בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיופיברובלסטים ראשוניים מוושט עכבר ואדם. זה מושג על ידי קצירת כל הוושט מהעכבר הנולד התורם עם רקמה אנושית. הרירית מופרדת מהשריר הפרופרי

השלב השני הוא לטחון את הרקמה ולשטוף מספר פעמים ב- HBSS. לאחר מכן, הרקמה מתעכלת עם דיס קולגנאז וטוחנת עוד יותר ומשחררת את התאים המזנכימליים יחד עם אפיתל מחובר. אוכלוסיית התאים ההטרוגנית מתורבתת לאחר מכן במדיה מיופיברובלסטים שבה מיופיברובלסטים נדבקים בעוד שתאי האפיתל אינם שורדים ונשטפים.

בסופו של דבר, אימונוכימיה וזרימה ציטומטרית משמשות כדי לאשר שהתאים בתרבית ראשונית הם מיופיברובלסטים. מי שידגים את הנהלים יהיו אני, מתיו גרגס, טכנאי, וצ'או ניו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי, טורי. לאחר המתת חסד של עכבר בן שמונה עד 12 יום, הצמידו את הצד הגבי של החיה והרטיבו את פני הגחון עם 70% אתנול.

לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, תפוס והרם את העור הקדמי לפתח השופכה. חותכים לאורך קו האמצע הגחוני מפתח השופכה ועד הסנטר. חותכים רק את העור.

לאחר מכן בצע חתכים מפתח השופכה לברכיים, ויוצר Y הפוך.לאחר החתכים בברכיים, בצע חתכים משני צידי כלוב הצלעות. לאחר השלמת החתכים, יש לקלף בזהירות את העור ולהניח אותו בצד. כעת הרם את הצפק וחתוך אותו עד לסרעפת ולכלוב הצלעות.

שמור את המספריים מכוונים כלפי מעלה כדי למנוע נזק לתוכן התוך-חזה והבטן. לאחר מכן הרם בעדינות את האונה השמאלית של הכבד כדי לחשוף את הקיבה הבסיסית, צומת הקיבה של הוושט ואת החלק הבטני של הוושט באמצעות מספריים כירורגיים שנחתכו לאורך קו האמצע של עצם החזה וכלוב הצלעות עד לחגורת צוואר הרחם. שוב. בכך, הרחיקו את המספריים בזווית מהאיברים הבסיסיים.

לאחר מכן משוך הצידה את כלוב הצלעות כדי לחשוף את תוכן חלל בית החזה. כעת הסר בעדינות את הלב ואת שתי אונות הריאות. השתמש באפליקטורים מכותנה כדי לספוג את הדימום לפי הצורך.

הוושט החזי הוא צינור צר וגמיש האחורי לקנה הנשימה וקדמי לחוליית בית החזה. בילודים, מצא את צומת הקיבה של הוושט כדי לזהות את הוושט מהקיבה. באופן בוטה, נתח את כלי הדם המקיפים את הוושט, כולל רקמת שומן ומזנטריה, עד למקור הוושט בחלל צוואר הרחם.

כעת כרתו את כל אורך הוושט והעבירו אותו ל- HBSS צונן אם תרצה. כמו כן, הסר חלק מהקיבה למטרות התמצאות. התחל פרוטוקול זה על ידי טחינת שברי ריריות המתקבלות מרקמת עכבר או אדם ב-HBSS בצינור מיקרו-פוגה של 1.7 מיליליטר או צינור של חמישה מיליליטר בהתאמה.

כעת, כאשר משיגים תאי סטרומה בוושט אנושי, חשוב להפריד את הרירית מהשריר הבסיסי על ידי דיסקציה חדה. כעת בצינור מטביע עוד יותר את הרקמה לשניים עד שלושה מילימטר בעזרת מספריים עדינים. לאחר ששבר רירית הוושט משקע מתרוקן לאט לאט, HBSS נזהר לא להשליך את הרקמה בטעות.

אתה יכול גם להשתמש בפיפטה עם קצה גדול כדי להסיר HBSS נוסף. לאחר מכן הוסף HBSS טרי. מערבבים את הצינור בניעור עדין ומניחים לרקמה להתייצב.

לאחר שהתיישב, יש לשפוך שוב את ה-HBSS ולחזור על הכביסה הזו. צעד שמונה פעמים בסך הכל. לאחר שמונה השטיפות, דגרו את הרקמה עם קולגנאז 11 ודגרו על רקמת עכברים עד 25 דקות על שייקר נדנדה המוגדר במהירות איטית ובטמפרטורת החדר.

