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick.</a> Development (Cambridge, England). 127 (21), 4599-4609 (2000).</li>
<li>Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+efficiently+direct+endodermal+differentiation+of+mouse+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 348-358 (2009).</li>
<li>Tucker, B. A., Anfinson, K. R., Mullins, R. F., Stone, E. M., Young, M. J. Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTucker%2C+BA+%22Stem+Cells+Transl+Med%22">Stem Cells Transl Med</a>. 2 (1), 16-24 (2013).</li>
<li>Ramsden, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+retinal+regeneration%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Stem cells in retinal regeneration: past, present and future.</a> Development (Cambridge, England). 140 (12), 2576-2585 (2013).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. -N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474 (7350), 212-215 (2011).</li>
<li>Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+into+retinal+pigment+epithelium-like+cells+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Protei.%2C+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts into retinal pigment epithelium-like cells by defined factors.</a> Protei., & Cell. 5 (1), 48-58 (2013).</li>
</ol>

לאף אחד מהמחברים אין גילויים מסחריים להצהיר עליהם.

בכתב יד זה אנו מתארים את הצעדים כדי ליצור ביעילות מספר גדול של תרבויות iPS-הרשתית טהורות. הראינו בעבר שימוש בפרוטוקול זה בבימויו בידול עם Activin שאנחנו יכולים ליצור iPS-הרשתית שמאוד דומה לhRPE מבוסס על transcriptomics, פרוטאומיקה, metabolomics, ופונקציונליות, וכי הם לעכב ניוון רשתית כאשר מושתלים בחולדות RCS 12,31,32 . תהליך יצירת iPS-הרשתית הוא גוזל זמן, אך לא מייגע (איור 1). ברגע שתרבויות iPS להגיע confluency הם חייבים להיות מוזנים עם תקשורת בידול על ...

