דור של פלסמיד וקטורים לבטא חלבונים מתויג FLAG על פי תקנות ההסדרה של יזם אדם התארכות Factor-1α שימוש גיבסון עצרת
9 בפברואר 2015
סינתזה של פלסמידים מותאמים אישית גוזלת עבודה וזמן. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיבוט הרכבה של גיבסון כדי להפחית את העבודה ומשך הליך שיבוט ה-DNA המותאם אישית. הפרוטוקול המתואר מייצר גם מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי יונקים בעלות דומה לשיבוט ה-DNA המסורתי של גזירה והדבקה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בגישת ההרכבה של גיבסון כדי ליצור מבני DNA גדולים ומורכבים המשלבים מקטעים קצרים וארוכים ממספר מקורות DNA שונים. ראשית תכנן באופן חישובי את רצף הנוקלאוטידים השלם של הפלסמידים ולאחר מכן תכנן ערכות פריימר חופפות. לאחר מכן, תבניות DNA לתגובת ההרכבה מוגברות על ידי PCR.
לאחר מכן, מתבצע טיהור של מוצרי ה- PCR. השלב האחרון הוא טרנספורמציה של תגובת ההרכבה של הפלסמידים המתקבלים ואימות שיבוט הפלסמיד. בסופו של דבר, תגובת ההרכבה של גיבסון משמשת להתפתחות בפלסמידים מקבילים המכילים גרסאות מתויגות דגל של סוג הבר וחלבוני CSTF 64 מוטנטיים תחת ויסות השעתוק של מקדם גורם ההתארכות האנושי אלפא אחד.
היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו DNA Corning מסורתי, הוא שהיא יכולה ליצור במקביל, דומה בעיצוב, סוג פראי ופלסמידים מוטנטיים ללא שלבי קורנינג עוקבים. תכנן רצף נוקלאוטידים רציף כדי לייצג את הפלסמיד הסופי. כעת רשום את הפלסמידים ושברי ה-DNA בפועל שישמשו כתבניות בסדר PCR שברי DNA שאינם זמינים, כגון שילובים שונים של תגים ומקדמים כשברי DNA דו-גדיליים סינתטיים בודדים או מרובים.
לאחר מכן, חלקו את רצף הנוקלאוטידים הרציף של המבנה הסופי לשברי DNA המתאימים ל-PCR. אשר שהשברים תואמים לפלסמידים זמינים ולשברי DNA סינתטיים. הימנע מקטעי DNA הקטנים מ-200 נוקלאוטידים.
לאחר הגישה לכלי ליצירת פריימר, בחר בתפריט הגדרת העדפות בחלון המוקפץ שינוי הגדרות ההרכבה של גיבסון. בחר בכרטיסייה שינוי pres, ולאחר מכן בחר בתפריט בניית הבנייה כדי להכניס את שברי ה-DNA המפוצלים בכלי יצירת הפריימר ברצף מחמשת הראשוניים לשלושת הקצה הראשוני. פתח את וקטור הכניסה או הכנס חלון שבר, הדבק את שבר ה-DNA הראשון המייצג את חמשת הקצה הראשוני של ה-DNA הווקטורי בפורמט A מהיר ותן שם לשבר ה-DNA הזה.
בחר את הדרך המתאימה להשיג את שבר ה-DNA. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה המשך. אם יש צורך להוסיף נוקלאוטידים נוספים או אתרי הגבלה בצומת המבנה הסופי, פתח את שבר ההוספה וההכנסה לחלון ההרכבה באזורי מרווח הפריימר קדימה או אחורה.
הזן את הנוקלאוטידים הנוספים או אתרי ההגבלה רק לאחד מקטעי ה- DNA. לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה סיום. חזור על הפעולה עבור כל הקטעים עד להשלמת הבנייה.
בחר בתפריט התצוגה ובדוק את רצפי הפריימרים. חזור גם על כל המבנים, הווקטור, עמוד השדרה והתוספות או עבור מקטעי DNA שונים. יש לדלל את פריימרים ה-PCR ל-10 מיקרומולר במים או במאגר.
לאחר מכן יש לדלל את כל תבניות ה-DNA וה-DNA הסינתטי החד-גדילי עבור ה-PCR לננוגרם אחד למיקרוליטר במים. הרכיבו את תגובות ה-PCR בטמפרטורת החדר על ידי שילוב של 2.5 מיקרוליטר של 10 מיקרומולר מכל פריימר. מיקרוליטר אחד של ננוגרם אחד לכל תבנית מיקרוליטר שבר DNA 25 מיקרוליטר חם.
התחל להגיה DNA פולימראז ו-19 מיקרוליטר מים. מערבבים את הצינור בתנועה עדינה ואוספים את טיפות הנוזל על ידי צנטריפוגה קצרה. להגביר בו זמנית בצינורות נפרדים, את שברי ה- DNA בגודל דומה בהתאם להמלצות ל- DNA פולימראז המשמש.
