קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאמת את השימוש בזן המבטא לוציפראז לניטור לא פולשני של היווצרות ביופילם in vivo על ידי תאי קנדידה אלביקן. זה מושג על ידי השתלת שברי קטטר מושבים עם לוציפראז המבטא זן של קנדידה אלביקנס בגב העכבר. במהלך השלב השני, השמרים מורשים לגדול לשכבה עבה של תאים המוטמעים בתוך מטריצה חוץ-תאית, ויוצרים ביופילם בוגר בחלק הפנימי של הצנתרים.

לאחר מכן, מתווסף סובסטרט שיומר על ידי האנזים לוציפראז. תגובה זו מייצרת אור מדיד הדמיית ביולומינסנט או BLI משמשת לאחר מכן לרישום וכימות היווצרות הביופילם בתוך המארח החי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות אחרות, כמו מערכת Venmo המרכזית, הוא שאנו יכולים לבדוק עד שישה ביופילמים בתוך חיה אחת, ובכך להפחית מאוד את מספר החיות שאנו זקוקים לניתוח סטטיסטי.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בהיווצרות ביופילם של קנדידה אלביקנס מכיוון שהשיטה שלנו מאפשרת בדיקה קלה של רכיבים אנטי פטרייתיים קיימים וחדשים. כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי קנדידה אלביקנס, ביופילמים פטרייתיים. זה יכול להיות מיושם גם על מיקרובים אחרים כמו חיידקים או מינים מהנים אחרים.

הנהלים המוצעים קלים ליישום בכל מעבדה שיש לה גישה למתקן בעלי חיים 24 שעות לפני ההליך הכירורגי פתחה את החבילה המכילה את הצנתרים התלת-לומן בתוך ארון בטיחות ביולוגי. השתמש בפינצטה סטרילית כדי להסיר את כל החלקים המיותרים ובאזמל סטרילי כדי לחתוך את החלק המחובר לקטטר. לאחר מכן הניחו סרגל מתחת לאריזת הפלסטיק וחתכו את קטטר הפוליאוריטן לחתיכות באורך סנטימטר אחד.

לאחר מכן, מלאו כל קטטר בכ-1.8 מיליליטר של סרום בקר עוברי 100% ודגרו על החתיכות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת בבוקר, העבירו כל חתיכת קטטר מצופה סרום לצינורות מיקרו צנטריפוגה בודדים של 1.5 מיליליטר, וגרדו C אלביקנים מצלחת YPD למיליליטר אחד של PBS בצינור מיקרו צנטריפוגה נפרד בדילול של 1 עד 100. לאחר הספירה, יש לדלל את תרחיף התאים לריכוז סופי של חמש פעמים 10 לתאים הרביעיים למיליליטר.

והוסף מיליליטר אחד של תאים לכל אחד מחלקי הצנתר המצופים בסרום. אפשר לתאים להיצמד לצנתרים למשך 90 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ואז החזקת הצינורות במצב אנכי בעזרת פינצטה סטרילית.

שטפו בעדינות כל חתיכה דרך הלומן פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS כדי למקם את הצנתרים. התחל בגילוח הגב התחתון של עכבר מורדם בן שמונה שבועות הממוקם על כרית חימום. לאחר מכן יש לחטא את העור ולבצע חתך אחד קטן של 0.5 עד סנטימטר אחד מכל צד של החיה.

לאחר מכן, נתחו את ה-subcu עם מספריים כדי ליצור שתי מנהרות תת עוריות באורך של כ-1.5 סנטימטרים ורוחב של סנטימטר אחד. הכנס שלושה חלקי קטטר לכל מנהרה, וודא שהחלקים מונחים זה ליד זה בסידור אופקי ללא חפיפה. סוגרים את החתכים בתפרים ואז מנקים את הפצעים בעדינות רבה בעזרת חומר חיטוי.

