פונקצית phenotyping עכבר ריאתי In vivo עם קיבולת הריאות לשדר
January 6th, 2015
אנו מתארים אמצעי למדידה מהירה ופשוטה של יכולת פיזור הריאות בעכברים ומראים שהוא רגיש מספיק לשינויים פנוטיפיים בפתולוגיות ריאה נפוצות מרובות. מדד זה מביא אפוא רלוונטיות תרגומית ישירה למודלים של העכברים, מכיוון שיכולת פיזור נמדדת בקלות גם בבני אדם.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ללמוד כיצד למדוד את יכולת הפיזור של הריאות של עכבר באמצעות כרומטוגרף גז מכויל. זה מושג על ידי ניפוח הריאות של עכבר מורדם בגז המכיל ניאון ופחמן חד חמצני, החזקת הגז בריאות למשך תשע שניות ואיסוף הגז. הגז שנשאב מהריאות מדולל לאחר מכן לשני מיליליטר ומוזרק לכרומטוגרף הגז.
הספיגה הדיפרנציאלית של ניאון ופחמן חד חמצני בריאה משמשת לחישוב יכולת הפיזור. ניתן להשתמש במדידה זו כדי להעריך את אובדן תפקוד הריאות בספקטרום רחב של מודלים של מחלות ריאה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני כל השיטות הקיימות האחרות למדידת תפקוד ריאתי בעכבר הוא שמדובר במדידה פשוטה מאוד הניתנת לשחזור שניתן להשוות ישירות למדידות דומות בבני אדם.
ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר השינויים במבנה הריאות המתרחשים במגוון פתולוגיות ריאה. פרוטוקול זה מתחיל בהגדרת מודול כרומטוגרף הגז המסופק עם המכונה למדידת שיאים עבור חנקן, חמצן, ניאון ופחמן חד חמצני. עבור יישום זה, יש צורך רק בנתוני הניאון והפחמן החד-חמצני.
המכשיר משתמש בעמוד מסננת מולקולרית עם הליום כגז הנושא. לכרומטוגרף הגז הספציפי הזה יש עמודה של 0.8 מיליליטר ודגימה של שני מיליליטר משמשת כדי להבטיח פינוי נאות של עמודה זו לפני שמתחילים. סדרה של מדידות תמיד מכיילת את המכונה באמצעות שני מיליליטר גז ישירות משקית דגימת הגז.
השיא הראשון שמופיע הוא הניאון, ואז חמצן וחנקן, שאיננו מודדים עבור הליך זה. לבסוף, שיא הפחמן החד-חמצני מופיע בזמן לכרומטוגרף הגז. למדוד את כל הפסגות הללו זה קצת פחות מדקה אחת.
כדי להתחיל, יש להרדים את העכברים עם קטמין וקסילזין. אשר את ההרדמה על ידי היעדר תנועת רפלקס בתגובה לצביטה בבוהן. לאחר מכן, כדי להגן על העיניים, יש למרוח משחה וטרינרית, ואז טרכאוסטומיה של העכברים בעזרת צינורית סטודן.
השתמש בצינורית 18 למבוגרים או בצינורית 20 לעכברים צעירים מאוד. לאחר מכן, הפעל את המטרונום עם לחיצות נשמעות כל שנייה. עבור עכברים מעל שישה שבועות, השתמש במזרק של שלושה מיליליטר כדי להוציא 0.8 מיליליטר גז משקית תערובת הגז.
אם העכבר בן פחות מארבעה שבועות, השתמש ב 0.4 מיליליטר גז, ואז חבר את המזרק לצינורית קנה הנשימה ונפח במהירות את הריאות. התחל לספור מנטלית מ-1 עד 10 בסנכרון עם לחיצות המטרונום. כאשר הספירה מגיעה ל -10, משוך במהירות את הנפח של 0.8 מיליליטר.
לדלל את הגז הננשף הזה לשני מיליליטר על ידי הוספת מקום, אוויר ומשקל לפחות 15 שניות. חשוב מאוד לנפח ולרוקן את הריאות במהירות האפשרית. ניפוח מהיר הוא קל מאוד, אך נדרש מעט תרגול כדי למשוך במדויק את ה-0.8 מ"ל במהירות, ואז להזריק את כל הדגימה לתוך כרומטוגרף הגז.
לצורך ניתוח, חשוב להימנע מזיהום של הדגימה בעת העברה אל החיה וממנה ואל כרומטוגרף הגז. ניתן לעשות זאת בזהירות על ידי כיסוי השלט באצבע בזמן שה-GC מודד את הדגימה. נפחו את ריאת העכבר בעוד 0.8 מיליליטר של תערובת גז מהשקית, ולאחר מכן עבדו את הדגימה הזו באופן זהה לראשונה.