בצע 25 עד 28 מחזורי PCR או קבע את מספר המחזורים המייצרים תפוקת DNA מספקת. לפתור חמישה מיקרוליטר של ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל AROS. ודא שרצועת DNA אחת המייצגת את מוצר ה-PCR נראית לעין.
קבע את הגודל והכמות היחסית של שברי ה-DNA באמצעות תקני המשקל המולקולרי של ה-DNA במידת הצורך, חזור על ה-PCR כדי להשיג כמות מספקת של שברי DNA. העבירו את ה-PCR שעוכל מראש עם צינורות DPN של 1 עד 1.5 מיליליטר והוסיפו 81 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לטיהור DNA לכל צינור. דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
הניחו את הצינורות על הקולט המגנטי למשך שתי דקות. כעת, השליכו את הנוזל הצלול. יש לשטוף פעמיים עם 200 מיקרוליטר אתנול 80% למשך 30 שניות.
לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים המיובשים ב -10 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי טריס הידרוכלוריד pH 8.0 לאחר שתי דקות, סובב קצרות ואז מקם את הצינורות על הקולט המגנטי למשך שתי דקות. הסר 8.5 עד 10 מיקרוליטר מהתמיסה השקופה והנח אותה בצינור חדש עם תווית מראש. קבע את ריכוז שברי ה-DNA על ידי ספקטרוסקופיה UV.
השתמש לפחות ב-100 ננוגרם של מקטע DNA המייצג את עמוד השדרה הווקטורי או מקטע ה-DNA הנושא את הסמן הסלקטיבי. חשב את העודף המולרי המשולש עבור שברי ה-DNA שישמשו כתוספות. מערבבים את הכמויות המחושבות של שברי DNA בצינור PCR.
לאחר מכן כוונן את עוצמת הקול ל -10 מיקרוליטר. הוסף 10 מיקרוליטר מתערובת מאסטר ההרכבה של גיבסון. דגרו את התגובה ב-50 מעלות צלזיוס במחזור תרמי PCR.
המשך בטרנספורמציה של מוצר ההרכבה e coli לא כשיר, או הקפיא את המוצרים במינוס 20 מעלות צלזיוס עד הצורך. עקוב אחר הליך הטרנספורמציה המלווה את התאים הכימיים או האלקטרו-מוכשרים בדרך כלל השתמש בשני מיקרוליטרים של תגובת ההרכבה לכל תגובת טרנספורמציה.
לבסוף, אשר את הצלחת שיבוט ה-DNA על ידי ריצוף DNA באמצעות פריימרים ספציפיים או סטנדרטיים. נתח את נתוני הרצף לדיוק. ניסוי זה תוכנן לשכפל את חלבון גורם גירוי המחשוף 64 וגם מוטציה CSTF 64.
חלבונים התמזגו לתג דגל של שלושה x תחת ויסות הביטוי של מקדם האלפא HE F1. פלסמיד המכיל HE F1 alpha ואחריו תג דגל של שלושה x לא היה זמין לנו. עם זאת, הפלסמידים הבאים היו זמינים.
PC DNA 3.1 M hiss HF אלפא אחד המכיל פלסמיד ופלסמידים CSTF 64 עכבר. כל הרצף של המבנה הורכב באמצעות יישומי נוקלאוטידים ועריכת טקסט. לאחר מכן, הרצף פוצל לארבעה חלקים נוחים המתאימים ל-DNA הפלסמיד הזמין.
ארבעת שברי ה-DNA לתגובות ההרכבה הוגברו על ידי PCR. פלסמידים שהתקבלו משיבוטים בודדים הוגברו ונותחו על ידי עיכול אנזים הגבלה להרכבה נכונה לתוך וקטור ה-DNA של המחשב שיבוטים נבחרים אומתו לאחר מכן על ידי ריצוף. לאחר שליטה בטכניקת ההרכבה, כולל פלסמיד ועיצוב ראשוני, ניתן לבצע אימות PCR ותקשורת לאחר מכן תוך חמישה ימים, למעט הזמן לסינתזה ומשלוח DNA ראשוני וסינתטי.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיטת שיכפול ג'יבסון (Gibson assembly) לייעול סינתזה של פלסמידים בהתאמה אישית, ובכך הוא מפחית משמעותית את הזמן והעבודה הכרוכים בשיכפול DNA. הוא מאפשר יצירה של מבני חלבון מתויגים אמינים לביטוי ביונקים של יונקים בעלות דומה לשיטות מסורתיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה מולקולרית
- הנדסה גנטית
- ביטוי חלבונים
רקע
- סינתזה מותאמת אישית של פלסמידים היא באופן מסורתי תהליך עתיר עבודה.
- שיטת ה-Gibson assembly מאפשרת יצירה מקבילית של פלסמידים.
- חלבונים מסומנים (Tagged proteins) חיוניים לחקר תפקוד חלבונים.
- טכניקות שיクלונינג יעילות הן קריטיות למחקר גנטי.