סוגי התאים השונים המאכלסים את הרשתית מאורגנים בארכיטקטורה פונקציונלית. קולטני האור בחלק האחורי של הרשתית אחראים על המרת אור לדחפים חשמליים באמצעות פוטו-טרנסדוקציה. עם זאת, פוטו-טרנסדוקציה לא יכולה להתרחש ללא מאמצים מתואמים של סוגי תאים שכנים אחרים, כולל גליה מולר ותאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE). חד-שכבה של תאי RPE מפרידה בין הרשתית התחושתית, אספקת הדם העיקרית לקולטני האור, וממוקמת באופן אידיאלי לשליטה בתפקודים מרובים החשובים להומאוסטזיס של קולטני האור. למעשה, ה-RPE וקולטני האור כל כך תלויים זה בזה שהם נחשבים ליחידה פונקציונלית אחת. (לסקירה של כל הפונקציות המגוונות של RPE ראו שטראוס, 20051.) מוות או תפקוד לקוי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית יכולים לגרום לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), הגורם המוביל לאובדן ראייה קבוע במדינות מתועשות2-4. 
AMD היא מחלה רב-גורמית של RPE, קולטני אור וכלי הדם הכורואידליים; גורמי הסיכון מגוונים וכוללים שילובים של השפעות סביבתיות וגנטיות5,6. הטיפולים ב-AMD מוגבלים מאוד, אך טיפול פוטנציאלי מבטיח אחד הוא החלפת תאי RPE7,8. בעוד שהתוצאות היו מעורבות, להשתלת תאי RPE בחולי AMD (ובחולים אחרים עם ניוון רשתית) וגם במודלים של מכרסמים של ניוון רשתית, יש פוטנציאל למנוע באופן זמני ניוון משמעותי של קולטני אור9-23. (המודל החייתי הנפוץ למחקרים אלה הוא חולדות הקולג' המלכותי למנתחים (RCS), הנושאות מוטציה בגן MerTK. מוטציה זו הופכת את תאי RPE לבלתי מסוגלים לפגוציטוזה של מקטעים חיצוניים של קולטני אור ומעודדת ניוון רשתית24.) בעוד ששיעורי ההישרדות המדווחים של RPE מושתל בחלל התת-רשתית של חולדות ועכברים RCS משתנים מאוד, יש להם פוטנציאל לשרוד מספר חודשים או שנים9,10,12,20. 
ניתן להשיג תאי RPE במספרים מספיקים להשתלה על ידי הפקתם מתאי גזע פלוריפוטנטיים9-14,25-28. מספר קבוצות עצמאיות הוכיחו כי תאים אלה מתפקדים בדרכים דומות לעמיתיהם הסומטיים, ומחקרים ארוכי טווח מצביעים על כך שהם בטוחים עם השתלתם במודלים של מחלות חולדות ועכברים9,10,12,14,19,20,25,29-32. השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במקום בתאי גזע עובריים עשוי להיות יתרון מכיוון שניתן למנוע סוגיות אתיות ואתגרים אימונולוגיים הקשורים ל-RPE אלוגני33,34. יישום מרגש נוסף לטכנולוגיית iPS הוא מידול מחלות35. היכולת לחקור מספר גדול של תאי RPE שמקורם בחולים עם מחלות RPE יכולה להיות בעלת ערך רב להבנת הבסיס המולקולרי שלהם. מחקר מסוג זה בוצע לאחרונה עם חולת המחלה הטובה ביותר RPE ויכול לסלול את הדרך למחקרים דומים של מקולופתיות תורשתיות36. 
הפקת RPE מתאי גזע היא תהליך פשוט יחסית וניתן לעשות זאת לחלוטין בתנאים נטולי קסנו. האסטרטגיה הפשוטה ביותר היא להפיק חד-שכבות של תאי RPE באופן ספונטני, עם זאת, ניתן לשפר משמעותית את התפוקה באמצעות טכניקות התמיינות מכוונות. אך טכניקות אלה כוללות שימוש בגורמי חלבון אקסוגניים שיכולים להיות יקרים ולעתים קרובות נוצרים בחיידקים או במקורות אחרים שאינם אנושיים10,12,37. במחקרים שלנו עקבנו אחר פרוטוקולמבוסס 10 המשתמש בניקוטינאמיד ואקטיבין A, גורם איתות שהוכח כמספיק למפרט RPE38. כאן נדגים כי המולקולה הקטנה IDE-1 יכולה להחליף כראוי את Activin A, ובכך להפחית עלויות ולהקל על החששות הקשורים לשימוש בחלבונים רקומביננטיים39. בנוסף, אנו משתמשים בתחליף סרום נטול קסנו, ואנו מגדלים את תאי ה-RPE הממיינים על מצע סינתטי נטול קסנו. תאי RPE הוכחו בעבר כמתמיינים ביעילות רבה באמצעות גישה זו40.
כאשר מתמיינים כחד-שכבה, אנו מדמיינים מושבות פיגמנטיות המכילות תאי RPE כבר לאחר חמישה שבועות12. ברגע שהם מגיעים לגודל מספיק, ניתן לכרות אותם ידנית ולהעביר אותם למנה אחרת להרחבה. תאי RPE ידועים לשמצה בכך שהם מתמיינים עם כל מעבר, ויש להימנע משימוש בכל דבר בן יותר מחמישה מעברים (אנו מוצאים שמספר מספיק של תאים לאפיון והשתלה במודלים של בעלי חיים יכול להיווצר בקלות לאחר שניים או שלושה מעברים). לאחר התמיינות מלאה, אנו משתמשים במספר טכניקות כדי לאפיין את התאים מבחינה אנטומית ותפקודית כדי להבטיח שהם ישמשו כתחליף הולם ל-RPE חולה. התיאור של טכניקות אלה, והפרוטוקול להשתלת iPS-RPE בחלל התת-רשתית של מכרסמים, הם מעבר להיקף של מאמר שיטות זה ופורסמו בעבר12,32,41. 
בעוד שפיתוח פרוטוקולים סטנדרטיים לגזירה יעילה של iPS-RPE חשוב בבירור עבור המרפאות, יש גם עבודה פרה-קלינית משמעותית שעדיין צריכה להיעשות במודלים של בעלי חיים. ישנם חששות לגבי אימונוגניות של תאים שמקורם ב-iPS, ומספר טכניקות השתלה שונות, כולל השתלת תאים על מצעים מלאכותיים, נחקרות42,43. מסיבות אלה, אנו סבורים כי פרסום פרוטוקולים סטנדרטיים מועיל להקל על מחקרים קליניים ופרה-קליניים כאחד. במיוחד אם יבוצעו השוואות ישירות של תאי iPS-RPE שמקורם במעבדות שונות על ידי קבוצות מחקר שונות.

