Name: ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למדו הדמיה תוך-חייתית בשני פוטונים לחקירת אינטראקציות בין מיקרוגליה ומונוציטים בעכברים בעקבות פגיעה בעמוד השדרה. השיטה מאפשרת תצפית בזמן אמת של תנועת תאים ותגובות דלקתיות במערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הסוכנויות הבאות סיפקו תמיכה כספית קריטית למחקר זה: MSTP T32 GM007250 (T.A.E.), 5T32EB7509 (D.S.B.), NCI R01 CA154656 (A.Y.H.), קרן דנה (A.Y.H.), קרן סנט בולדריק (A.Y.H.), קרן דוכן הלימונדה של אלכס (A.Y.H.), קרן המלאך של גבריאל (A.Y.H.) ותוכנית יונדאי הופ-על-גלגלים (A.Y.H). המחברים אסירי תודה על עזרתם ההכרחית של ג'רי סילבר ושרה בוש בלימוד פציעת ריסוק עמוד הגב (DCC). המחברים אסירי תודה גם לג'ינגצ'ואנג יו, אליזבת הייר והונגמיי הו על העזרה הטכנית בגנוטיפ ולרוס אנדרסון על הרכבת היחידה לייצוב עמוד השדרה.

למחברים אין מה לחשוף.

אינטראקציות הדמיה סוגי תאים שונים בתאי רקמת מולדתם של שבהתפתח פתולוגיה בזמן אמת יצרו עניין רב. בתוך הרשת הצפופה של מערכת העצבים המרכזית, קשר תאי תאים ואיתות עם תאים סמוכים חיונית לתפקוד תקין ולהבנת הפתולוגיה של מערכת העצבים המרכזית. כאן, אנו תיארנו את השימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר 2-פוטון לתצפית של תנועה הסלולר בתוך נגע מכאני בחוט השדרה. בנוסף לאיכות של הכנת הניתוח ורקמה, יציבות מכאנית של הרקמה היא בעל חשיבות עליונה למיקרוסקופיה זמן לשגות מוצלחת, במיוחד הבידוד של חוט השדרה מנשימת חפץ בתנועה. יציבות ניתן להעריך על ידי מחפש תנועה של חוט השדרה תחת מיקרוסקופ לנתח שמתאים לקצב הלב או הנשימה של בעלי החיים. יציבות יש לבחון גם בעת ביצוע הניתוח וגם מייד לפני תחילת הדמיה. אם האנימהl הוא לא יציב, התאמות צריכות להיעשות כדי ההשמה והאטימות של מלחציים חוט השדרה. מודלים של עכברי כתב ניאון ספציפי תא מסוג בשילוב עם גישות הכימרה מח העצם אפשרו זיהוי של תאי monocytic לעומת מיקרוגליה ואקסונים. מחקרים קודמים גילו כי מיקרוגליה מונוציטים בדם נגזר ולא אחראים לנזק axonal המשני לאחר טראומה באמצעות המתודולוגיה שתוארה כאן 43. צבע כלי מצומדות dextran מאפשר זיהוי כלי שני לספק ציוני דרך ולזהות פרצות בשלמות כלי דם. הבחירה של מודל עכבר כתב הניאון המתאים היא קריטית כדי לאפשר זיהוי הנכון של סוגי התאים הרצויים להיות צילם. פיתוח דגמי עכבר ניאון המתאימים למחקרים המתבצע גם קריטי להצלחה של ניסויים. הבחנה בין שתי אוכלוסיות phagocytic של CX3CR1 + / GFP </sup&gt; תאים במערכת העצבים המרכזית היו קשים באופן מסורתי. כפי שניתן לראות כאן, טכניקה נפוצה חיסונית, מפלצות קרינה, יכולה להיות מנוצלת כדי להבחין, מיקרוגליה CNS-תושב רדיו עמיד ממקרופאגים נגזרות מח העצם. יש הליך הקרנת הפוטנציאל לפגוע במחסום דם המוח ולשנות פנוטיפים תאים, ולכן שימוש במודל זה יש לשקול בזהירות. שינויים אלה במידה שונה עם מינון קרינה, כמו גם משך תקופת החלמה, וההשפעה שלהם על דגמים דלקתיים שונים לא נחקרה באופן מלא. ההשפעות של קרינה על מחסום דם מוח CNS ניתן למזער על ידי מגן הראש במהלך הקרנה, וזה הוכח להפחית חדירת תא אל חוט השדרה לאחר הקרנה, גם אם חוט השדרה הוא לא ישירות מוגן 52. כאן יש לנו ציינו כי מספר התאים שחדרו למערכת העצבים המרכזית במצב יציב כתוצאה מדור הכימרה הוא חסר משמעות בניגוד לתחושהאה של תאי הזנת הנגע. מודלים חלופיים אחרים לשקול לכלול מפלצות בהשפעת סמים או 52 מודלים של עכברי parabiotic 53. הנה, יש לנו הצגנו מודל פציעה קטן ספציפי, פשוט ושחזור כי תוצאות בנגע לחומר לבן גב של חוט השדרה שהוא קל לתמונה באמצעות מיקרוסקופיה 2-הפוטון. שיטה זו מספקת גם נגע לכימות לassay מידת dieback axonal בעמודות הגבי שבספרות כבר בשילוב עם 16,18,43,48,54 ניתוח רקמות קבועות משלימים. במודל זה, בעלי חיים להציג רק גירעונות מינימאליים ואין צורך בטיפול מיוחד לאחר פציעה. מחקרים עתידיים ניצול טכניקות פציעה למחוץ טור והדמיה הגב המתואר כאן עשויים להיות כלי מיון רבי עוצמה כדי להעריך את היעילות של טיפול בפגיעה בחוט השדרה. טיפולים אלה עשויים לכלול מעכבים קטנים מולקולה, תרופות, מוצרים סלולריים, שתלי רקמה וטיפול קומבינטוריתs. יחסי הגומלין בין מקרופאגים, מיקרוגליה ונוירונים הם גם צפוי לשחק תפקיד בדגמים אחרים מחלה בחוט השדרה, כוללים טרשת נפוצה, גידולים, דלקת קרום מוח וטרשת לרוחב amyotrophic, וטכניקה זו עשויה להיות שימושית במחקר של מחלות אלו, כמו גם .

