שיטה פשוטה DNA הקרינה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש בהיברידיזציה של DNA in situ כדי למפות רצפים של Heterochromatin לכרומוזומים במיטוזה. הדבר מושג תחילה על ידי דיסקציה של מוחות של זחלי דרוזופילה בשליש השלישי, או של רקמה אחרת הרלוונטית למחקר. השלב השני הוא קיבוע של הרקמה על לוחית כיסוי.

בשלב הבא, הרקמה נמעכה בין הזכוכית מכסה לבין הפסית. כדי להכין את הכרומוזומים להיברידיזציה, השלב הסופי הוא ביצוע היברידיזציה של גששים (probes) אוליגו סינתטיים קצרים לרקמה הממעכה. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להראות את הלוקליזציה של רצפים המשלימים לגששי האוליגו על הכרומוזומים.

היתרון העיקרי של שיטה זו על פני שיטות קיימות הוא פשטותה. רוב שיטות ההכלאה של כרומוזומים ו-C2 אחרות כוללות שטיפות בכמויות גדולות של formamide, שעלולות להיות יקרות ומסורבלות. השיטה שלנו אינה דורשת שטיפות formamide, מה שהופך אותה לטכניקה זולה, נקייה ומהירה יותר.

אף ששיטה זו מספקת דרך פשוטה למיפוי נראה של רצפים על הכרומוזומים הסומטיים במוחות של דרוזופילה, ניתן להשתמש בה גם למיפוי רצפים בסוגים אחרים של כרומוזומים מרקמות שונות באורגניזמים שונים. עבור כל סרטית שיש להכין, הכינו ארבע או חמש רקמות, אך לא יותר עבור דיסקציות של מוח. התחילו בבחירת פשפשונים בשלב הזחילה של האינסטאר השלישי ואיספם לתוך טיפה של 1x PBS.

בחרו מבחנות לאיסוף שאינן עמוסות מדי. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה עדינה במיוחד כדי לתפוס את וווי הפה ובזוג נוסף כדי לתפוס את הגוף בשליש התחתון שלו. לאחר מכן, משכו בעדינות את וווי הפה כדי לחשוף את המוח, הגנגליונים הוונטרליים, בלוטות הרוק וחלקים ממערכת העיכול.

בשלב הבא, הפרידו בעזרת פינצטה את המוח ואת הגנגליונים הוונטרליים מהרקמות האחרות והעבירו אותם לטיפה של XPBT על פלטת פלסטיק. עבור דיסקציות של אשכי נסיה, אספו Puy זכרים בני שלושה ימים. ל-Puy בני שלושה ימים גוף צהוב ועיניים אדומות.

אלו עם פדי הכנפיים הקטנים יותר הם זכרים. אחזו את הבובנאי בחלק העליון של הבטן, סמוך לאזור החזה, באמצעות זוג פינצטות אחד, ובזוג פינצטות שני תפסו את הקצה הדיסטלי ביותר של הבטן, ולאחר מכן שלפו את האשכים בעלי צורת טיפה.

הם מוקפים בגופי שומן שניתן להסיר בטלטול עדין; נתקו כל חלקי גוף חיצוניים מהאשכים, שכן אלו ימנעו מעיכה תקינה, והעבירו את האשכים לטיפה של XPBT אחת על פלטה נקייה. לאחר איסוף כל הרקמות, טיפלו בהן בתמיסה היפוטונית כדי לשפר את ההפרדה של הכרומטידות האחיות. באזורים כרומטיים, העבירו את הרקמות לטיפה של 0.5% sodium citrate למשך 10 דקות.