<table><tbody><tr><td>סכין קרנית&nbsp;</td><td>סכין Surgipro</td><td>SPOI-070</td><td>x 1</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 מ"ל x 4&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת מלח עם חוצץ פוספט של Dulbecco, 1X w/out Ca או Mg</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>500 מ"ל x 6</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, רגיל (מופעל בחום)</td> <td>VWR</td><td>45000-736</td><td>500 מ"ל x 1</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) טכנולוגיות חיים רקומביננטיות של חלבון אנושי</td><td></td><td>PHG0021</td><td>100 ומיקרו; g x 1</td></tr><tr><td>IDE-1</td><td>Stemgent</td><td>04-0026</td><td>2 מ"ג x 1</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>500 מ"ל x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum</td><td>Replacement Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>500 מ"ל x 1</td></tr><tr><td>L-גלוטמין 200 mM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>100 מ"ל x 1</td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות 100X&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>100 מ"ל x 1</td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N0636-100G</td><td>100 גרם x 1</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>20 מ"ל x 1</td></tr><tr><td>אקטיבין רקומביננטי לאדם/מורין/חולדה A&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>10 ומיקרו; g x 2</td></tr><tr><td>Synthemax-T משטח 6 צלחות באר</td><td>קורנינג</td><td>3877</td><td>מארז (12) x 1</td></tr><tr><td>אנזים TrypLE-Express (1X), ללא פנול אדום&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12604-021</td><td>500 מ"ל x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>מערכת מסנן ואקום/בקבוקי אחסון, 0.1&micro; נקבוביות, 500 מ"ל&nbsp;</td>מארז <td>431475 קורנינג</td><td></td><td>(12) x 1&nbsp;</td></tr></tbody></table>

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

לא נמצאה תרופה לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), הגורם המוביל לאובדן ראייה בקרב אנשים מעל גיל 55. AMD היא מחלה מולטי-פקטוריאלית מורכבת עם אטיולוגיה לא ידועה, אם כי רוב הסבורים שהיא מתרחשת עקב מוות או תפקוד לקוי של אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE), שכבה חד-שכבתית של תאים העומדת בבסיס הרשתית ומספקת תמיכה קריטית לקולטני האור. אסטרטגיות החלפת תאי RPE עשויות להיות מבטיחות מאוד לספק הקלה טיפולית לתת-קבוצה גדולה של חולי AMD, ותאי RPE הדומים מאוד לתאים אנושיים ראשוניים (hRPE) נוצרו במספר מעבדות עצמאיות, כולל שלנו. בנוסף, השימושים ב-iPS-RPE אינם מוגבלים לטיפולים מבוססי תאים, אלא שימשו גם למודלים של מחלות RPE. מחקרים מסוג זה עשויים לא רק להבהיר את הבסיס המולקולרי של המחלות, אלא גם לשמש ככלים יקרי ערך לפיתוח ובדיקה של תרופות חדשות. אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי להתמיינות מכוונת של RPE מתאי גזע. הוספת ניקוטינאמיד ואקטין A או IDE-1, מולקולה קטנה המחקה את השפעותיו, בנקודות זמן ספציפיות, משפרת מאוד את התפוקה של תאי RPE. באמצעות טכניקה זו אנו יכולים להפיק מספר רב של RPE במעבר נמוך תוך שלושה חודשים.

הצעדים המפורטים בכתב היד הזה, כפי שהוא מתואר באיור 1, יכולים לשמש כדי ליצור בקלות הרשתית מתאי גזע כפי שדווחו בעבר 10,12. לאחר שמירת קווי iPS במשך כמה שבועות, מושבות פיגמנט יתחילו להופיע במושבות לאחר 5-7 שבועות (תרבויות בן 7 שבוע מוצגות באיור 2 א-ג). מושבות אלה יכולים להמשיך לצמוח במשך שבועות כנשמרות התרבויות. ברגע שמגיע לגדלים מספיק, כפי שמוצג באיור 2 ד-F (תרבויות בן 8 שבוע), הם יכולים להיות נכרת באופן ידני כפי שמודגמים...

תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עשויים לשמש ליישומים מרובים, כולל טיפולים מבוססי תאים לניוון רשתית, מידול מחלות ומחקרי תרופות. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת RPE מתאי גזע.