התגובה הדלקתית למחלה או פציעה במערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא הבין היטב, במיוחד בכל הקשור ליחסי הגומלין בין תאי מערכת חיסון ותושב בתוך הרקמה. חקירות של אינטראקציות הסלולר אלה בחוט השדרה הן בעלי עניין מיוחד בחי. בדרכי העניין רק נגישות בקלות במערכת העצבים המרכזית הלבנות היא בעמודות הגבי של חוט השדרה, מה שהופך את זה תחום חשוב שבו יש למקד את המאמצים בשיפור גישה ניסויית אפשרית. חקירות אלה היו מוגבלות בשל הקושי הטכני בגישה ולייצוב מערכת העצבים המרכזית להדמיה. הדמיה לחיות בחוט השדרה שתוארה תנועה סלולרית בעבר 1-13, עם זאת, מספר המחקרים התייחסו בפגיעה בחוט השדרה מעבר לכמה שעות אחרי העלבון הראשוני. נגע חוט השדרה הטראומתי הוא סביבה מורכבת, עם תאי עצב, האסטרוציטים, fibroblasts, ותאי NG2, ותאי חיסון including מיקרוגליה, נויטרופילים, מקרופאגים, תאי T, תאי B ותאים דנדריטיים 14,15. המקרופאגים הם תת-הקבוצה של תאי מערכת חיסון אחראים לphagocytosis בנגע, שחדרו מהמחזור. תפקידם של תאי phagocytic אלה כבר התווכח, עם דיווחים מצביעים על כך שתאים אלה יכולים לקחת על שני תפקידים מזיקים ומגן ברקמה הפגועה. תפקידים אלה נעים בין הגדלת dieback axonal המשני לאחר פציעה ופועל באופן phagocytic 16-22, לוקח על ריפוי פצע פנוטיפ, ולהקטין את גירעונות תפקודיים בבעלי החיים הפצועים 21,23,24. בעבר, מנסה להבחין מקרופאגים ממיקרוגליה הסתמכו בעיקר על מורפולוגיה ברקמה בריאה. עם זאת, מיקרוגליה ומקרופאגים מופעלים להביע רבים מאותו הסמנים ולהציג מורפולוגיה נבדלה לאחר פציעת 25-29, מה שהופכים את ההפרדה של פעילויות שונות של תאים אלה קשים ללמוד based בגורמים אלה לבד 30. ניתן להפריד תאים אלה על ידי ביטוי ההפרש של CD45 באמצעות זרימת cytometry 33,34, למרות שגישה זו היא פחות שימושית באפליה מסוג התא בגוף חי. ביטוי ההפרש ניצול של CCR2 וCX3CR1 במיקרוגליה ומקרופאגים גם נחקר, למרות שהשינויים הדינמיים בביטוי של סמנים אלה כמונוציטים להתמיין מקרופאגים יכולים לסבך ניתוח מדויק 35,36. Microglia הם התאים חיסוניים התושב במערכת העצבים המרכזית ונובע מאבות שק החלמון במהלך התפתחות עוברית, בעוד מקרופאגים נגזרים מאבות מח עצם ולהיכנס למערכת העצבים המרכזית הפצועה לאחר עלבון 31,32. גישה חלופית לשימוש במורפולוגיה להבחין בין שני סוגים אלה התא היא להחליף את מוח העצם עם אבות מבעלי חי תורם להביע סמן למעקב במקרופאגים נגזרו מאבות התורם, תוך שמירה על תושב CNS, recipהנגזר ient מיקרוגליה. המודלים chimeric מח עצם אלה נמצאים בשימוש נרחב ביישומים רבים אחרים 37-40. לשיטה זו אזהרות ייחודיות הקשורים לפגיעה בשלמות מחסום דם-המוח הנגרם על ידי תרופות קרינה או רעילות לתאים המשמשות למיגור אבות מח במארח, ובכך להגביל את השימוש שלה ביישומים מסוימים. לאחרונה, הבחנות פונקציונליות בין microglia ומקרופגים במערכת העצבים המרכזית מתחילות להבחין באמצעות cytometry זרימה, ניתוח מערך שבבי גן ושיטות chimerism 24,26,41-44, אשר תוכיח מאוד שימושי בעתיד. למרות מפריד בין שני סוגי התאים עדיין קשה, הבנת הפונקציות הייחודיות שלהם היא חשובה שבהוביל לטיפולים ממוקדים יותר של הפרעות שכוללות שני מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך מערכת העצבים המרכזית. תיאור של אינטראקציות הסלולר בתוך נגע חוט השדרה הגיע בעיקר ממחקרים שכלל דגמי תרבית תאים. זה דue לאתגרים כרוכים בהדמיה הן נגע חוט השדרה ותאי חיסון יחד בחי. מודלים של מכרסמים הנוכחיים של פגיעה בחוט השדרה של סוג וחומרה שונים כוללים דגמי חבלה 45,46, פציעות דקירת סיכה 2, חתך 47, ולפציעתם למעוך עמודה הגבית שתוארה כאן 16,18,48. דלקת בקרומי המוח עולה עם חומרת פציעה ומציבה אתגרים ייחודיים להשתלה של חלונות או ניתוחים להדמיה סידורי. חלק מאתגרים אלה כוללים חדירה של תאי phagocytic, כמו גם את הדור של רקמה סיבית על האתר כירורגית. חלק מנושאים אלה ניתן להתגבר על ידי יצירת נגעים קטנים ומכסה את חוט השדרה החשוף ברוטב כירורגית שאינו חיסוני בין הדורה ושרירי paraspinous כדי לאפשר לניתוח פתיחה מחדש לאחר מכן, כפי שנעשה כאן כדי ללמוד את הפציעה למחוץ עמודה הגבי . יכולת תמונת החלק הגבי בלבד של הספיןכבל אל גם מגביל את הבחירה של פגיעה, שכן דגמי חבלה בעיקר לגרום לניזק לחוט המרכזי, לעתים קרובות חוסך חלק הגבי רוב עמודות הגב, במיוחד בנקודות זמן מוקדמות לאחר פציעת 45,49. לכן, אנו מתארים מודל פציעה פשוט שמניב נגע נקי, הדיר, מלבני בצורה שהוא שימושי עבור שתי התצפית של תנועת תאים בתוך הנגע ולכימות קל של axonal עמדה ביחס לנגע.

