פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים
12 במאי 2015
פרוטוקול רמת מבוא זה מתאר את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הנדרשים להשלמת צביעה אימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך שימוש בסמנים למיקרוגליה ואלמנטים עצביים כדוגמה.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש באימונוהיסטוכימיה על מנת להדמיא חלבונים רצויים. בדוגמה זו, IBA1 עבור מיקרוגליה ו-pan neuronal עבור נוירונים. דבר זה מושג תחילה על ידי הנחת חתכים מוכנים בתוך תמיסת חסימה (blocking solution) כדי למנוע קישור לא ספציפי.
כשלב שני, נוגדנים המזהים את שני החלבונים המבוקשים מונחים על החתכים למשך הלילה. לאחר מכן, החתכים נשטפים ומודגרים בנוגדנים משניים כדי להוסיף תגי פלואורסצנציה לנוגדנים הראשוניים. תוצאות הסימון הכפול יכולות להצביע על צביעות של מיקרוגליה בתוך שדות של נוירונים.
בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בטכניקה זו יתקשו בתחילה בשל ריבוי המשתנים שיש להגדיר. היום תדגים את הטכניקה הזו הייזל מיי, סטודנטית לתואר ראשון במעבדה שלנו. כדי להתחיל, יש לקבע ולחתוך בזהירות מוחות של מכרסמים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף, ולאחר מכן לאחסן אותם בזהירות בטמפרטורה של 80°C- עד למועד השימוש בהם.
כאשר תהיו מוכנים להמשיך בפרוטוקול, הוציאו את השקופיות מהמקפיא והפשיתו אותן בטמפרטורת החדר. לאחר ההפשרה, הניחו את השקופיות במעמד ושטפו אותן שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם. מנקודה זו ואילך, אין להניח לחתכים להתייבש.
ייבשו את קצוות השקופיות וצרו מסביב לקצה השקופית גבול דוחה נוזלים באמצעות עט PAP כדי להבטיח כיסוי אחיד של הנוזל ולהפחית אפקטי אפקטי קצה. לאחר מכן, בצעו חסימה (blocking) של החתכים על ידי הוספת 300 µL של סרום ב-PBS לכל שקופית. הסרום צריך להיות מהמין שבו הופק הנוגדן המשני.
במקרה זה, נעשה שימוש בסרום חמור. ודאו שתמיסת החסימה מגיעה עד לקצה הזכוכית ומכסה את הרקמה לחלוטין. כדי למנוע צביעה לא אחידה, הניחו את הזכוכית בתוך תא לחות להדגרה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
במהלך הדגירה, הכין את הנוגדנים הראשוניים על ידי דילול של נוגדן IBA1 ביחס של 1:5,000, ושל נוגדן pan-neuronal ביחס של 1:500 בתוך תערובת של 1% donkey serum ב-PBS. הסר את תמיסת החסימה והוסף 300 µL של תמיסת הנוגדנים, המכילה את שני הנוגדנים הרלוונטיים. כמו כן, הכן שלוש שקופיות ביקורת.
הוסף 300 µL של ה-IVA, בדילול אחד בלבד, לשקף אחד; 300 µL של דילול נוגדן pan neuronal בלבד לשקף שני; ו-300 µL של 1% donkey serum ב-PBS לשקף שלישי. הנח את כל השקפים לתא לחות והדגש אותם למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת בבוקר, שטוף את השקפים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם.
הכינו את תערובת הנוגדנים המשניים הפלואורסצנטיים על ידי דילול של שניהם ביחס של 1:250 ב-1% Donkey serum ב-PBS. הוסיפו 300 microliters מהתערובת לכל סלייד, והניחו את הסליידים בתא לחות חסיך אור למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הסליידים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם, ולבסוף, שטפו אותם במים מזוקקים פעמיים.
הגנו על השקופיות מפני אור במהלך השטיפה. הוסיפו לכל שקופית ב-PBS מספר טיפות של תמיסת קיבוע מימית המסייעת בשימור עוצמת האות הפלואורסצנטי. לאחר מכן, כסו את השקופית בזכוכית כיסוי והסירו בועות אוויר שנותרו באמצעות מקלוני צמר גפן כדי לאטום את תמיסת הקיבוע על השקופיות ולמנוע את התייבשות החתכים.