בעזרת הערכים הממוצעים משתי המדידות, חשב את ה-DFCO. הכתב התחתון C מתייחס לגזי הכיול, והתשעת מתייחס לדגימות שנאספו מהחיה. אחרי עצירת נשימה של תשע שניות.
ערך DFCO בקרה נומינלי שנלקח משישה עכברים שחורים C 57 הוא כ-0.77. במחקר שהשתמש במודל שפעת PR 8, אובדן תפקוד מתקדם נצפה ביום השישי והשמיני במודל של אמפיזמה 21 יום לאחר התקנת אלסטזות. ה-DFCO ירד במידה מתונה, אך היו שינויים גדולים בהרבה במודל הפיברוזיס שנגרם על ידי התקנת Blio Mycin.
המסלול הפיברוטי שנגרם על ידי בלאומיצין הביא לשינוי הגדול ביותר ב-DFCO שנצפה בכל אחד מהמודלים הפתולוגיים. זה חשוב מכיוון שיכולת הפיזור היא גם סמן אמין לפיברוזיס בבני אדם. הגן CFTR ממלא תפקיד מכריע בסיסטיק פיברוזיס ובמחקר על עכברים חסרי גן זה, חלה ירידה משמעותית ב-DFCO.
ה-DFCO ירד עוד יותר עם זיהום פטרייתי בעכברי נוקאאוט אלה. מודל נפוץ לפגיעה ריאתית נגרם על ידי LPS. בעכברים שנחשפו ל-LPS, היה אובדן מתקדם תלוי זמן של תפקוד הריאות מהיום הראשון עד הרביעי כפי שהוערך על ידי מדידות DFCO, מדידת DFCO יכולה להתבצע בהצלחה בעכברים החל מגיל שבועיים.
הגודל הקטן יותר של הריאה דורש נפח ניפוח קטן יותר של 0.4 מיליליטר. ה-DFCO שנמדד בנפח קטן יותר זה מסוגל להראות את העלייה הצפויה ככל שהריאה מתבגרת לאחר שליטה. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך דקות ספורות לכל עכבר לפני ביצוע מדידות או הערכות אחרות של תפקודי הריאות.
בזמן ניסיון הליך זה חשוב להקפיד לבצע את שלב הניפוח והדפלציה במהירות ולהקפיד על העברת הדגימה כדי למנוע זיהום.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר שיטה למדידת יכולת הפיזור של הריאות בעכברים באמצעות כרומטוגרף גז מכוייל. הטכניקה רגישה לשינויים בפנוטיפ בפתולוגיות ריאה שונות, מה שהופך אותה לרלוונטית למחקר תרגומי.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- פיזיולוגיה של הנשימה
- מחקר תרגומי
רקע
- יכולת פיזור הריאות היא מדד קריטי לתפקוד ריאתי.
- שיטות קיימות למדידת תפקוד הריאות בעכברים יכולות להיות מורכבות.
- מחקרים השוואתיים בין עכברים לבני אדם חיוניים עבור רלוונטיות תרגומית.
- יש צורך בטכניקות פשוטות וניתנות לשחזור למחקר יעיל.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה פשוטה למדידת יכולת הפיזור של הריאות בעכברים.
- להעריך את אובדן תפקוד הריאות ברחבי מודלי מחלות ריאה שונים.
- לאפשר השוואת מדידות תפקוד ריאתי בין עכברים לבני אדם.
שיטות בשימוש
- ניפוח ריאות של עכברים מורדמים עם תערובת גזים המכילה ניאון ופחמן חד-חמצני.
- שמירת הגז בריאות במשך תשע שניות לפני האיסוף.
- דילול הגז שנאסף לשני מיליליטר לצורך ניתוח.
- שימוש בכרומטוגרף גז למדידת ספיגה דיפרנציאלית של גזים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מספקת מדידה אמינה של יכולת הפיזור של הריאות.
- היא רגישה לשינויים בתפקוד הריאות הקשורים לפתולוגיות שונות.
- הטכניקה פשוטה וניתנת לשחזור, מה שמגדיל את יישומיותה במחקר.
- ניתן להשוות את התוצאות ישירות עם מדידות דומות בבני אדם.
מסקנות
- שיטה זו מציעה כלי חשוב להערכת תפקוד הריאות במודלי עכברים.
- היא תומכת במחקר תרגומי על ידי גישור מדידות בין עכברים לבני אדם.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור פתולוגיות ריאה בצורה יעילה יותר.