<table><tbody><tr><td>עכברי CX3CR1 GFP</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>5582</td><td></td></tr><tr><td>Thy-1 YFP H עכברי</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>3782</td><td></td></tr><tr><td>כלוב פאי עכבר</td><td>Braintree Scientific</td><td>MPC 2 סט</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ 2 צלחת פטרי</td><td>קורנינג</td><td>430166</td><td>לבידוד מח עצם</td></tr><tr><td>Falcon 40 &mu; מסנן תא m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-1</td><td>לבידוד מח עצם</td></tr><tr><td>1 x 15 מ"ל ו- 1 x 50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td>לבידוד מח עצם</td></tr><tr><td>21 מחט מד</td><td>BD</td><td>305177</td><td>לבידוד מח עצם</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>309628</td><td>לבידוד מח עצם</td></tr><tr><td>מאגר ליזה ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>לעצם בידוד מח עצם</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>לבידוד מח עצם</td></tr><tr><td>RPMI מדיה</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>לבידוד מח עצם</td></tr><tr><td>F4/80 נוגדן</td><td>Ebioscience</td><td>12-4801 PE</td><td>לאימות FACS של כימרות</td></tr><tr><td>מזרק אינסולין 30 מד</td><td>BD</td><td>328280</td><td>להזרקת וריד זנב</td></tr><tr><td>מהדקי חוט השדרה</td><td>Narshinge</td><td>STS-A</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>אורתו-ג'ט אבקת אקריליק דנטלית</td><td>Lang REF1320</td><td></td><td>שיניים להדמיה</td></tr><tr><td>Ortho-Jet נוזל אקרילי דנטלי</td><td>Lang REF1404</td><td></td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>ספוגי ג'לטין ג'ל קצף</td><td>פייזר</td><td>9034201</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>4-0 תפרי אתילון</td><td>אתילון</td><td>1667G</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>קליפס רפלקס, 7 מ"מ</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>INS750344</td><td>לניתוח. עיקור לפני השימוש</td></tr><tr><td>מספריים איריס</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14061-09</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>45/5 מלקחיים, Dumoxel</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11251-35</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>30 מד</td><td>מחט BD</td><td>305106</td><td>ליצירת חורי גישה במלקחיים</td></tr><tr><td>דומונט #4 טיפים לביולוגיה</td><td>Dumont</td><td>11242-40</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>נהגי מחטים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>12002-12</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>מישל פצע קליפ מלקחיים</td><td>קנט INS700753</td><td></td><td>מדעי לניתוח</td></tr><tr><td>מסיר קליפ פצעים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>12033-00</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>טבעות O למלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11200-00</td><td>לניתוח, לעתים קרובות מסופק עם מלקחיים #4, יכול גם יש להזמין בנפרד</td></tr><tr><td>גוזם בעלי חיים נטען אלחוטי</td><td>סדרת Wahl</td><td>8900</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>תמיסת בטדין (תמיסה מקומית של 10% פרובידין-יוד)</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>NDC 67618-150-08</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>קרם מסיר שיער Nair</td><td>כנסייה & דווייט ושות', בע"מ</td><td>NRSL-22329-05</td><td>לניתוח</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>באטלר שיין</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>תרופות &ndash; לניתוח</td></tr><tr><td>מרקאין</td><td>הנרי שיין</td><td>NDC 0409-1587-50</td><td>תרופות &ndash; לניתוח 1.0 מ"ג/ק"ג הניתן תת עורי</td></tr><tr><td>בופרנקס</td><td>הנרי שיין</td><td>121-7793</td><td>תרופות &ndash; לניתוח בופרנורפין 0.1 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>aCSF</td><td>כימיקלים מסיגמא</td><td>119 מ"מ NaCl 26.2 מ"מ NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM גלוקוז</td><td>לניתוח מפרוטוקולי קולד ספרינג הארבור</td></tr><tr><td>TRITC-dextan 150,000 MW</td><td>Sigma</td><td>T1287</td><td>למתן תוך ורידי לסימון כלי דם</td></tr></tbody></table>