לאחר מכן יש למרוח חומר הרדמה מקומי ישירות על החתכים ולתת חומר הרדמה היפוך המנטר את בעלי החיים עד להחלמתם המלאה. כדי לדמות את היווצרות הביופילם בנקודת הזמן הניסוי המתאימה, יש להזריק 100 מיקרוליטר של סליל וטרזין טריים שהוכנו תת עורית לכל אזור המכיל את הצנתרים בבעל חיים מורדם. לאחר מכן רכוש סריקות עוקבות עם זמני רכישה הנעים בין 20 ל-60 שניות עד להגעה לעוצמת האות המקסימלית.

במהלך רכישת המסגרת הבאה, הצב אזור עניין מעל כל שלישיית צנתרים כדי למדוד את ההדמיה הביולוגית או עוצמת אות ה-BLI של המסגרות שנרכשו בעבר. מקם אזור עניין מלבני בגודל קבוע גם על אזור בקרה כדי למדוד את אות הרקע בתוכנת תמונה חיה. מדוד את שטף הפוטונים דרך אזורי העניין עבור כל שלישיית קטטר כמו גם עבור הרקע.

לאחר חזרה על מדידות אלה עבור כל בעל חיים ובנקודות זמן שונות במהלך דוח היווצרות הביופילם, עוצמת אות ה-BLI של כל שלישיית קטטר היא שטף פוטונים לשנייה. ניתן להעתיק ולהדביק את הנתונים ישירות בתוכנית גיליון אלקטרוני. בתום ניסוי האורך יש להקריב כל בעל חיים, לחתוך את הרקמה התת עורית ולהשתמש בפינצטה סטרילית כדי להסיר את שברי הקטטר בזה אחר זה.

שטפו את הצנתרים פעמיים במיליליטר אחד של PBS כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן סוניקציה של החלקים בצינור מיקרו צנטריפוגה חדש במיליליטר אחד של PBS טרי ב-40,000 הרץ באמבט מים. סוניקט לאחר 10 דקות, הנח את הצינורות המכילים את הצנתרים על קרח וצלחת 100 מיקרוליטר מהדגימות המקוריות באחד עד 10 ואחד עד 100 דילולים על לוחות אגר YPD.

בשכפול. לבסוף שרטט את הממוצע וסטיית התקן של היחידות היוצרות את המושבה. ואות BLI עבור כל בעל חיים בקנה מידה לוגריתמי.

בתמונה זו, מוצגת חיה מייצגת המציגה את אות הביו-לומינסנציה יחד עם אזורי עניין המסומנים שישה ימים לאחר התפתחות הביופילם. שימו לב להיעדר איתות באזור הרקע של הבקרה המאשר את הגבלת הביופילם לאזורים הסמוכים לצנתרים המצופים בקנדידה. בניסוי מייצג זה, ניתן להבחין באות BLI ברור המופק על ידי הלוציפראז המבטא ביופילמים, בעוד שנראה שרק אות רקע מופק על ידי הזן מסוג Wild.

עלייה זו באות עוקבת אחר אותה מגמה כמו הגידול ביחידות יוצרות מושבה לביופילם ומדידות שטף הפוטונים עבור כל קבוצת בעלי חיים שנלקחו יחד. נתונים אלה ממחישים כי BLI היא טכניקה רבת עוצמה לניטור וכימות היווצרות ביופילם C albicans בוגר in vivo במודל עכבר תת עורי. לאחר השליטה הדבקה של מכשירים עם תאי קנדידה עשויה להימשך שעתיים, בעוד שהשתלת הצנתר יכולה להיעשות תוך 10 דקות לכל עכבר.

ניתן לבצע הדמיית BLI תוך חמש דקות לכל עכבר. היתרון הגדול בשימוש ב-BLI הוא שניתן לנטר את התפתחות הביומסה והביופילם שוב ושוב באותה חיה. עם הזמן בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו MRI או CT יכולות לספק מידע על מיקום הקתדרלה המדויק.

לאחר מכן ניתן להשתמש במידע זה לכימות במודלים מורכבים יותר כמו מודל קתדרלת הוורידים העמוקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה מאוד כיצד לבצע in vivo, ביופילם תת עורי, ss בעכברים, וזה עשוי להוות בסיס לניתוח מעמיק נוסף של אינטראקציות פתוגן מארח.