יש למרוח לק על הקצוות. יש להשאיר את הלשקיות לייבוש במצב שטוח למשך שעה בתוך קופסה המוגנת מאור, לפני אחסון במכל אטום לאור העטוף בנייר רפלקס בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר שהלק התייבש, יש להעביר את הלשקיות לחדר המיקרוסקופ לצורך הדמיה.
הכינו את החדר על ידי כיבוי התאורה התקרה וחסימה של מקורות אור חיצוניים אחרים. הדליקו את המיקרוסקופ, את מקור האור הפלואורסצנטי ואת מחשב הדימות. לאחר מכן, הניחו סלייד על במה המיקרוסקופ והביאו אותו למיקוד.
באמצעות התוכנה הנלווית, הגדירו את זמן החשיפה עבור כל אורך גל בנפרד. הימנעו מחשיפת יתר של הדגימה לאור למשך פרקי זמן ממושכים כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photobleaching) של הדגימה. לאחר מכן, רכשו תמונות בכל ערוץ מבלי להזיז את הסבך או לשנות את המיקוד.
שלבו את התמונות באמצעות תוכנת הדימוג ושמרו אותן לצורך ניתוח תמונות מאוחר יותר. באמצעות פרוטוקול הצביעה שתואר כעת, ניתן להשיג בקלות תמונות פלואורסצנטיות כדוגמת אלו המוצגות כאן; בערוץ האדום מופיעים בבירור מיקרוגליה חיוביים ל-IBA1, ובערוץ הירוק בולטים נוירונים חיוביים ל-pan neuronal מעל הרקע. מוצגות תמונות הביקורת עבור שני סוגי צביעות נוגדנים אלו.
סימון כפול כהה עם IBA1 וסמן נוירונלי כללי (pan neuronal marker) המוצג כאן, מדגים בעיקר מיקרוגליה מסועפת עם שלוחות נוירונליות דקות וארוכות הנראות לאורך השכבות הקורטיקליות. תוצאות צביעה דומות לאלו המוצגות כאן אפשריות גם כאשר איכות הרקמה ירודה. איכות רקמה ירודה באה לידי ביטוי בהיעדר גופי תא מוגדרים בבירור ובשלוחות מיקרוגליות ונוירונליות מקוטעות.
קיימת חוסר בהירות בצביעת המיקרוגליה והיעדר מוחלט של צביעה עצבית, מה שהופך את התמונה המודבקת (overlaid) לבלתי משמעותית במהלך ניסיון ביצוע טכניקה זו. חשוב לכסות את החתכים באופן אחיד ולזכור לא לתת להם להתייבש בין השלבים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של טכניקות אימונוהיסטוכימיות מבואיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את תהליך הצביעה האימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך התמקדות במיקרוגליה ובמרכיבים נוירונליים. הוא מפרט את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הדרושים לוויזואליזציה מוצלחת של חלבונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונוהיסטוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה המשמשת להדמיה של חלבונים ספציפיים בחתכי רקמה.
- מיקרוגליה הם תאי החיסון העיקריים במוח, והם ממלאים תפקיד מכריע בנוירו-דלקת.
- נוירונים הם היחידות הבסיסיות של המוח, האחראיות על העברת מידע.
- סימון כפול מאפשר הדמיה סימולטנית של סוגי תאים שונים.
מטרת המחקר
- להדגמת השימוש באימונוהיסטוכימיה לצורך ויזואליזציה של מיקרוגליה ונוירונים.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים המעוניינים לחקור רקמת מוח.
- לשיפור ההבנה של אינטראקציות תאיות במוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת חתכי מוח ותמיסת חסימה למניעת קישור לא ספציפי.
- החלת נוגדנים ראשוניים הספציפיים לחלבונים מיקרוגליאליים ונוירונליים.
- אינקובציה של החתכים עם נוגדנים משניים להחדרת תגים פלואורסצנטיים.
- שלבי שטיפה להסרת נוגדנים שאינם קשורים ולשיפור בהירות האות.
תוצאות עיקריות
- סימון כפול מוצלח של מיקרוגליה ונוירונים בחתכי מוח של מכרסמים.
- ויזואליזציה של אינטראקציות של מיקרוגליה עם אלמנטים נוירונליים.
