ההדמיה Intravital של axonal אינטראקציות עם Microglia והמקרופאגים בפגיעת Crush טור העכבר הגבי
23 בנובמבר 2014
ניתן להשתמש בהדמיה תוך-חיונית של שני פוטונים כדי לחקור אינטראקציות בין סוגי תאים שונים בחוט השדרה בסביבת הרקמה הטבעית שלהם בחיה כימרית של מח עצם עם פגיעת ריסוק טראומטית של חוט השדרה בעמוד הגב.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לצפות בתנועה ואינטראקציה בין מיקרוגליה, מונוציטים וסוגי תאים אחרים בחוט השדרה הפגוע. זה מושג על ידי יצירת עכברים כימריים של מח עצם שיהיו להם מיקרוגליה תושבת או מקרופאגים שמקורם במח עצם המסומנים בסמן פלואורסצנטי. השלב השני הוא לייצר פגיעת ריסוק עמוד הגב בחוט השדרה.
לאחר מכן החיות נפתחות מחדש וחוט השדרה מיוצב לצורך הדמיה מרובת פוטונים, השלב האחרון הוא צילום תמונות בודדות או סרטי זמן-lapse בתוך הנגע. בסופו של דבר, ניתוח תמונה מראה תנועה תאית ואינטראקציה תאית עם המצעים שמסביב. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני טכניקות מסורתיות, כגון תרבית תאים ורקמה קבועה, הם שניתן לדמות תאים בסביבתם המורכבת הטבעית בבעל החיים החי.
לניתוח זה, השתמש בבעלי חיים כימריים או טרנסגניים כפולים. ראה את פרוטוקול הטקסט כיצד לתייג תאים תושבים או תאים שמקורם במח עצם לאחר השראת הרדמה, שמור אותו עם 1 עד 2% ISO פלואור לקצב נשימה של כ-60 עד 100 נשימות לדקה. כעת, מרחו משחות עיניים ואשרו מישור הרדמה כירורגי עם צביטה בבוהן.
התכוננו לניתוח על ידי גילוח אזור חוט השדרה הממוקד, ולאחר מכן ניגוב העור עם קרצוף פובידון יוד ואלכוהול 70%, עטפו את החיה ועשו חור כדי לגשת לאתר הניתוח. ואז הניחו את כלי החיטוי על וילון סטרילי. זה כולל מלקחיים מספר ארבע שקבוע להיות מילימטר אחד בין השיניים ויש לו סימנים של מילימטר אחד מהקצות.
עכשיו יכול לפתוח את העור בקו האמצע באמצעות מספריים לקשתית, ולחשוף את השרירים. המשך בניתוח תחת מיקרוסקופ מנתח. לאורך קו האמצע, חתכו את שרירי הגב במקום בו הם מתחברים לתהליכי עמוד השדרה הגבי במטרה לחשוף את עמוד השדרה.
זה כרוך בחיתוך הטרפז והרצועות של ה-latisimus dorsi. לאחר מכן, הסר את השרירים המסובבים בין התהליכים הרוחביים לתהליך הגבי כדי לחשוף את הלמינה של החוליה הספציפית המיועדת להסרה. כאן נחשף T 10.
המשך על ידי הכנסת קצות ה-RO Juor לחלל שמעל ומתחת לתהליך. לאחר מכן הרם מעט כדי לוודא שהטיפים נמצאים היטב במקומם ולא עמוקים מדי. לאחר מכן סגור את מושבעים RO כדי להסיר את הלמינה.
כעת, הסר את כל החלקים הקטנים יותר של החוליה שנותרה, ובכך הגדל את הפתח. בעזרת מחט בקוטר 30, תקעו שני חורים, במרחק של מילימטר אחד זה מזה בדורה כדי ליצור נקודת גישה למלקחיים הקבועים. לאחר מכן הכנס את המלקחיים הקבועים בזווית של 90 מעלות דרך הדורה, תוך שמירה על הסימנים על השיניים מעל הדורה.
כעת, צבט את המלקחיים למשך 10 שניות. בצע את עשר השניות לסחוט פעמיים נוספות והסר את המלקחיים. לאחר מכן, השרו חתיכת ג'לטין נספג, ספוג דחוס במי מלח וכסו איתו את מקום הפציעה.