כדי להשיג אפקט זה, לא מומלץ להשתמש ב-colchicine מכיוון שהוא עלול לגרום לארטיפקטים במורפולוגיה של הכרומוזומים. כעת, קיבחו את הרקמות באמצעות פינצטה עדינה במיוחד. העבירו אותן לטיפה של 20 µL של 2.5% PFA ב-45% acetic acid שהוכנה טרי על זכוכית כיסוי נקייה שעברה טיפול ב-sigma coat; פזרו את הרקמות באופן שווה במקבע והדגירו אותן למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן המשיכו במעיכה (squashing) של זכוכית הכיסוי. התחילו בהנחה עדינה של סלייד מצופה ב-polylysine, כאשר הפנים פונה כלפי מטה אל הרקמה וזכוכית הכיסוי.

אפשרו לזכוכית המכסה להיצמד לצדו התחתון של הפסית ללא לחיצה. טיפול בזכוכית המכסה באמצעות sigma coat מסייע להבטיח שרקמת הדחיסה (squash tissue) תישאר על הפסית לאחר הסרת זכוכית המכסה. עם זאת, לעיתים רחוקות הרקמה עלולה להישאר דבוקה לזכוכית המכסה.

בשלב זה, אנו ממליצים לבצע מעיכות רקמה חוזרות. כעת הפכו את השקופית והניחו אותה בתוך פיסת נייר עבה מקופלת. לאחר מכן, על משטח יציב, לחצו באמצעות האגודל בחוזקה ובקו ישר כלפי מטה מעל זכוכית המכסה.

אין ללחוץ באופן שגורם להחלקה של המכסה, שכן הדבר יוביל למריחה של הרקמה. לחיצה חזקה מאוד מובילה בדרך כלל לכרומוזומים בעלי רזולוציה טובה בתוך הרקמה הממעוכה. עם זאת, לעיתים עשויה להופיע שונות באיכות הכרומוזומים, כגון כרומוזומים לא שלמים, מעוכים או מקוטעים.

לפיכך, אנו ממליצים שוב לבצע שתי או שלוש חזרות של מעיכה של הרקמה. העבירו את המכלול לגוש קרח למספר דקות, ולאחר מכן טבלו אותו בחנקן נוזלי עד שהחנקן מפסיק לרתוח או למשך זמן רב יותר. לאחר הוצאת העשייה מיד לפני הפשרת הרקמה, השתמשו בלהב תער חדש כדי להרים פינה של זכוכית המכסה, ובכך להסירה.

הקפידו להימנע משריטות של הרקמה. לאחר מכן, הניחו במהירות את הפלטה בתוך צנצנת קופלין (coplin jar) מלאה ב-100% ethanol, והשאירו לה להספגה למשך חמש דקות לפחות. הוציאו את הפלטה, סננו את עודפי ה-ethanol ללא מגע ברקמה, והניחו לפלטה להתייבש באוויר במשך שעה.

ניתן לאחסן את השקופיות למשך שבועות עד חודשים בתא ייבוש. התחילו בהוספת 100 nanograms של כל גשושית ל-20 microliters של hybridization buffer בריכוז 1.1 x, כדי לקבל תמיסה של 22 microliters של hybridization buffer בריכוז one x. לאחר מכן, טפטפו את התערובת על הרקמה המקובעת, מבלי לגעת ברקמה, והניחו בעדינות זכוכית כיסוי.

בועת אוויר קטנה שאינה נוגעת ברקמה לא תגרום לבעיות, אך ריבוי בועות מחייב הנחה מחדש של זכוכית הכיסוי. הניחו את הפיתה על הצד השטוח של בלוק חימום בטמפרטורה של 95 °C וכסו אותה בנייר אלומיניום. המתינו חמש דקות, שבמהלכן תוכלו להכין את תא הלחות על ידי הוספת מגבונים רטובים לקופסת טיפים.

לאחר מכן, הוציאו את השקופית. עטפו את השקופית בזהירות ב-paraform מתוח והעבירו אותה לתא לחות המורכב ממגבת לחה בתוך קופסת טיפים. הדגרימו את השקופית בתא למשך ארבע שעות או למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. טמפרטורה זו מתאימה לגששים עם תכולת GC נמוכה, אך עבור גששים עם תכולת GC גבוהה יותר, ייתכן שיהיה צורך בביצוע התאמות (troubleshooting) של טמפרטורות ההיברידיזציה.

