גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיק באופן שחזורי אפיתל פיגמנט רשתית באיכות גבוהה, או RPE מתאי גזע. זה מושג על ידי גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים הניתנים להשראה לשטף משותף. בשלב השני, המדיה משתנה כדי לכוון את התאים לגורלות RPE.

לאחר מכן, תאי ה-RPE מבודדים מהתאים הממוינים האחרים בצלחת, ואז התרביות מורחבות עד לקבלת מספר מספיק של תאים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפיגמנטציה הכהה ובמורפולוגיות המרוצפות של התרביות כדי לאשר שתאי RPE מגיעים להתמיינות סופנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו בידול ספונטני, הוא שהוספת גורמים מוגדרים מאיצה את הבידול, הזמן ומגדילה את תפוקת ה-RPE.

עד כה, אלפי מכרסמים נרפאו באמצעות תאי RPE, שמקורם במגוון IPSA של מחלות ניווניות ברשתית. עם זאת, אם אנו מתרגמים זאת ביעילות וביעילות לטיפול בבני אדם במרפאות עם מחלות אלו, זה הכרחי לחלוטין שנפתח פרוטוקולים מבוססים הניתנים לשחזור, שיספקו לנו מספרים גבוהים ואיכותיים של מכירות RPE ו- IPS הצגה חזותית של שיטה זו חיונית היא שרק אדם אחד יכול לעבוד במיקרוסקופ מתחת למכסה המנוע בכל זמן נתון, מה שהופך את שלב הבידוד לקשה לדמיון. מיטשל פרינס, טכנאי מחקר מהמעבדה שלי, ידגים כעת את הפרוטוקול הקשור להיבטי תרבית דיגיטלית של ההליך כדי לכוון את ההתמיינות של תרבית RPE שמקורה בתאי גזע, קו תאי הגזע המעניין על שכבה של תאי הזנה עובריים של עכבר בשני כפול 10 לששת התאים לבאר של צלחת שש בארות, אפשר למושבות להגיע לשטף COF ולאחר מכן לעבור להאכלות יומיות עם התמיינות.

בינוני בתוספת ניקוטינאמיד. לאחר שלושה שבועות, התחל להוסיף פעיל ב-a או IDE להאכלות כדי לשפר את התמיינות ה-RPE. שבועיים לאחר מכן, חזור למדיום ההתמיינות ולניקוטינאמיד בלבד והפסיק את ההאכלה היומית.

ברגע שמדדי ה-pH במדיום מפסיקים להצהיב יום לאחר ההאכלה, החזירו את התרבית לחממה עד להופעת לולאות של התאים הפיגמנטיים שגדולות מספיק כדי לחתוך ולהסיר. כדי לבודד את הלולאות הפיגמנטיות בשכבה הבאה, הבארות של צלחת 24 בארות עם מטריצה נטולת קסנו המחקה את סביבת התא הטבעית. לאחר מכן, מלאו כמה בארות של צלחת 24 הבארות באמצעי בידול לפי הצורך.

ובמכסה מנוע של תרבית תאים, השתמשו במשקף חיתוך ובאזמל כדי לקצוץ כל עינית פיגמנטית בתחתית הצלחת המקורית לשתיים עד שש חתיכות ולתפוס את החלקים הפיגמנטיים בעזרת מלקחיים חדים ואז להעביר חתיכה פיגמנטית אחת עד שתיים לכל אחת.24. ובכן דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך שלושה עד חמישה ימים עד שהתאים נדבקים. לאחר מכן התחל להחליף את המדיה שלוש פעמים בשבוע.

הרחב את התאים למשך שלושה עד ארבעה שבועות באמצעי ההתמיינות. המשך הזנת התאים שלוש פעמים בשבוע עד למעבר. ה-RPE מוסיף 200 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה של תאים שאינם טריפסין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים.

לאחר חמש עד שמונה דקות, עצרו את התגובה עם אמצעי התמיינות טריים ולאחר מכן השעו מחדש את התרביות לתרחיפים של תאים בודדים עם פיפטה של 200 מיקרוליטר, תוך איגום המושבות עם מעט תאים. לאחר מכן, העבירו את המושבות המנותקות לצינורות של 15 מיליליטר וסובבו את התאים. Resus משהה את הכדורים בשלושה מיליליטר של מדיה התמיינות כל אחד מעביר את המושבות לכל באר של מטריצה מקודדת שש צלחת באר המכילה שלושה מיליליטר נוספים של אמצעי התמיינות לכל באר.

לאחר מכן הרחב את התאים למשך שבוע עד שבועיים עד שהתאים יהיו בערך 90% מתכנסים ונתק את התאים שוב במיליליטר אחד של תמיסת דיסוציאציה כפי שהודגם זה עתה. הפעם. בעזרת פיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להשעות מחדש את התאים, העבירו את תמיסת התא הבודד לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

ואז לאחר סיבוב התאים שוב, השעו את הגלולה. ב-18 מיליליטר של התמיינות, המדיה סוף סוף דוחקת את התאים במיכל תרבית מקודד מטריצה כדי להשיג את המספר המרבי של תאים רצויים במספר המעברים המינימלי להמשך ניתוח במורד הזרם, מושבות פיגמנטיות מתחילות להופיע לאחר חמישה עד שבעה שבועות של תרבית קו תאי גזע פלוריפוטנטיים הניתנים להשראה. מושבות אלה יכולות להמשיך לגדול במשך שבועות כאשר התרביות נשמרות.

ברגע שהם מגיעים לגודל מספיק, ניתן לכרות אותם ידנית. כריתה זהירה כדי למנוע זיהום בתאים שאינם RPE מקלה מאוד על יצירת תרביות RPE טהורות מספיק. לאחר השליטה, ניתן להפיק מספר גדול של תאי RPE תוך שמונה עד 12 שבועות אם הטכניקה מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר לא לזהם את התרביות בזמן ייצור מדיה והזנת תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תקוותנו היא שרבים מכם יוכלו לייצר מספר רב של תאי RPE באיכות גבוהה מ- IPS. יש לקוות שזה יקל על תרגום מהיר יותר מהספסל לצד המיטה, ויציע טיפולים מבוססי תאים לחולים הסובלים ממחלות ניווניות ניווניות ברשתית שאינן ניתנות לטיפול כיום.