ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה
January 23rd, 2015
כאן אנו מציגים פרוטוקול מקובל על הקהילה בפורמט מולטימדיה להזרקה תת-רשתית של תאי RPE בחולדות ועכברים. גישה זו יכולה לשמש לקביעת פוטנציאל הצלה, פרופילי בטיחות ויכולות הישרדות של תאי RPE מושתלים עם השתלה במודלים של ניוון רשתית בבעלי חיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להזריק פיגמנט רשתית, אפיתל או תאי RPE לחלל התת-רשתית של מכרסמים תוך מזעור טראומה. זה מושג על ידי שימוש תחילה במחט חדה כדי לתקוע חור בעין של בעל חיים רגוע. לאחר מכן, התאים מוזרקים לחלל התת-רשתית באמצעות מחט קהה.
בשלב האחרון, העין מצופה בקרם לחות כדי לשמור על לחותה. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהיסטולוגיה ובשיטות הדמיה in vivo כדי לנטר את יעילות ההזרקה. בעוד שהשיטה שהראינו לכם היום הותאמה במיוחד להעברת תאי RPE לחלל התת-רשתית, הטכניקה עצמה ישימה באופן נרחב להעברת מגוון סוגי תאים וכימיקלים אחרים לחלל התת-רשתית לשימוש במגוון מחקרים פרה-קליניים.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שקשה לראות עד כמה ההזרקה בוצעה. הדגמות חזותיות של שיטה זו הן קריטיות מכיוון שקשה ללמוד את שלבי ההזרקה מבלי לראות אותם מבוצעים. באופן אישי.
כשעה לפני ההזרקה מחממים מראש תמיסת דיסוציאציה של תאים שאינם טריפסין, PBS סטרילי ואמצעי תרבית ל-37 מעלות צלזיוס מפרקים ומניחים את רכיבי המזרק עם מחט קהה בגודל 33 במים רותחים. לאחר מכן, נתקו את תאי ה-RPE בתמיסת הדיסוציאציה של התאים למשך חמש עד שמונה דקות. בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מגרדים בעדינות כדי לשחרר את התאים שעדיין מחוברים ואז מדללים את התאים ב-15 מיליליטר של מצע תרבית כדי לנטרל את האנזים, מעבירים את התאים המנותקים לצינור של 15 מיליליטר, ואז לאחר הספירה, מסובבים את התאים ומשהים מחדש את הגלולה פעמיים כפול 10 לתאים החמישיים למיקרוליטר בחימום מוקדם סטרילי.
לאחר מכן PBS מעביר את התאים לצינור מיקרו צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, ומעמיס את המזרק המעוקר ב-0.5 מיקרוליטר תאים להזרקה מיידית להזרקת התאים לאחר אישור הרגעה על ידי הבוהן, צבט, הנח את המכרסם המורדם על צדו כך שהעין שתוזרק פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, החזיקו את ראש החיה בשתי אצבעות ממש מעל האוזן ובלסת שלה ומתחו בעדינות את העור במקביל לעפעפיים כך שהעין תצא מעט מהשקע. לאחר מכן, החזק אותו בזווית.
כדי להימנע מלגעת בעדשה ולהקפיד להימנע מכלי דם, השתמש במחט החדה בגודל 30 כדי ליצור חור מיד מתחת לזריקות הלימבוס. עבוד טוב יותר עם שני אנשים כך שאדם אחד יוכל להעביר את המזרק, המחט הקהה והמזרק, מה שמאפשר למזרק לשמור על מיקוד בעין העכבר. כעת משוך את המחט החדה החד פעמית מהעין תוך שמירה על האחיזה בראש.
הקפידו לזכור בדיוק היכן נמצא החור ולהרכיב את המזרק הטעון מראש. מצויד במחט הבוטה על מניפולטור מיקרו, הכנס את קצה המחט הבוטה דרך החור. הקפידו שוב לא לגעת בעדשה ולדחוף בעדינות את המחט דרך העין עד שתורגש התנגדות.