ההדמיה intravital של axonal אינטראקציות עם microglia והמקרופאגים בפגיעת crush טור העכבר הגבי

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

פגיעה טראומטית בחוט השדרה גורמת לתגובה דלקתית המערבת מקרופאגים שמקורם בדם ומיקרוגליה של מערכת העצבים המרכזית (CNS). מיקרוסקופיה דו-פוטונית תוך-חיונית מאפשרת לחקור מקרופאגים ומיקרוגליה בנגע חוט השדרה בבעל החיים החי. ניתן לבצע זאת בבעלי חיים בוגרים עם פגיעה טראומטית בעמוד הגב. כאן, אנו מתארים שיטות להבחנה בין מקרופאגים למיקרוגליה במערכת העצבים המרכזית באמצעות כימרה של מח עצם מוקרנת כדי להשיג בעלי חיים שבהם רק מקרופאגים או מיקרוגליה מסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק מקודד גנטית. אנו מתארים גם מודל פציעה שמוחץ את עמוד השדרה הגבי של חוט השדרה, ובכך מייצר נגע מלבני פשוט, נגיש בקלות, שניתן לדמיין בקלות בבעל חיים באמצעות כריתת למינקטומיה. יתר על כן, נתאר נהלים להדמיה רציפה של בעלי החיים באתר האנטומי של הפגיעה לצורך חקר אינטראקציות תאיות במהלך הימים עד השבועות הראשונים לאחר הפציעה.

