שיטה פשוטה DNA הקרינה באתר הכלאה לכרומוזומים "סתמת

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בהכלאה של DNA באתרו כדי למפות רצפים כרומטיים הטרו לכרומוזומים מיטוטיים. זה מושג על ידי ניתוח מוחות של שלישי בזחלי דרוזופילה כוכב, או רקמה מעניינת אחרת. השלב השני הוא קיבוע הרקמה על החלקת כיסוי.

לאחר מכן, הרקמה נמעכת בין החלקת הכיסוי למגלשה. כדי להכין את הכרומוזומים להכלאה, השלב האחרון הוא הכלאה של בדיקות אוליגו קצרות מסונתזות לרקמה המעוכה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת להצגת לוקליזציה של רצפים משלימים לבדיקות האוליגו על הכרומוזומים.

היתרון העיקרי של שיטה זו על פני השיטות הקיימות הוא הפשטות שלה. רוב שיטות ההכלאה האחרות של כרומוזום ו-C כוללות שטיפות עם כמויות גדולות של אמיד צורה, שעלולות להיות יקרות ומבולגנות. השיטה שלנו אינה דורשת שטיפות IDE, מה שהופך אותה לטכניקה זולה, נקייה ומהירה יותר.

למרות ששיטה זו מספקת דרך פשוטה למפות באופן גלוי רצפים על הכרומוזומים הסומטיים של מוחות דרוזופילה, ניתן להשתמש בה גם למיפוי רצפים על סוגים אחרים של כרומוזומים מרקמות שונות באורגניזמים השונים. עבור כל שקופית שיש לעשות, הכינו ארבע או חמש רקמות, אך לא יותר לנתיחות מוח. התחל בבחירת זחלי כוכב שלישי נודדים ואיסוף אותם בטיפה של XPBS אחד.

בחר בקבוקונים לאסוף מהם שאינם צפופים. תחת טווח הדיסקציה, השתמש בפינצטה עדינה במיוחד כדי לתפוס את ווי הפה וזוג נוסף כדי לתפוס שני שליש לאורך הגוף. לאחר מכן משוך בעדינות את ווי הפה כדי לחשוף את המוח, גרעיני הגחון, בלוטות הרוק וחלקים ממערכת העיכול.

לאחר מכן, הרחיקו את גרעיני המוח והגחון מהרקמות האחרות והעבירו אותם לטיפה של XPBT אחד על צלחת פלסטיק. עבור נתיחות אשך נסיה אוספות פוי זכר בן שלושה ימים. לפוי בן שלושה ימים יש גוף צהוב ועיניים אדומות.

אלה עם כריות כנפיים קטנות יותר הם זכרים. אחזו בגולם בחלק העליון של הבטן ליד אזור בית החזה עם זוג פינצטה אחד ועם זוג פינצטה שני. תפוס את הקצה הדיסטלי מאוד של הבטן, ואז משוך החוצה את האשכים בצורת דמעה.

הם מוקפים בגופי שומן שניתן לנער בעדינות, לנתק את כל חלקי הגוף החיצוניים מהאשכים, מה שימנע ריסוק נכון ולהעביר את האשכים לטיפה של XPBT אחד על צלחת נקייה. לאחר איסוף כל הרקמות, יש לטפל בהן בתמיסה היפוטונית, לשיפור ההפרדה של כרומטידות אחיות. באזורים הכרומטיים e, העבירו את הרקמות לטיפה של 0.5% נתרן ציטראט למשך 10 דקות.

כדי להשיג אפקט זה, קולכיצין אינו מומלץ מכיוון שהוא יכול לגרום לחפצים במורפולוגיה של הכרומוזומים. כעת, תקן את הרקמות באמצעות פינצטה עדינה במיוחד. העבירו אותם לטיפה של 20 מיקרוליטר של 2.5% PFA טרי ב-45% חומצה אצטית על כיסוי שטופל במעיל סיגמא נקי, רווחו את הרקמות החוצה באופן שווה בקיבוע ודגרו אותן במשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן המשיכו בריסוק החלקות הכיסוי התחילו בהנחת שקופית מצופה פוליליזין עם הפנים כלפי מטה על הרקמה והחלקת הכיסוי.

אפשר לכיסוי להחליק להיצמד לחלק התחתון של השקופית מבלי ללחוץ. מתייחס. החלקות כיסוי בשכבת סיגמא עוזרות להבטיח שרקמת הדלעת תישאר על המגלשה לאחר הסרת החלקת הכיסוי. עם זאת, לעתים רחוקות הרקמה יכולה להישאר מחוברת להחלקת הכיסוי.

במהלך שלב זה, אנו ממליצים לבצע שכפול של מעיכת רקמות. כעת הפוך את השקופית והניח אותה לפיסת נייר עבה מקופלת. ואז על משטח יציב, בעזרת האגודל לחץ חזק מאוד ישר כלפי מטה מעל החלקת הכיסוי.

אל תלחץ בצורה שמחליקה את המכסה אחרת הוא ימרח את הרקמה. לחיצה חזקה מאוד מביאה בדרך כלל לכרומוזומים שנפתרו יפה בתוך רקמת הדלעת. עם זאת, לעיתים, אתה עלול להיתקל בשונות באיכות הכרומוזומים כגון כרומוזומים לא שלמים, מעוכים או מקוטעים.

אז שוב, אנו ממליצים לבצע שניים או שלושה מעיכת רקמות משוכפלות. העבירו את המכלול לגוש קרח למשך מספר דקות, ולאחר מכן טבלו אותו בחנקן נוזלי עד שהחנקן מפסיק לרתוח או יותר לאחר הסרת השקופית מיד לפני שהרקמה מפשירה, השתמש בסכין גילוח טרי כדי להעיף פינה של החלקת הכיסוי. ובכך להסיר אותו.