- הדגמת יעילותו של הפרוטוקול האימונוהיסטוכימי.
- אספקת שיטה הניתנת לשחזור למחקרים עתידיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מדגיש ביעילות את נוכחותן של מיקרוגליה ושל נוירונים.
- אימונוהיסטוכימיה היא כלי בעל ערך למחקר במדעי המוח.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו כדי לחקור פתולוגיה של המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אימונוהיסטוכימיה מאפשרת מיפוי מרחבי מדויק של ביטוי חלבונים ברקמה, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי תרופות למדעי העצבים. סימון כפול פלואורסצנטי מאפשר ניתוח קולוקליזציה של מיקרוגליה ונוירונים, ומספק תובנות לגבי מסלולים נוירו-דלקתיים ואינטראקציות תאיות הרלוונטיות לטיפולים במערכת העצבים המרכזית (CNS). שיטה זו מגבירה את הביטחון החזוי על ידי יצירת נתוני דימות כמותיים וניתנים לשחזור לבדיקת היפותזות בשלבים מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של מעורבות המטרה (target engagement) באוכלוסיות של מיקרוגליה ונוירונים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על לוקליזציה של חלבונים ברקמת מוח רלוונטית למחלה.
- ערך ניבוי: מסייע בתיעדוף תיק הפיתוח (portfolio triage) על ידי אישור נוכחות המטרה וההקשר התאי לפני אופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization).
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פרוטוקולי צביעה סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור סמני מיקרוגליה ונוירונים, הישימים לסריקת תרכובות.
- פלט כמותי: מייצרת נתוני עוצמת פלואורסצנציה המאפשרים השוואה של השפעות טיפול על ביטוי המטרה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתנת להתאמה לאנטיגנים מרובים, ותומכת בפיתוח בדיקות מרובות (multiplexed) לצורך ניתוח מסלולים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מצבים של דלקת נוירוגנית באמצעות מעקב אחר מצבי הפעלה של מיקרוגליה לצד שלמות נוירונלית.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro להקשר של רקמה in vivo, ובכך מחזק את ההלימה של סמנים ביולוגיים.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק בסיס לקריטריונים של go/no-go באמצעות ראיות היסטופתולוגיות של מודולציה של המטרה והשפעות לא ספציפיות (off-target effects).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת שכלול איטרטיבי של מועמדים לתרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS) בהתבסס על מעורבות המטרה ברמת הרקמה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי חשיפת דפוסי קולוקליזציה של מטרות אימונומודולטוריות עם סמנים נוירונליים.
- סריקה: מספק חתכי רקמה מוכנים לבדיקה עם איכות צביעה עקבית לצורך פרופיל של ספריות תרכובות.
- אנליטיקה: מספק קריאות פלואורסצנציה כמותיות המאפשרות השוואה סטטיסטית של ביטוי חלבונים בין קבוצות ניסיוניות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מולקולריים לפנוטיפים תאיים ברקמת מוח, ובכך מסייע בתיקוף של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה סטנדרטי ל-IHC שניתן ליישום במגוון פרויקטים של מדעי העצבים ומחלקה של מטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות זיהוי חלבונים ישיר עם רזולוציה מרחבית בארכיטקטורה של רקמה טבעית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של חסימה, טיטרציית נוגדנים ודימוי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בביולוגיה של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על פורטפוליו הפיתוח: מאפשר קידום מותאם סיכונים על ידי אישור מעורבות המטרה (target engagement) בסוגי תאים רלוונטיים לפני מחקרים פרה-קליניים יקרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בקיבוע רקמות, חיתוך וטיפול בנוגדנים כדי לשמור על שלמות האנטיגן.
- תלוי בתשתית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח תמונות לצורך גילוי וכימות של האות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין צוותים של תנאי חסימה (blocking) ודילול נוגדנים כדי להבטיח תוצאות ניתנות לשחזור בין אתרים שונים.
- חייב להתחשב במשתנים ספציפיים לרקמה, כגון זמן קיבוע ועובי חיתוך, המשפיעים על אחידות הצביעה.
- מוגבל על ידי דעיכת אות הפלואורסצנציה לאורך זמן, מה שדורש הרכבה (mounting) ואחסון נאותים לשמירה על שלמות הנתונים.