תרשים סכמטי המתאר את הנגע למעוך עמודה הגבי מוצג באיור 1 א. לאחר הפגיעה, בעלי החיים מוכנים והתייצבו למיקרוסקופיה intravital באמצעות מהדק השדרה (איור 1). תמונה שצולמה מייד לאחר הפציעה למחוץ עמודה הגבי תערוכות נגע מלבני נראה בבירור עם נקודות החדרת שן מלקחיים שהם בבירור לזיהוי. האקסונים באתר הפציעה, נותקו על פני פרק הזמן של טור הגב כולו (איור 1 ג). שלמות כלי דם נותרה בשלמותה, ואין עדות לדליפת צבע הכלי זוהתה על ידי הקרינה. כדי לבצע הדמיה סידורי של אותו הנגע מעל שבועות, ניתן נתפרו השרירים והעור מעל laminectomy לחשיפה מחדש לאחר מכן. מורפולוגיה נגע דומה נצפית בנקודות זמן מאוחר יותר (1D דמויות, E). 5 ימים לאחר פציעה, אתרי החדרת מלקחיים עדיין נראים לעין אבל הנגע החל להגדיל בד הגודלue לפגיעה משנית הנגרמת על ידי דלקת. האקסונים בסוף הזנב של הנגע שחזרו מהאתר הראשוני של הפציעה באמצעות תהליך הנקרא "dieback axonal". האקסונים בסוף מקורי של הנגע הציגו ניוון כמו-Wallerian (1D איור, E). בין ימים 5 ו -22 לאחר פציעה, בגודל של הנגע התייצב. במקביל, זרם גדול של CX3CR1 + תאים ניתן לראות שחדר ובמסביב לפצע למעוך בנקודתי הזמן הללו, אם כי זהותו של תאים אלה (מיקרוגליה לעומת מקרופאגים) לא ניתן להבחין בהכנה, כפי שמוצג באיור 1. כדי להבדיל את ההתנהגות של מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך מייקרו-סביבת הנגע למעוך, מודל הכימרה הקרינה שימש (שמתואר באיור 2 א). ראשית, תאי אב במח העצם של עכבר + / GFP CX3CR1 מוחלפים בcel תורם לא פלורסנטls, כך microglia + GFP רק CNS-התושב גלוי על ידי הדמיה ניאון. היעילות של הכינון מחדש מח יכולה להיות מאושרת על ידי זרימת cytometry בחינת הדם ההיקפי 8 שבועות לאחר השתלת מח (איור 2 ב, ג). באיור 2, F4 / 80 ומקרופאגים החיוביים GFP, מסומן בכחול, המתגלים ב+ / GFP → C57BL / 6 עכבר chimeric CX3CR1, שבו כמה מונוציטים חיוביים שליליים אבל F4 / 80 GFP הם גם בהווה. באיור 2 ג, אין F4 הכפול חיובי / 80 ותאים חיוביים GFP נותרו לאחר החלפה של מח עצם נמען + / GFP CX3CR1 עם מח עצם מסוג בר. לפני פציעה, מיקרוגליה מופצים באופן שווה בתוך חוט השדרה, בו מוצגות מנוחה, מורפולוגיה מסועפת (איור 2 ד). 8 ימים לאחר פציעה, יכולים להתגלות רק כמה המיקרוגלים ובמסביב לפצע. microglia אלה להציג מורפולוגיה אמבואידית (איור 2E). שנית, עצםתאי אב במח בעכבר לא פלורסנט מוחלפים על ידי תאי מוח של עכבר + / GFP CX3CR1, לכן טיוח מח עצם נגזר CX3CR1 + מונוציטים / מקרופאגים הגלויים על ידי הקרינה GFP (איור 2 א). לפני פציעה, GFP + התאים זוהו רק במידה רבה perivascular, אשר כבר דיווחה להיות מח עצם נגזר ולהתהפך ללא הרף על בסיס קבוע 28 (איור 2F). לאחר פציעה למעוך, ניתן לראות תאים + / GFP CX3CR1 לאורך הצד הפנימי של כלי דם המקיפים את הנגע (איור 2H-J), ומרכז הנגע מלא בחדירת מקרופאגים CX3CR1 + / GFP (איור 2G). הדמיה הזמן לשגות של העמודות הגבי יכולה להתבצע עד 6 שעות. באיור 3, אנו מראים CX3CR1 אינו chimeric + / עכבר GFP מייד לאחר פציעה שבו תאים מהמחזור ניתן לראותn נע מכלי הדם לכיוון ליבת הנגע ומרגש באתר הפציעה (איור 3 א ', ב'; משלים סרט 1). ניתוח תמונת ניצול עוצמת הקרינה לזהות תאים יכול לעקוב אחר הנתיבים נלקחו על ידי מקרופאגים (איור 3 א ', ב'; משלים סרט 1). סטטיסטיקה נגזרת מניתוח ההדמיה מראה תנועתיות של מקרופאגים הממוצע בנגע היא 3.6 מיקרומטר / min (איור 3D). לבסוף, בעדיין ניתן לאתר 22 ימים לאחר פציעה, האקסונים, מיקרוגליה ומקרופאגים בתוך הנגע מפגין תחום ההדמיה יציב על פני תקופות זמן (סרט משלים 2) ארוכות. <img alt="איור 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" width="600"> איור 1: יצירה והדמיה רציפה של הפציעה למחוץ עמודה הגבי. (א) הגבפציעה למחוץ עמודה מתבצעת על ידי הסרת תהליך הגב של החוליה ברמת העניין. מלקחיים מוכנסים לתוך טור הגב של גזרי מ"מ כבל 1 השדרה ולאחר מכן סגרו 3 פעמים כדי לייצר את הנגע שמוצג בסגול. (ב) בעלי החיים אז ממוקמים בחוט השדרה מלחציים להשיג יציבות להדמית intravital. (C) מייד לאחר פציעה, אתרי המלקחיים ההכנסה (סגלגל אדום) ומלבני פציעה למחוץ נפח (הקופסה האפורה) ניתן זיהו בבירור. האקסונים בשורשי הגב ניתן לראות (חצים לבנים), כמו גם את הקצוות הפצועים של האקסונים בצד הזנב של הנגע (ראשי חץ מלאים). (ד) 5 ימים לאחר פציעה, אתרי החדרת מלקחיים (סגלגל אדום ), ועדיין יכול להיות דמיין) המידה של הנגע (התיבה האפורה בקלות. הנגע גדל בגודל מאז העלבון הראשוני. האקסונים עוברים ניוון כמו-Wallerian ניתן לראות מקורי לנגע ​​(ראשי חץ פתוח) בadditiעל האקסונים בשורשים הגבי (חצים לבנים) ואת הקצוות של אקסונים נפצעו (ראשי החץ לבנים). (E) 22 ימים לאחר פציעה, אתר הנגע עדיין מזוהה עם ממדים דומים לפציעה לאחר 5 ימים. שים לב למספר הגדול של CX3CR1 + תאים ובסביב האתר נפצע. תכונות שכותרתו הן אותו הדבר כמו ב( D). כל הברים בקנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600"> איור 2: בנייה של עכברי chimeric כדי לעקוב אחר CX3CR1 + / GFP להביע מקרופאגים נגזרות מח CNS-תושב microglia או עצם בנגע למעוך עמודה הגבי. תרשים סכמטי של דור עכברי chimeric עם או CX3CR1 + / GFP להביע מיל ()croglia או מקרופאגים. ראשית, עכברי Thy-1 YFP H הם מוקרנים ובמח העצם מחדש עם תאי מח מבודדים מעכבר + / GFP CX3CR1, וכתוצאה מכך עכבר chimeric מקרופאגים שהם + GFP. שנית, Thy-1 עכברי H / CX3CR1 + / GFP YFP הם מוקרנים ובמח העצם מחדש עם תאי מח מבודדים מעכבר לא פלורסנט, הפקת עכבר chimeric המיקרוגלים שהם + GFP. (ב) דוגמא של זרימת cytometry נתונים עם תאי F4 / 80 + וCX3CR1 GFP + בדם מבעלי חי chimeric עם תורם מח + / GFP CX3CR1 הושתלו C57BL / 6 נמען מוקרן. דוגמא תאים שמקורם בתורמים החיוביים CX3CR1 כי הם חיוביים עבור שני GFP וF4 / 80 מוצגים בכחול מודגש אזור. (C) של זרימת cytometry נתונים עם F4 / 80 + וCX3CR1 GFP + תאים בבעלי חי chimeric עם C57BL6 מח תורם הושתלו irהמוקרן CX3CR1 נמען + / GFP. שים לב לחוסר CX3CR1 + / GFP החיובי הכפול וF4 / 80 תאים בתוך הכחול מודגש אזור. (ד ') תמונת מצב מיקרוסקופית שני פוטונים intravital של עכבר מתכנית chimeric הראשונה, מראה GFP + מיקרוגליה עם מורפולוגיה מסועפת בתוך הגב עמודה (ראש חץ). תאים אלה ובין בין האקסונים (צהוב) בשורש הגבי ועמודה הגבי. בר סולם = 100 מיקרומטר. (E) ההדמיה Intravital של אותו העכבר ב( B) 8 ימים לאחר פציעת טור הגבי מגלה כמה CX3CR1 + מיקרוגליה עם גופי תא גדולים ואמבואידית בצורה שחסרות תהליכים (ראש חץ). בר סולם = 100 מיקרומטר (F) Snapshot. של עכבר מתכנית chimeric השנייה ב (א), מראה GFP + מקרופאגים זעומים, בתוך parenchyma CNS. בר סולם = 100 מיקרומטר. (G) ההדמיה Intravital של אותו העכבר ב( F) 8 ימים לאחר פציעת טור הגבי מגלים אלזרם arge של מקרופאגים ובמסביב לפצע. בר סולם = 100 מיקרומטר. תמונה בהגדלה גבוהה יותר של תאי דם + CX3CR1 נגזרים במגע עם הכלים בבעלי החיים ללא כל הפגע (H). בר סולם = 30 מיקרומטר. שיקום (I) של תאי CX3CR1 במגע עם הכלי, מבט מבפנים על הספינה. בר סולם = 30 מיקרומטר. (J) שחזור של תאי CX3CR1 במגע עם הכלי, מבט מבחוץ של כלי השיט. בר סולם = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52228/52228fig2highres.jpg" width="600"> איור 3 :. נתוני מעקב תא נציג בCX3CR1 אינו chimeric + / GFP עכבר מייד לאחר למחוץ עמודה הגביפציעה. (א) תמונת מצב של CX3CR1 מיקרוגליה + ומקרופאגים האקסונים סביב פגומים (צהובים) מסרט משלים 1 מייד לאחר פציעה למחוץ טור גב. (B) הנתיבים (האפורים) שצולם על ידי + תאי CX3CR1 ב (א) במהלך 110 דקות פגישת ההדמיה intravital. ייצוג מקודד זמן של המסלולים ב( ב) (ג). מסלולים הם בצבע המבוססים על הזמן שלהם בתוך הסרט כולו 110 דקות, כפי שמוצגים בסרגל הזמן. היסטוגרמה (D) של תנועתיות הכוללת של התאים + CX3CR1. כל הברים בקנה מידה הם 30 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52228/52228fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> סרט משלים 1: סרט intravital נציג מייד לאחר פציעה למחוץ עמודה הגבי בheterozygote הכפול Thy-1 YFP / + <st cx3cr1>GFP / + עכבר. הדמיה של עמוד השדרה Intravital בוצעה מייד לאחר פציעה למחוץ עמודה הגבי ברמת T11. פנל ימני מראה התנועה של מיקרוגליה CX3CR1 + ומקרופאגים. נתיבי תנועת התא מוצגים כפסים לבנים על הלוח השמאלי. הפציעה ממוקמת בפינה השמאלית העליונה. ניתן לראות CX3CR1 + תאים עוברים לאתר של הפגיעה במסלולים אלה. האקסונים מוצגים בצהוב. בר סולם = 40 מיקרומטר. סה"כ זמן: 110 דקות. מהירות השמעה: 300x. </st> סרט משלים 2:. סרט intravital נציג ב 22 ימים לאחר נגע למעוך עמודה הגבי בheterozygote הכפול Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + העכבר המוצג כאן הוא סרט נציג שצולם בעכבר 22 ימים לאחר למעוך עמודה הגבי הראשונית פגיעה ברמה T11 השדרה. Injאורי ממוקם בפינה הימנית העליונה של המסגרת. האקסונים עולים (צהוב) rostrally מוצגים בפינה הימנית התחתונה. כלי וריד הגבי ודם מסומנים עם TRITC-dextran (אדום). CX3CR1 + תאים בתוך מהלך הנגע במהירות איטית יותר בהשוואה לאלו מייד לאחר פציעה. בר סולם = 50 מיקרומטר. סה"כ זמן: 90 דקות. מהירות השמעה: 600x.