היזהר להימנע מגירוד הרקמה. לאחר מכן הכניסו במהירות את השקופית לצנצנת קופלין מלאה באתנול 100%, ובואו נספוג לפחות חמש דקות. הסר את פתיל ההחלקה הרחק עודפי אתנול מבלי לגעת ברקמה ותן לאוויר המגלשה להתייבש במשך שעה.

לאחר מכן ניתן לאחסן שקופיות במשך שבועות עד חודשים בתא ייבוש. התחל בהוספת 100 ננוגרם מכל בדיקה ל-20 מיקרוליטר של מאגר הכלאה של 1.1 x לתמיסה של 22 מיקרוליטר של מאגר הכלאה אחד x. לאחר מכן פיפטה את התערובת על הרקמה הקבועה, השאירה את הרקמה ללא מגע ומרחו בעדינות החלקת כיסוי.

בועת אוויר קטנה שאינה נוגעת ברקמה לא תציג בעיות, אך כל בועות נוספות, מצדיקה מריחה חוזרת של החלקת הכיסוי. הנח את השקופית בצד השטוח של גוש חום של 95 מעלות צלזיוס וכסה אותה בנייר כסף. המתן חמש דקות שבמהלכן תוכל להכין את תא הלחות על ידי הוספת מגבות נייר רטובות לקופסת קצה.

לאחר מכן הסר את השקופית. עטפו בזהירות את השקופית בפרפורם מתוח והעבירו אותה לתא לח המורכב ממגבת לחה בקופסת טיפים, דגרו את המגלשה בתא למשך ארבע שעות עד לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. טמפרטורה זו עובדת היטב עבור בדיקות עם תכולת GC נמוכה, אך עבור בדיקות עם תכולת GC גבוהה יותר, ייתכן שיידרש פתרון בעיות עם טמפרטורות הכלאה.

לאחר הדגירה, הסר בזהירות את סרט הפרה והרם לאט את החלקת הכיסוי בפינה אחת. לאחר מכן שטפו את השקופית שלוש פעמים במאגר 0.1 XSSC למשך 15 דקות לכל כביסה. מכסים את הצנצנת בנייר כסף במהלך הכביסה כדי למזער את החשיפה לאור.

לבדיקות ביוטיניליות ארוכות, הוסף מוט דומין avadon ושטוף לפני שתמשיך. ראשית, יבש את האזור סביב הרקמה וכסה את הרקמה ב-100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה. לאחר מכן יש למרוח בעדינות החלקת כיסוי חדשה מבלי ללכוד בועות.

שוב, עטפו את השקופית בפרם. לאחר מכן דגרו את המגלשה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שנית, לאחר הדגירה, הסר את החלקת הכיסוי וכתם סביב הרקמה בעזרת מגבון.

לאחר מכן על הרקמה, מרחו 100 מיקרוליטר של אחד עד 1000 רומין אבדון מדולל ב-SBT. המשך על ידי כיסוי, עטיפה ודגירה של המגלשה כפי שנעשה עם הבלוק. לבסוף, הסר בזהירות את החלקת הכיסוי ושטוף את השקופית.

השתמש בשלוש שטיפות בארבעה x SSCs T, ולאחר מכן שלוש שטיפות ב-0.1 XSSC. כל שלב כביסה צריך להיות באורך של חמש דקות לפחות. בהמשך לפרוטוקול, יבש את השקופיות על ידי ניקוי המאגר העודף מבלי לגעת ברקמה.

לאחר מכן הניחו את צד רקמת השקופית כלפי מעלה במקום חשוך למשך 10 עד 15 דקות או עד שהלחות מתפזרת לחלוטין. כעת, הרכיבו את השקופית באמצעות 11 מיקרוליטר של מגן וקטורי עם DPI והנמיכו בזהירות על תלוש כיסוי מעיל שאינו סיגמא. אם המדיום לא מגיע לכל הקצוות, מרחו עוד כמה מיקרוליטרים של מדיה מהקצה ונגבו את כל העודפים.

לאחר מכן אטמו את החלקת הכיסוי עם לק ואחסנו את השקופית זקופה במקום חשוך בזמן שהלק מתייבש, מה שלוקח בדרך כלל לפחות חצי שעה. לאחר מכן אחסן את השקופית במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שבוע וצלם את הרקמה בהקדם האפשרי. קבוצה של אוליגואים קטנים מסונתזים מסחרית עם מצומדים פלואורסצנטיים ובדיקה ביוטינילית ארוכה יותר שנעשתה על ידי Nick Translation הוכלאו כולם לכרומוזומים מכמה סוגי רקמות שונים.

באמצעות המתודולוגיה המתוארת, הגשושית לחזרת הלוויין של זוג הבסיסים Drosophila Melanogaster 359 זיהתה בלוק זוגות רב מגה-בסיסים גדול על ה-x ואזור קטן בהרבה על כרומוזום שלוש. בדיקה ארוכה יותר נגד לוויין המגיב זיהתה בלוקים חוזרים המורכבים ממספרי עותקים חוזרים נמוכים יחסית של כ-700. לפיכך, שיטה זו מאפשרת הדמיה של גושי לוויין קטנים מאוד.

כאשר שלב הטיפול בתמיסה ההיפוטונית הוכפל למשך 10 דקות, ההפרדה של כרומטידות אחיות גדלה מזרחה. ניתן לשלב הליך זה עם שיטות אחרות כגון צביעת נוגדנים על מנת לענות על שאלות כמו האם חלבוני כרומטין מסוימים ממוקמים ברצפים ספציפיים.