מטרת המחקר
- לפישוט התהליך של יצירת מבני DNA מורכבים.
- להפקה סימולטנית של פלסמידים מסוג בר (wild type) ופלסמידים מוטנטיים.
- לשיפור יעילות הרכבת הפלסמיד עבור ביטוי ביונקיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון מערכי פריימרים חופפים להרכבת DNA.
- הגברה של תבניות DNA באמצעות PCR.
- טיהור תוצרי PCR לפני ההרכבה.
- טרנספורמציה של חיידקי E. coli כשירים עם הפלסמידים שהורכבו.
תוצאות עיקריות
- הרכבה מוצלחת של פלסמידים המכילים חלבוני CSTF 64 עם תג flag.
- אימות של מבני הפלסמידים באמצעות רצף (sequencing).
- הדגמת היתרונות של הרכבה מקבילית על פני שיטות מסורתיות.
- ייצור של מבנים תחת בקרה של פרומוטור גורם ההארכה האנושי one alpha.
מסקנות
- שיטת ה-Gibson assembly מקצרת משמעותית את זמן השכפול (cloning).
- היא מאפשרת ייצור יעיל של מבני חלבון מתויגים (tagged protein constructs).
- ניתן להחיל גישה זו על פרויקטים שונים של הנדסה גנטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
יצירה מהירה ומקבילית של וקטורי פלסמיד מותאמים אישית באמצעות הרכבת גיבסון (Gibson assembly) מאפשרת ייצור יעיל של מבני חלבון מתויגים למחקרים פונקציונליים במערכות יונקים. גישה זו פותרת את צוואר הבקבוק של יציבות ביטוי מונחית-פרומוטור וזמינות המבנים, ותומכת בזרימות עבודה של גילוי מוקדם ותיקוף מטרות. השיטה משפרת את הביטחון החזוי ומאיצה את מיון הפורטפוליו על ידי קיצור זמני מחזורי השיクלונינג והגברת אמינות המבנים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מהירה של תפקוד גנים באמצעות מבני ביטוי הניתנים להתאמה אישית.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי תמיכה במחקרים מקביליים של חלבונים מסוג פראי (wild-type) וחלבונים מוטנטיים.
- משפר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי הבטחת ביטוי גנים יציב במודלים של תאי גזע.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין וקטורי ביטוי מאושרים עבור בדיקות פנוטיפיות או ביוכימיות המשך.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקות על ידי מתן אפשרות ליצירת מבנים הניתנים לשחזור עם תגים ופרומוטרים מוגדרים.
- מזרז את המוכנות לסריקה על ידי קיצור לוחות הזמנים להרכבת המבנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את תכנון הקונסטרקט למערכות הרלוונטיות למחלה על ידי אפשור ביטוי בתאי גזע של יונקים.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות ביטוי חסון המונע על ידי פרומוטר.
- מפחית את הסיכון לאובדן ביטוי, ובכך תומך במחקרי ביומרקרים תרגומיים כאשר הדבר רלוונטי.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו, המבוססת על הרכבת גיבסון (Gibson assembly), משתלבת בשלבי הגילוי המוקדמים ובשלבי פיתוח הבדיקה, ומגשרת על הפער שבין תכנון הקונסטרוקט לוולידציה פונקציונלית במערכות יונקים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי אפשור יצירה מהירה של קונסטרוקטים למחקרי תפקוד גנים.
- סריקה: מספקת פלסמידים הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה, עם פוטנציאל לפלט כמותי.
- אנליטיקה: מספקת קונסטרוקטים מאומתים רצפית, התומכים בהשוואה מהימנה בין השפעות של חלבון מסוג wild-type לחלבון מוטנטי.
- מחקר תרגומי: מקלה על ביטוי במודלים של תאי גזע הרלוונטיים למחלה, ובכך תומכת ברצף הפרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה הניתנת להרחבה ולשימוש חוזר עבור צרכים עתידיים לקונסטרוקטים על פני תוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד גנים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והאצה של יצירת קונסטרקטים עם רמת שחזור גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי קיצור מחזורי השיבוט.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מטרות מאושרות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון רצפים חישובי ובכלים ליצירת פריימרים.
- נדרשת גישה לתשתיות PCR, טיהור DNA וריצוף.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של שלבי תכנון ואימות הקונסטרוקט.
- ניתן להתאמה למערכות מודל שונות באמצעות בחירה מתאימה של פרומטורים ותגים.
- תלוי בזמינות של תבניות DNA ובלוחות הזמנים להשגת מקטעי DNA סינתטיים.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
In Silico Design: Final Plasmid and Overlapping Primers
3:58
Amplification of the DNA Fragments
5:44
DNA Purification Using Magnetic Beads
6:58
Assembly Cloning Reaction and Transformation of the Products in E. coli
8:21
Results: Cloning of CstF-54 and CstF-64 Mutants Under the Transcriptional Regulation of Human Elongation Factor 1α Promoter
9:47
Conclusion