ניתן להשתמש בהדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים כדי לחקור אינטראקציות בין סוגי תאים שונים בחוט השדרה בסביבת הרקמה הטבעית שלהם בחיה כימרית של מח עצם עם פגיעת ריסוק טראומטית של חוט השדרה בעמוד הגב.

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בתנועה ואינטראקציה בין מיקרוגליה, מונוציטים וסוגי תאים אחרים בחוט השדרה הפגוע. זה מושג על ידי יצירת עכברים כימריים של מח עצם שיהיו להם מיקרוגליה תושבת או מקרופאגים שמקורם במח עצם המסומנים בסמן פלואורסצנטי. השלב השני הוא לייצר פגיעת ריסוק עמוד הגב בחוט השדרה.לאחר מכן החיות נפתחות מחדש וחוט השדרה מיוצב לצורך הדמיה מרובת פוטונים, השלב האחרון הוא צילום תמונות בודדות או סרטי זמן-lapse בתוך הנגע. בסופו של דבר, ניתוח תמונה מראה תנועה תאית ואינטראקציה תאית עם המצעים שמסביב. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני טכניקות מסורתיות, כגון תרבית תאים ורקמה קבועה, הם שניתן לדמות תאים בסביבתם המורכבת הטבעית בבעל החיים החי.לניתוח זה, השתמש בבעלי חיים כימריים או טרנסגניים כפולים. ראה את פרוטוקול הטקסט כיצד לתייג תאים תושבים או תאים שמקורם במח עצם לאחר השראת הרדמה, שמור אותו עם 1 עד 2% ISO פלואור לקצב נשימה של כ-60 עד 100 נשימות לדקה. כעת, מרחו משחות עיניים ואשרו מישור הרדמה כירורגי עם צביטה בבוהן.התכוננו לניתוח על ידי גילוח אזור חוט השדרה הממוקד, ולאחר מכן ניגוב העור עם קרצוף פובידון יוד ואלכוהול 70%, עטפו את החיה ועשו חור כדי לגשת לאתר הניתוח. ואז הניחו את כלי החיטוי על וילון סטרילי. זה כולל מלקחיים מספר ארבע שקבוע להיות מילימטר אחד בין השיניים ויש לו סימנים של מילימטר אחד מהקצות.עכשיו יכול לפתוח את העור בקו האמצע באמצעות מספריים לקשתית, ולחשוף את השרירים. המשך בניתוח תחת מיקרוסקופ מנתח. לאורך קו האמצע, חתכו את שרירי הגב במקום בו הם מתחברים לתהליכי עמוד השדרה הגבי במטרה לחשוף את עמוד השדרה.זה כרוך בחיתוך הטרפז והרצועות של ה-latisimus dorsi. לאחר מכן, הסר את השרירים המסובבים בין התהליכים הרוחביים לתהליך הגבי כדי לחשוף את הלמינה של החוליה הספציפית המיועדת להסרה. כאן נחשף T 10.המשך על ידי הכנסת קצות ה-RO Juor לחלל שמעל ומתחת לתהליך. לאחר מכן הרם מעט כדי לוודא שהטיפים נמצאים היטב במקומם ולא עמוקים מדי. לאחר מכן סגור את מושבעים RO כדי להסיר את הלמינה.כעת, הסר את כל החלקים הקטנים יותר של החוליה שנותרה, ובכך הגדל את הפתח. בעזרת מחט בקוטר 30, תקעו שני חורים, במרחק של מילימטר אחד זה מזה בדורה כדי ליצור נקודת גישה למלקחיים הקבועים. לאחר מכן הכנס את המלקחיים הקבועים בזווית של 90 מעלות דרך הדורה, תוך שמירה על הסימנים על השיניים מעל הדורה.כעת, צבט את המלקחיים למשך 10 שניות. בצע את עשר השניות לסחוט פעמיים נוספות והסר את המלקחיים. לאחר מכן, השרו חתיכת ג'לטין נספג, ספוג דחוס במי מלח וכסו איתו את מקום הפציעה.סגור את השריר מעל ספוג הג'לטין באמצעות תפרי ריצה סינתטיים מספר ארבע, שאינם ניילון. לאחר מכן השתמש בקליפסים של חמישה מילימטר לפצע כדי לאבטח את העור. השלם את ההליך בהזרקה תת עורית של 10 מיקרוליטר בופיבקאין ב -490 מיקרוליטר מי מלח עבור מיליגרם אחד לקילוגרם.לאחר מכן הזריק חמישה מיקרוליטרים של בופרנורפין לשריר העכוז עבור 100 מיקרוגרם לקילוגרם. לאחר הניתוח. לחמם את החיה ולפקח עליה עד שתחזור להכרה. כדי לפתוח מחדש את החיה להדמיה, יש לגרום להרדמה כמו קודם, ולאחר מכן להסיר את מהדקי הפצע בהתאם להוראות היצרן וההוראות.במידת הצורך יש למרוח מוצר להסרת שיער על האזור סביב החתך. הפעם, מרחו קרצוף נוסף עם יוד פובידון ו-70% אלכוהול. כעת, פתח מחדש את העור לאורך החתך הקודם.הסר את התפרים הנותרים ופתח את השרירים בעזרת מלקחיים בעזרת מספריים לפי הצורך. תחת המיקרוסקופ המנתח, השתמש במספריים כדי ליצור כיסים עבור מהדקי חוט השדרה לאורך התהליכים הרוחביים על החוליות, רמה אחת מעל כריתת הלמינקטומיה ורמה אחת מתחת ללמינקטומיה. הכנס את המהדקים של מייצב חוט השדרה סביב כל חוליה והדק את המהדקים.כוונן את המהדקים כך שחוט השדרה יהיה מקביל לפלטפורמת ההדמיה והרקמה תהיה יציבה. אם נראה חפץ נושם, כוונן את המהדקים כדי למזער את התנועה. ואז מכסים את המהדקים והפרפורם.לאחר מכן, בעדינות, הסר את קצף הג'ל בעזרת מלקחיים. הסר כמה שיותר. כמו כן, הסר כל רקמת צלקת עבה מעל קרומי המוח שעלולים להימצא.לאחר הסרת כל קצף הג'ל, יש לכסות את חוט השדרה במי מלח. אם מבחינים בדימום, השתמש בספוג ג'לטין כדי לעצור את הדימום. במידת הצורך, השתמש בצריבה במהלך הצריבה.היזהר לא לגעת בחוט השדרה ולהשאיר אותו מכוסה במי מלח וקצף ג'ל. כעת צור באר להחזקת נוזל הטבילה, אטום את העור והרקמות עם דבק ציאנואקרילט. ואז בנה באר של אקריליק דנטלי בין שני המהדקים.תנו לבאר זמן להחלים. לאחר הריפוי, מלאו את הבאר ב- CSF מלאכותי. המשיכו לעקוב אחר דימום במהלך שלבים אלה.בשלב זה, אופציונלי להזריק כלי פלואורסצנטי לתוך וריד הזנב. כדי להדגיש כלי דם במהלך ההדמיה, השתמש בגדיל DExT פלואורסצנטי מעל 70 קילו-דלטון נקודות קוונטיות או לקטינים עם תווית פלואורסצנטית. במהלך ההדמיה, שמרו על העכבר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה מבוקרת בשלב המיקרוסקופ, השלבים הקריטיים ביותר להכנה מוצלחת הם לוודא שחוט השדרה נקי, לא מדמם, ושאין חפץ נשימה נראה לעין.מעת לעת במהלך ההדמיה, בדוק את רמת ההרדמה על ידי ניטור נשימת החיה, שאמורה להיות בין 60 ל-100 נשימות לדקה. תקן את ההרדמה על ידי התאמת רמות הפלואור של ISO. לאחר ההדמיה, החזירו את החיה לאתר הניתוח שם, הסירו את מהדקי עמוד השדרה ומשכו את האקריליק מהעור.לאחר מכן ניתן לסגור את העכבר להדמיה מאוחרת יותר כמו בסוף הניתוח הראשוני או להמתת חסד חמישה ימים לאחר הפציעה. אתרי החדרת המלקחיים עדיין נראים לעין, אך הנגע החל לגדול בגודלו עקב פגיעה משנית הנגרמת על ידי דלקת. האקסונים בקצה המשותף של הנגע נסוגו מהאתר הראשוני של הפציעה.במקביל, ניתן לראות זרם גדול של CX שלושה תאים חיוביים C, מיקרוגליה או מקרופאגים חודרים בתוך ומסביב לנגע הריסוק כדי להבחין בהתנהגות התאים הללו בתוך מיקרו-סביבת הנגע, נעשה שימוש תחילה במודל כימרה של קרינה. תאי האב של מח העצם של עכבר CX 3 CR עם GFP חיובי אחד הוחלפו בתאי תורם שאינם פלואורסצנטיים, כך שרק מיקרוגליה תושבת CNS חיובית ל-GFP תהיה גלויה. שנית, תאי אב מח עצם בעכבר שאינו פלואורסצנטי הוחלפו בתאי מח מעכבר CX 3 CR GFP חיובי אחד כדי להציג תאים שמקורם במח עצם.לפני הפציעה, התאים החיוביים היחידים שמקורם במח העצם שזוהו היו בעיקר פרה-וסקולריים, שדווחו כי הם מוחלפים ללא הרף ממח העצם לאחר פגיעת הריסוק. CX שלושה תאי C חיוביים אחד GFP מוגברים לאורך החלק הפנימי של כלי הדם המקיפים את הנגע. בנוסף, מרכז הנגע התמלא במקרופאגים חודרים CX שלושה CR ואחד חיובי GFP.באמצעות טכניקה זו, ניתן להשתמש בחיות טרנסגניות שונות על מנת לסמן אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים אחרות כדי לזהות את האינטראקציות שלהן הן בתוך חוט השדרה והן במודלים אחרים של מחלות.