באותם תנאים, דגרו רקמה אנושית למשך שש שעות. לאחר העיכול, מערבבים את הרקמה עוד יותר בעזרת מספריים עדינים, ואז מצנטריפוגה את הרקמה בחום של 200 גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושפכו את הרקמה הגלולה לצינור נקי של 1.7 מיליליטר.

לאחר מכן מתחת למכסה המנוע של תרבית הרקמה, שטפו את התאים חמש פעמים ב-DMEM עם 2% סורביטול כדי לחסל את התאים הלא ברי קיימא ופסולת אחרת. עבור כל שטיפה, אפשר לתאים להתיישב על ידי כוח הכבידה ולשפוך את תמיסת הכביסה. לאחר השטיפות, זרעו את התאים לשלוש בארות מתוך שש.

ובכן צלחת ותרבית אותם בוואקום מסוננים בתוספת DMEM. רקמה אנושית עשויה לדרוש יותר בארות או צלחות, בהתאם לגודל תרבית הדגימה, התאים, עד שהבארות מתכנסות ב-80%. לאחר מכן העבירו תחילה את תאי ההיצמדות לצלוחיות T 25, השתמשו ב-0.05% טריפסין ב-EDTA כדי לעקור את התאים.

לאחר מכן הוסף מדיה כדי לנטרל את התגובה. אוספים את התאים שנעקרו לתוך צינור צנטריפוגה. לאחר מכן סובב את התאים ב-400 G כדי לאסוף אותם תחת מיקרוסקופ.

התבונן במורפולוגיה בצורת ציר של התאים הדבקים כדי להבחין בין תאי הסטרומה המתורבתים לתאי שריר צביעה חיסונית עבור דזמונד. באמצעות פרוטוקול סטנדרטי, צלחת לזמן קצר 15,000 תאים בארבע מגלשות תא באר וגידול במדיה מיופיברובלסטים למשך 24 שעות. למחרת, תקן את התאים ולאחר מכן לפני הפעלת הנוגדן הראשוני לחסום את התאים הקבועים עם סרום עזים 5% ב-PBS, יש לדלל גם נוגדנים ראשוניים וגם משניים בסרום עיזים 5%.

דגירה עם נוגדן ראשוני בטמפרטורת החדר או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS לאחר השטיפות. מוסיפים את הנוגדנים המשניים ודוגרים על התאים למשך שעה.

בטמפרטורת החדר, השתמש בשלוש שטיפות ב-PBS כדי להסיר את הנוגדנים המשניים. לאחר מכן ניתן לנתח את התאים המוכתמים לאחר השטיפות. החל DPI עם אמצעי הרכבה והחלקת כיסוי כדי לבסס את טוהר תאי הוושט.

בדוק אותם עבור סמני פני שטח של תאי המטופויאטיקה ואנדותל. באמצעות ציטומטריית זרימה. גדל מספרים מספיקים בצלוחיות תרבית עד שיהיו מוכנים לאיסוף.

לאחר מכן נתק את תאי הסטרומה של הוושט של העכבר המתורבת באמצעות תמיסת דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בעקבות האיסוף שלהם. שטפו את התאים עם מאגר פקס פעמיים וספרו את התאים.

כעת שימוש בהליך צביעה סטנדרטי צביעה עם CD 45 לזיהוי תאים חיסוניים וצביעה עם CD 31 לזיהוי תאי אנדותל, ואז להעביר את התאים דרך ציטומטר הזרימה. תאי סטרומה בוושט בודדו באמצעות עיכול מכני ואנזימטי וגודלו בשש צלחות באר תוך שעות מהציפוי. התאים היו בתרחיף מעורב שהודבק באופן רופף לצלחת.

במהלך 24 השעות הבאות, תאים בצורת ציר נבטו מתרחיף התא ונדבקו היטב לתחתית הצלחת. תאים אלה כיסו את כל הבאר תוך חמישה ימים ועברו בהצלחה תוך שמירה על המורפולוגיה שלהם לפחות 15 מעברים שנראו כאן, התאים נמצאים בצפיפות נמוכה. אלה הם התאים בצורת ציר ליד שטף משותף, צביעה חיסונית של תרביות ראשוניות של תאי סטרומה בוושט.

גידול בשקופיות תא הראה ביטוי שופע של סמני שלד מיופיברובלסטים. טוהר תרביות אלפא, SMA ומנטון הוערך על ידי ציטומטריית זרימה. פיזור קדימה וצדדי נקבעו עבור תאי סטרומה ראשוניים של הוושט, ואחריו שער וניתוח של תאים חיים עבור חלבוני פני התא.

תאי סטרומה ראשוניים של הוושט חסר ביטוי של CD 45 המטופויאטי וחסר ביטוי של סמני פני השטח של תאי CD 31 אנדותל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להקים תרביות ראשוניות של מיופיברובלסטים מוושט עכבר ואדם. כן.