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק באופן שחזורי אפיתל פיגמנט רשתית באיכות גבוהה, או RPE מתאי גזע. זה מושג על ידי גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים הניתנים להשראה לשטף משותף. בשלב השני, המדיה משתנה כדי לכוון את התאים לגורלות RPE.לאחר מכן, תאי ה-RPE מבודדים מהתאים הממוינים האחרים בצלחת, ואז התרביות מורחבות עד לקבלת מספר מספיק של תאים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפיגמנטציה הכהה ובמורפולוגיות המרוצפות של התרביות כדי לאשר שתאי RPE מגיעים להתמיינות סופנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בידול ספונטני, הוא שהוספת גורמים מוגדרים מאיצה את הבידול, הזמן ומגדילה את תפוקת ה-RPE.עד כה, אלפי מכרסמים נרפאו באמצעות תאי RPE, שמקורם במגוון IPSA של מחלות ניווניות ברשתית. עם זאת, אם אנו מתרגמים זאת ביעילות וביעילות לטיפול בבני אדם במרפאות עם מחלות אלו, זה הכרחי לחלוטין שנפתח פרוטוקולים מבוססים הניתנים לשחזור, שיספקו לנו מספרים גבוהים ואיכותיים של מכירות RPE ו- IPS הצגה חזותית של שיטה זו חיונית היא שרק אדם אחד יכול לעבוד במיקרוסקופ מתחת למכסה המנוע בכל זמן נתון, מה שהופך את שלב הבידוד לקשה לדמיון. מיטשל פרינס, טכנאי מחקר מהמעבדה שלי, ידגים כעת את הפרוטוקול הקשור להיבטי תרבית דיגיטלית של ההליך כדי לכוון את ההתמיינות של תרבית RPE שמקורה בתאי גזע, קו תאי הגזע המעניין על שכבה של תאי הזנה עובריים של עכבר בשני כפול 10 לששת התאים לבאר של צלחת שש בארות, אפשר למושבות להגיע לשטף COF ולאחר מכן לעבור להאכלות יומיות עם התמיינות.בינוני בתוספת ניקוטינאמיד. לאחר שלושה שבועות, התחל להוסיף פעיל ב-a או IDE להאכלות כדי לשפר את התמיינות ה-RPE. שבועיים לאחר מכן, חזור למדיום ההתמיינות ולניקוטינאמיד בלבד והפסיק את ההאכלה היומית.ברגע שמדדי ה-pH במדיום מפסיקים להצהיב יום לאחר ההאכלה, החזירו את התרבית לחממה עד להופעת לולאות של התאים הפיגמנטיים שגדולות מספיק כדי לחתוך ולהסיר. כדי לבודד את הלולאות הפיגמנטיות בשכבה הבאה, הבארות של צלחת 24 בארות עם מטריצה נטולת קסנו המחקה את סביבת התא הטבעית. לאחר מכן, מלאו כמה בארות של צלחת 24 הבארות באמצעי בידול לפי הצורך.ובמכסה מנוע של תרבית תאים, השתמשו במשקף חיתוך ובאזמל כדי לקצוץ כל עינית פיגמנטית בתחתית הצלחת המקורית לשתיים עד שש חתיכות ולתפוס את החלקים הפיגמנטיים בעזרת מלקחיים חדים ואז להעביר חתיכה פיגמנטית אחת עד שתיים לכל אחת.24. ובכן דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך שלושה עד חמישה ימים עד שהתאים נדבקים. לאחר מכן התחל להחליף את המדיה שלוש פעמים בשבוע.הרחב את התאים למשך שלושה עד ארבעה שבועות באמצעי ההתמיינות. המשך הזנת התאים שלוש פעמים בשבוע עד למעבר. ה-RPE מוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה של תאים שאינם טריפסין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים.לאחר חמש עד שמונה דקות, עצרו את התגובה עם אמצעי התמיינות טריים ולאחר מכן השעו מחדש את התרביות לתרחיפים של תאים בודדים עם פיפטה של 200 מיקרוליטר, תוך איגום המושבות עם מעט תאים. לאחר מכן, העבירו את המושבות המנותקות לצינורות של 15 מיליליטר וסובבו את התאים. Resus משהה את הכדורים בשלושה מיליליטר של מדיה התמיינות כל אחד מעביר את המושבות לכל באר של מטריצה מקודדת שש צלחת באר המכילה שלושה מיליליטר נוספים של אמצעי התמיינות לכל באר.לאחר מכן הרחב את התאים למשך שבוע עד שבועיים עד שהתאים יהיו בערך 90% מתכנסים ונתק את התאים שוב במיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה כפי שהודגם זה עתה. הפעם. בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להשעות מחדש את התאים, העבירו את תמיסת התא הבודד לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.ואז לאחר סיבוב התאים שוב, השעו את הגלולה. ב-18 מיליליטר של התמיינות, המדיה סוף סוף דוחקת את התאים במיכל תרבית מקודד מטריצה כדי להשיג את המספר המרבי של תאים רצויים במספר המעברים המינימלי להמשך ניתוח במורד הזרם, מושבות פיגמנטיות מתחילות להופיע לאחר חמישה עד שבעה שבועות של תרבית קו תאי גזע פלוריפוטנטיים הניתנים להשראה. מושבות אלה יכולות להמשיך לגדול במשך שבועות כאשר התרביות נשמרות.ברגע שהם מגיעים לגודל מספיק, ניתן לכרות אותם ידנית. כריתה זהירה כדי למנוע זיהום בתאים שאינם RPE מקלה מאוד על יצירת תרביות RPE טהורות מספיק. לאחר השליטה, ניתן להפיק מספר גדול של תאי RPE תוך שמונה עד 12 שבועות אם הטכניקה מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר לא לזהם את התרביות בזמן ייצור מדיה והזנת תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תקוותנו היא שרבים מכם יוכלו לייצר מספר רב של תאי RPE באיכות גבוהה מ- IPS. יש לקוות שזה יקל על תרגום מהיר יותר מהספסל לצד המיטה, ויציע טיפולים מבוססי תאים לחולים הסובלים ממחלות ניווניות ניווניות ברשתית שאינן ניתנות לטיפול כיום.