סגור את השריר מעל ספוג הג'לטין באמצעות תפרי ריצה סינתטיים מספר ארבע, שאינם ניילון. לאחר מכן השתמש בקליפסים של חמישה מילימטר לפצע כדי לאבטח את העור. השלם את ההליך בהזרקה תת עורית של 10 מיקרוליטר בופיבקאין ב -490 מיקרוליטר מי מלח עבור מיליגרם אחד לקילוגרם.
לאחר מכן הזריק חמישה מיקרוליטרים של בופרנורפין לשריר העכוז עבור 100 מיקרוגרם לקילוגרם. לאחר הניתוח. לחמם את החיה ולפקח עליה עד שתחזור להכרה. כדי לפתוח מחדש את החיה להדמיה, יש לגרום להרדמה כמו קודם, ולאחר מכן להסיר את מהדקי הפצע בהתאם להוראות היצרן וההוראות.
במידת הצורך יש למרוח מוצר להסרת שיער על האזור סביב החתך. הפעם, מרחו קרצוף נוסף עם יוד פובידון ו-70% אלכוהול. כעת, פתח מחדש את העור לאורך החתך הקודם.
הסר את התפרים הנותרים ופתח את השרירים בעזרת מלקחיים בעזרת מספריים לפי הצורך. תחת המיקרוסקופ המנתח, השתמש במספריים כדי ליצור כיסים עבור מהדקי חוט השדרה לאורך התהליכים הרוחביים על החוליות, רמה אחת מעל כריתת הלמינקטומיה ורמה אחת מתחת ללמינקטומיה. הכנס את המהדקים של מייצב חוט השדרה סביב כל חוליה והדק את המהדקים.
כוונן את המהדקים כך שחוט השדרה יהיה מקביל לפלטפורמת ההדמיה והרקמה תהיה יציבה. אם נראה חפץ נושם, כוונן את המהדקים כדי למזער את התנועה. ואז מכסים את המהדקים והפרפורם.
לאחר מכן, בעדינות, הסר את קצף הג'ל בעזרת מלקחיים. הסר כמה שיותר. כמו כן, הסר כל רקמת צלקת עבה מעל קרומי המוח שעלולים להימצא.
לאחר הסרת כל קצף הג'ל, יש לכסות את חוט השדרה במי מלח. אם מבחינים בדימום, השתמש בספוג ג'לטין כדי לעצור את הדימום. במידת הצורך, השתמש בצריבה במהלך הצריבה.
היזהר לא לגעת בחוט השדרה ולהשאיר אותו מכוסה במי מלח וקצף ג'ל. כעת צור באר להחזקת נוזל הטבילה, אטום את העור והרקמות עם דבק ציאנואקרילט. ואז בנה באר של אקריליק דנטלי בין שני המהדקים.
תנו לבאר זמן להחלים. לאחר הריפוי, מלאו את הבאר ב- CSF מלאכותי. המשיכו לעקוב אחר דימום במהלך שלבים אלה.
בשלב זה, אופציונלי להזריק כלי פלואורסצנטי לתוך וריד הזנב. כדי להדגיש כלי דם במהלך ההדמיה, השתמש בגדיל DExT פלואורסצנטי מעל 70 קילו-דלטון נקודות קוונטיות או לקטינים עם תווית פלואורסצנטית. במהלך ההדמיה, שמרו על העכבר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בסביבה מבוקרת בשלב המיקרוסקופ, השלבים הקריטיים ביותר להכנה מוצלחת הם לוודא שחוט השדרה נקי, לא מדמם, ושאין חפץ נשימה נראה לעין.
מעת לעת במהלך ההדמיה, בדוק את רמת ההרדמה על ידי ניטור נשימת החיה, שאמורה להיות בין 60 ל-100 נשימות לדקה. תקן את ההרדמה על ידי התאמת רמות הפלואור של ISO. לאחר ההדמיה, החזירו את החיה לאתר הניתוח שם, הסירו את מהדקי עמוד השדרה ומשכו את האקריליק מהעור.
לאחר מכן ניתן לסגור את העכבר להדמיה מאוחרת יותר כמו בסוף הניתוח הראשוני או להמתת חסד חמישה ימים לאחר הפציעה. אתרי החדרת המלקחיים עדיין נראים לעין, אך הנגע החל לגדול בגודלו עקב פגיעה משנית הנגרמת על ידי דלקת. האקסונים בקצה המשותף של הנגע נסוגו מהאתר הראשוני של הפציעה.