לאחר הדגירה, הסר בזהירות את ה-para film והרם לאט את מכסי הזכוכית (cover slip) מאחת הפינות. לאחר מכן, שטוף את הפסחית שלוש פעמים בבופר 0.1 XSSC למשך 15 דקות לכל שטיפה. כסה את הצנצנת בנייר אלומיניום במהלך השטיפות כדי למזער את החשיפה לאור.

עבור גששים ביוטיניליים ארוכים, יש להוסיף rod domine avadon ולשטוף לפני ההמשך. ראשית, ייבשו את האזור שסביב הרקמה וכסו את הרקמה ב-100 µL של תמיסת חסימה. לאחר מכן, הניחו בעדינות זכוכית כיסוי חדשה ללא בועות אוויר.

שוב, עטפו את השקופית ב-param. לאחר מכן, דגרו את השקופית בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. שנית, לאחר הדגירה, הסירו את זכוכית הכיסוי וספגו את הנוזלים מסביב לרקמה בעזרת נייר ניגוב.

לאחר מכן, יש להניח על הרקמה 100 µL של rumine avadon בדילול של 1:1000 ב-SBT. לאחר מכן, יש לכסות, לעטוף ולהדגיר את הפיתח כפי שנעשה עם הבלוק. לבסוף, יש להסיר בזהירות את זכוכית הכיסוי ולשטוף את הפיתח.

בצעו שלושה שטיפות ב-four x SSCs T, ולאחריהן שלושה שטיפות ב-0.1 XSSC. כל שלב שטיפה צריך להימשך לפחות חמש דקות. בהמשך הפרוטוקול, ייבשו את השקופיות על ידי ספיגת עודפי התמימות ללא מגע ברקמה.

לאחר מכן, הניחו את השקופית כאשר צד הרקמה פונה כלפי מעלה במקום חשוך למשך 10 עד 15 דקות או עד שהלחות נעלמת לחלוטין. כעת, בצעו סגירה של השקופית באמצעות 11 µL של vector shield עם DPI והניחו בזהירות זכוכית כיסוי ללא sigma coat. אם התווך אינו מגיע לכל הקצוות, הוסיפו מספר µL נוספים של תווך מהקצה ונגבו את העודפים.

לאחר מכן, אטמו את כיסית הזריקה בעזרת לק ושימרו את השקופית במצב אנכי במקום חשוך עד לייבוש הלק, תהליך הדורש בדרך כלל לפחות חצי שעה. לאחר מכן, שמרו את השקופית בטמפרטורה של 20- degrees Celsius למשך עד שבוע, ובצעו דימוג של הרקמה בהקדם האפשרי. קבוצה של אוליגואנוקלאוטידים קצרים שסונתזו מסחרית עם צימודים פלורסצנטיים וגשש ביוטיניליבי ארוך יותר שהוכן בשיטת Nick Translation, הוגמרו כולם לכרומוזומים מסוגים שונים של רקמות.

בשימוש במתודולוגיה המתוארת, הגשש לרצף החזרתי לווייני של 359 זוגות בסיסים של Drosophila Melanogaster זיהה בלוק גדול של מספר מגה-זוגות בסיסים על כרומוזום x ואזור קטן בהרבה על כרומוזום 3. גשש ארוך יותר נגד הלוויין ה-responder זיהה בלוקים חזרתיים המורכבים ממספר עותקים חזרתיים נמוך יחסית של כ-700. לפיכך, שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של בלוקים לווייניים קטנים מאוד.

כאשר משך שלב הטיפול בתמיסה היפוטונית הוכפל ל-10 דקות, ההפרדה בין כרומטידות האחיות גברה. ניתן לשלב הליך זה עם שיטות אחרות, כגון צביעה בנוגדנים, כדי להשיב על שאלות כגון האם חלבוני כרומטין מסוימים ממוקמים ברצפים ספציפיים.