efficient-derivation-retinal-pigment-epithelium-cells-from-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון זה נדגים כיצד לבודד בתאי גזע הרשתית מן אפיתל ריסי העין העכבר לגדל אותם בתרבית כדי ליצור כדורים רשתית משובט. התחומים כי הם מבודדים להחזיק את המאפיינים העיקריים של בתאי גזע: התחדשות עצמית multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

MicroRNA (מירנה) הפרופילים של גזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS), אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) נגזרים מגזע אנושי-Induced pluripotent תאים (iPS) (iPS-RPE), ורשתית של העובר, הושווה.

פרופילי הביטוי microRNA של תאי iPS האנושי, רשתית פיגמנט האפיתל נגזר משב&quot;ס, ועוברי הרשתית פיגמנט האפיתל

כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

מטרת דו"ח זה היא לתאר את הפרוטוקולים לגזור את האפיתל רשתית פיגמנט (RPE) מתאי גזע pluripotent מושרה (iPS) באמצעות גדלים שונים של גופי embryoid.

תאים (iPS) נובע רשתית פיגמנט האפיתל (RPE) מגזע המושרה pluripotent על ידי בגדלים שונים של גופי Embryoid

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) מתאי גזע pluripotent. השיטה משתמשת בשילוב של גורמי גדילה מולקולות קטנות כדי לכוון את הבידול בתאי גזע לתוך RPE ילדותי בעוד 14 ימים ו- RPE בוגרת, פונקציונלי לאחר שלושה חודשים.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להבדיל תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית תאי גזע pluripotent האנושי הנושאים מוטציות נגזר החולה. הקווים המוטנטים תא עשוי לשמש עבור ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ. גישה זו מחלה-ב--תבשיל עוקף את הקושי של השגת תאי RPE אדם מקורי.

בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא מודל אידיאלי לחקר טיפולי תאי רשתית אנושית בשל הדמיון האנטומי והגנטי. כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית בעין NHP ואסטרטגיות למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים הקשורים למניפולציה מקולרית.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימור קריוגני יעיל של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע אנושיים.

שימור בהקפאה של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בשלב האופטימלי

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

למד פרוטוקול יעיל לגזירת תאי RPE מאיכות גבוהה מתאי גזע מושרים באמצעות גורמים מוגדרים. שיטה זו מאיצה את ההתמיינות ומגבירה את התפוקה ליישומים תרפויטיים ומחקריים.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

גלה סרטונים נוספים