במקביל, ניתן לראות זרם גדול של CX שלושה תאים חיוביים C, מיקרוגליה או מקרופאגים חודרים בתוך ומסביב לנגע הריסוק כדי להבחין בהתנהגות התאים הללו בתוך מיקרו-סביבת הנגע, נעשה שימוש תחילה במודל כימרה של קרינה. תאי האב של מח העצם של עכבר CX 3 CR עם GFP חיובי אחד הוחלפו בתאי תורם שאינם פלואורסצנטיים, כך שרק מיקרוגליה תושבת CNS חיובית ל-GFP תהיה גלויה. שנית, תאי אב מח עצם בעכבר שאינו פלואורסצנטי הוחלפו בתאי מח מעכבר CX 3 CR GFP חיובי אחד כדי להציג תאים שמקורם במח עצם.
לפני הפציעה, התאים החיוביים היחידים שמקורם במח העצם שזוהו היו בעיקר פרה-וסקולריים, שדווחו כי הם מוחלפים ללא הרף ממח העצם לאחר פגיעת הריסוק. CX שלושה תאי C חיוביים אחד GFP מוגברים לאורך החלק הפנימי של כלי הדם המקיפים את הנגע. בנוסף, מרכז הנגע התמלא במקרופאגים חודרים CX שלושה CR ואחד חיובי GFP.
באמצעות טכניקה זו, ניתן להשתמש בחיות טרנסגניות שונות על מנת לסמן אוכלוסיות תאים פלואורסצנטיים אחרות כדי לזהות את האינטראקציות שלהן הן בתוך חוט השדרה והן במודלים אחרים של מחלות.
סקירה כללית
מחקר זה עושה שימוש בדימות תוך-חי(intravital) דו-פוטוני כדי לבחון את האינטראקציות בין סוגי תאים שונים בחוט השדרה בתוך מודל של בעל חיים חי. באופן ספציפי, הוא מתמקד בדינמיקה של מיקרוגליה ומונוציטים בהקשר של פגיעה טראומטית בחוט השדרה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- דימיון בתוך הגוף (In vivo Imaging)
רקע
- דימות דו-פוטוני מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות.
- עכברי כימרה של מוח עצם משמשים להבחנה בין תאים תושבים לבין תאים שמקורם במוח העצם.
- פגיעות טראומטיות של חוט השדרה מספקות מודל לחקר תגובות תאיות בסביבה מורכבת.
- שיטה זו מציעה יתרונות על פני טכניקות מסורתיות על ידי שימור המבנה הרקמתי הטבעי.
מטרת המחקר
- למעקב אחר התנועה והאינטראקציה של מיקרוגליה ומונוציטים בחוט שדרה פגוע.
- להערכת התנהגות תאית באורגניזם חי לאחר פגיעה.
- להעמקת ההבנה של דינמיקה תאית בתגובות נוירו-דלקתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירת עכברים כימריים של מחול השומח עם תאים המסומנים פלואורסצנטית.
- השראת פגיעת מעיכה בעמוד השדרה במערכת העמודים האחוריים (dorsal column).
- דימות רב-פוטוני ללכידת אינטראקציות ותנועות תאיות.
- ניטור ודימות לאחר ניתוח תחת תנאים מבוקרים.
תוצאים עיקריים
- ויזואליזציה מוצלחת של אינטראקציות בין מיקרוגליה למונוציטים בזמן אמת.
- הדגמה של תנועה תאית בתוך אתר הפגיעה.
- הדגשת היתרונות של דימיון in vivo על פני שיטות מסורתיות.
- אספקת תובנות לגבי התגובות התאיות בעקבות פגיעה בחוט השדרה.
מסקנות
- דימות דו-פוטוני הוא כלי רב עוצמה לחקר דינמיקה תאית in vivo.