intravital-imaging-axonal-interactions-with-microglia-macrophages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול פולשנית כדי לייצב את עמוד השדרה העכבר ולבצע...

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

מקור: Maruoka, H., et. al. {{}}הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכברים ערים. J. Vis. exp. (2022) סרטון זה מציג הליך מיקרוסקופיה דו-פוטוני להדמיית פעילות עצבית ודינמיקה של מיקרוגליה בעכבר ער במהלך גירוי חזותי, תוך הדגשת מעברי סידן ואינטראקציות תאיות.

הדמיה סימולטנית של דינמיקת מיקרוגליה ופעילות עצבית בעכבר ער

אנו מתארים שיטה להשתלה ותחזוקה של חלונות זכוכית מעל חוט השדרה החשוף של עכברים בוגרים לחקר דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית. חלונות אלה מספקים גישה אופטית כרונית לחוט השדרה לניטור דינמיקת התאים ברמה התת-תאית בבעלי חיים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

השתלת זכוכית חוט השדרה של Windows בעכברים בוגרים עם ניסיון אוטואימוניות Encephalomyelitis

טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופ זמן-lapse של עירור שני פוטונים כדי לדמיין בו זמנית את הדינמיקה של פגיעות אקסון ומיאלין בזמן אמת. פרוטוקול מוצע זה מאפשר מחקרים של גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד שיכולים להשפיע על גורל האקסון המיאליני המרכזי לאחר פציעה ולתרום לנכות קלינית קבועה.

Ex Vivo חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

בסרטון הזה, אנו מתארים הליך להשתלת חדר הדמיה אופטי כרוני על חוט השדרה הגבי של עכבר חי. קאמרי, ההליך כירורגי, וההדמיה כרונית נבדקים והפגינו.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך In vivo הדמיה של כבל עכבר השדרה

אנחנו מציגים של ויוו הדמיה השיטה באמצעות שני צבעי פלורסנט שונים כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים בעמוד השדרה כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה contusive בחולדות ספראג-Dawley למבוגרים.

Vivo דואו-צבע שיטת הדמיה Dynamics כלי הדם בעקבות פגיעה בחוט השדרה Contusive

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.

הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני

מאמר זה מדגים שיטה לדמיון וכימות תנועתיות מיקרוגליה ומגע עם פונקטות פוסט-סינפטיות ברשתית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הדמיה חיה ואפיון של דינמיקת מיקרוגליה ואינטראקציות עם סינפסות ברשתית עכברים חולים

למדו הדמיה תוך-חייתית בשני פוטונים לחקירת אינטראקציות בין מיקרוגליה ומונוציטים בעכברים בעקבות פגיעה בעמוד השדרה. השיטה מאפשרת תצפית בזמן אמת של תנועת תאים ותגובות דלקתיות במערכת העצבים.

ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי

גלה סרטונים נוספים