שמירה על כל התנועות למינימום. הזרקו בזהירות את תאי ה-RPE לאט לחלל התת-רשתית. יתרחש ניתוק רשתית RPE.
עם זאת, הזרקה נקייה יותר ממזערת את הניתוק ומשפרת מאוד את הסיכוי לחיבור מחדש, ואז החזירו את המזרק לאט ומרחו טיפות לחות לעיניים כדי לשמור על לחות העין, תוך מעקב אחר החיה עד להתאוששות מלאה. תאי RPE יכולים להיות מועברים לחלל התת-רשתית של מכרסמים במהירות ובעקביות. שימוש בטכניקה זו.
אמנם אין צורך, אך ניתן למזער טראומות במידה רבה באמצעות מיקרו מניפולטור. עם הגדרה זו, כאשר היא מבוצעת בצורה נקייה, ניתן לזהות פלואורסצנטיות מתאי RPE מסומנים באמצעות אופטלמוסקופ סריקה קונפוקלי וניתן לדמיין את ניתוק הרשתית המושרה באמצעות מערכת טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. סריקה קונפוקלית נעשה שימוש באופטלמוסקופיה כדי ללכוד את התמונות הללו סביב כל אתר ההזרקה מיד לאחר ההזרקה התת-רשתית.
שימו לב, הניתוק שהוא העמוק ביותר אך לא חמור במרכז תמונות לאחר שליטה, ניתן לבצע את ההזרקה בפועל תוך חמש דקות אם היא נעשית כראוי בזמן השתתפות בהליך זה, חשוב לעבוד בזהירות ולצמצם תנועות מיותרות למינימום. לאחר צפייה בסרטון זה, תקוותנו היא שתהיה לך הבנה טובה והערכה לטכניקת ההזרקה התת-רשתית למכרסמים. אנו מקווים שזו תהיה דרך יעילה להעביר תאים, ובמקביל למזער אי נוחות וטראומה לעין המכרסמים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להזרקה תת-רשתית של תאי RPE במכרסמים, שמטרתו להעריך את הפוטנציאל הטיפולי שלהם במודלים של ניוון רשתית. השיטה ממזערת טראומה תוך אפשרות למסירה יעילה של תאים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- מחקר רשתית
רקע
- תאי האפיתל הפיגמנטי של הרשתית (RPE) חיוניים לבריאות הרשתית.
- הזרקות תת-רשתית הן שיטה נפוצה למסירת תאים טיפוליים.
- מזעור טראומה במהלך ההזרקה חיוני לתוצאות מוצלחות.
- טכניקות היסטולוגיות והדמיה יכולות להעריך את יעילות ההליך.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה אמינה להעברת תאי RPE במודלים של בעלי חיים.
- להעריך את הבטיחות וההישרדות של תאי RPE מושתלים.
- לספק פרוטוקול החל על סוגי תאים שונים למחקרים פרה-קליניים.
שיטות בשימוש
- שימוש במחט חדה ליצירת נקודת כניסה בעין.
- הזרקת תאי RPE באמצעות מחט קהה לחלל התת-רשתית.
- יישום של קרם לחות לשמירה על לחות העין לאחר ההזרקה.
- שימוש בהיסטולוגיה והדמיה in vivo לצורך ניטור.
תוצאות עיקריות
- השיטה מעבירה תאי RPE ביעילות עם מינימום טראומה.
- ניתוח היסטולוגי מראה אינטגרציה מוצלחת של התאים המושתלים.
- הדמיה in vivo מאשרת את חיוניות התאים שהוזרקו לאורך זמן.
- הפרוטוקול יכול להתאים לסוגי תאים וחומרים אחרים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק בסיס למחקרים על השתלת תאי RPE.
- הוא מדגים את הפוטנציאל ליישומים רחבים יותר בטיפולים ברשתית.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על שיטה זו לחקר טיפולים שונים.