- המחקר משפר את ההבנה של תהליכים נוירו-דלקתיים בפגיעות בחבל השדרה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על ממצאים אלה כדי לבחון התערבויות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
גישה זו של דימות אינטרה-ויטלי (intravital imaging) מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקת תאי מערכת החיסון בפגיעות טראומטיות של חוט השדרה, ובכך מספקת תובנות מכניסטיות לגבי תהליכים נוירו-דלקתיים. באמצעות הבחנה בין מיקרוגליה למקרופאגים in vivo, השיטה תומכת בתיקוף יעדים ובצמצום סיכונים של אסטרטגיות אימונו-מודולטוריות במודלים פרה-קליניים של מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). הטכניקה מגבירה את רמת הביטחון החזויה בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי לכידה של אינטראקציות תאיות בתוך מיקרו-סביבת נגע רלוונטית פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של דפוסי חדירה ואינטראקציה של מיקרוגליה ומקרופאגים בעקבות פגיעת מעיכה של העמודה הדורסלית (dorsal column crush injury).
- ערך תפעולי: עושה שימוש במודלים כימריים של מח भारतात כדי להפריד בין מיקרוגליה השוכנת במערכת העצבים המרכזית לבין מקרופאגים שמקורם במח העצם, לצורך בחינה ספציפית של מטרות.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי ויזואליזציה של תגובות תאיות במערכת חיה, ובכך מפחית את ההסתמכות על מערכות תרבית מלאכותיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים בעת רבוי על תנועה ותגשרויות תאיות בתוך אתר הנגע.
- ערך תפעולי: מקים פלטפורמת דימות הניתנת לשחזור למעקב אורך של דינמיקת תאי מערכת החיסון לאחר פגיעה.
- מוכנות הבדיקה: מאפשרת ויזואליזציה סטנדרטית של אוכלוסיות תאים חיוביים ל-CX3CR1 כסמן ביולוגי להפעלה דלקתית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה את התקדמות הפגיעה המשנית ואת חדירת תאי דלקת הרלוונטיים לפתולוגיה של חוט השדרה האנושי.
- ערך תפעולי: מאפשר מפגשי דימות אורך כדי להעריך את ההשפעה הטיפולית על דינמיקה תאית לאורך ימים עד שבועות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין מעורבות מטרה בשלב הגילוי לבין הערכת יעילות פרה-קלינית באמצעות מדדים פנוטיפיים עקביים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי של נוירו-דלקת, תומכת בתיקוף מוקדם של יעדים באמצעות סריקה פנוטיפית ומאפשרת מעקב מכניסטי במודלים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי מעורבות של תאי חיסון בפגיעות בחוט השדרה באמצעות תצפית ישירה על התנהגות מיקרוגליה ומקרופאגים.
- סריקה: מספקת פלטי דימוי כמותיים, כגון מהירות תאים, צפיפות חדירה ותדירות אינטראקציה, לצורך סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מערכי נתונים מרחביים-זמניים המאפשרים השוואה סטטיסטית של פנוטיפים תאיים בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים על ידי מעקב אחר דינמיקה של תאים חיוביים ל-CX3CR1 כמתאם לתגובה נוירו-דלקתית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת דימוי תוך-חי (intravital) הניתנת לשימוש חוזר ומ applicable למספר מודלים של מחלות במערכת העצבים המרכזית מעבר לפגיעות בחוט השדרה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי חשיפת תובנות מכניסטיות לגבי אינטראקציות נוירו-אימוניות in situ.
- ערך תפעולי: מקדם הדירות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של הכנה כירורגית, ייצוב והדמיה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go על ידי הפחתת אי-הוודאות הביולוגית במנגנוני הפעולה של אימונומודולטורים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של טיפולים המכוונים למערכת העצבים המרכזית (CNS) בהתבסס על מעורבות מטרה מאושרת במערכות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בעכברים, מיקרוסקופיה דו-פוטונית ויצירת כימרות של מחוגה של העצם.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל לייזרים בעלי אורך גל משתנה, מייצבי חוט שדרה ובמות דימות בבקרה טמפרטורלית.
- מחייב תיאום רב-תחומי בין צוותי הניתוחים, הדימוי והטיפול בבעלי החיים לצורך הכנה עקבית של הנגעים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום המודל להקשרי פגיעה עצבית אחרים או להקשרים של ניוון עצבי.
- מוגבל על ידי חלונות הישרדות לאחר הניתוח ואתגרים טכניים בשמירה על יציבות חוט השדרה במהלך דימוי לאורכי.
