Name: הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: למדו פרופיל פוליזומים לזיהוי mRNA מתורגם באופן סלקטיבי בתאי יונקים תחת לחץ. פרוטוקול זה מאפשר הפרדה של פוליריבוזומים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וניתוח תרגום mRNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לחברי המעבדה בעבר ובהווה, ובמיוחד לאורסולה ליוואק, על הדיון הביקורתי בנוגע לפרוטוקולים של פרופיל פוליזומים ושיתוף נתונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תפעול מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות, האגודה לחקר הסרטן והמועצה הלאומית למחקר מדעי והנדסי של קנדה ל-MH. MDF נתמכה על ידי פרס הדוקטורט של מלגת Vanier Canada לתואר שני ומלגת אונטריו, ועבודה זו מהווה חלק מעבודת הדוקטורט שלה.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרופיל Polysomal הוא טכניקה רבת עוצמה שמאפשרת כימות של מדינת תרגום של תמלילים מסוימים בתנאי טיפול שונים. זוהי טכניקה פשוטה מאוד באופן עקרוני ובכל זאת דורשת מספר שלבים של ביצוע, שחלקם הם קריטיים לייצור פרופילי polysome טובים. שלבים העיקריים אלה הם: 1) שימוש בכימיקלים וplasticware RNase חינם, 2) הכנה הדרגתיים סוכרוז טוב (הדרגתיים סוכרוז 10-50% בניסיון שלנו עובדים הכי טוב עבור יעילות פתרון 40 / 60S יחידות משנה וmRNAs עם ריבוזומים קשורים), ו- 3 ) תוך שימוש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי ולא מחובר יותר מ -80% על מנת ללכוד את השיעור הגבוה ביותר של תרגום. צעד אחרון זה צריך להילקח בחשבון כאשר עושים טיפולי תא ארוכים, כגון מציאה גן או ביטוי יתר, כך שהסכום של תאים לצלחת יהיה פונקציה של כמה התאים יהיו מחוברים בנקודת הסיום. בתוצאות presenטד כאן, polysome ניתוח הפרופיל היה כלי חשוב להערכת תפקיד PDCD4 בויסות התרגום של mRNAs XIAP וBcl-XL 12-מחסה IRES. העובדה שאנו לא צופים כל שינוי בפרופילי polysome הכלליים על PDCD4 לדפוק למטה (איור 1) אפשרה לנו להגיע למסקנה כי PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי בתנאים של הניסוי. אנחנו הבאים עשינו שימוש בניתוח RT-qPCR כדי לקבוע את חלוקת XIAP וBcl-XL mRNAs בתאים שטופלו עם PDCD4 או siRNAs שליטה. qPCR הוא שיטת בחירה של ניתוח פרופילי polysome, בניגוד לסטנדרטי RT-PCR או סופג צפון, משום שהוא מאפשר ללא כמו ניתוח חצי כמותית של הפצת mRNA ולגילוי שינויים דקים בtranslational יעילות בין טיפולים. השימוש בטכניקה זו, הצלחנו להראות כי ההפצה של mRNAs Bcl-XL XIAP ו( כאחוז מכלל mRNA היעד על פני גרadient) היה עבר בצורה משמעותית לpolyribosomes הכבד (mRNAs עם מספר גדול של ריבוזומים הקשורים בם) לאחר PDCD4 לדפוק למטה (1D איור, E), וכך מצביעה על עלייה בתרגום של mRNAs אלה. זה אושר גם על ידי עלייה ברמות חלבון XIAP וBcl-XL אבל לא ברמות RNA המצב היציב שלהם (איור 1F, G). חשוב לציין, הפצת polysome של הגרסה הלא-IRES של XIAP הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג &#39;). לחלופין, יעילות translational יכולה להיות מוצגת כיחס בין תוכן mRNA בpolysomes (בדרך כלל שברי 5 עד 10) לעומת monosomes (בדרך כלל שברים 2 עד 4) 14. השימוש בבקרות בכל הפרוטוקול חשוב באימות כל polysome פרופיל תוצאה, כפי שניתן לא בכוחות עצמם לייחס פסגות שנצפו מקריאות ספיגה ב 254 ננומטר ל- RNA ריבוזומלי (חומר ניקוישל, כגון טריטון X-100 מאוד לספוג באזור זה של הספקטרום ועלול לטשטש 40 / 60S פסגות בחלק העליון של השיפוע). מילויים ריקים ללא lysate ו / או עם חיץ lysate צריכים להפעיל כדי לקבוע את תרומתו היחסית של המאגרים לספיגה ב 254 ננומטר. Artefactual מבנים מסדר גבוהים יותר גם יכולים להוביל לפרשנות מוטעה של polysomes שבו יש באף עובדה (לדוגמא &quot;פסאודו-polysomes&quot; 20). Sequestering מגנזיום (המשמש בכל ההליך כדי לייצב 80S ריבוזומים) עם EDTA chelator קטיון דו הערכי הוסיף לlysates ולמאגר שהשיפוע (20 מ&quot;מ במשך 15 דקות) יגרום הפרדה של הריבוזום לקטן (40S) המרכיב אותה וגדול (60S תת-יחידות). לכן, אם פסגות ספיגה נרשמו ב 260 ננומטר הן אכן polysomes, טיפול EDTA יקרוס הפרופיל כזה שמקסימום יחיד יהיה שנצפה בחלק העליון של שיפוע המתאים לשחרור ה- mRNA ויחידות ריבוזומלי (מידע לא מוצג). ביחדעם קריסה מושרה EDTA של הפרופיל, כל המטרות הספציפיות נותחו על ידי qPCR צריך להימצא כעת בחלק העליון של השיפוע. מספר ריבוזומים הקשורים mRNA הוא לא תמיד אינדיקציה למידת היעילות שmRNA מסוים מתורגם. ואכן, יש הקשרים ספציפיים שבו תרגום פעיל בpolysomes הופך תקוע 21,22 שהקורא צריך להיות מודע. קביעה אם או לא תמלילים עוסקים באופן פעיל עם מכונות התרגום יכולים להיעשות על ידי) טיפול במדגם עם puromycin, שלא כמו EDTA, גורם ל&#39;ניגר &#39;של ריבוזומים שבאופן פעיל translocating פני mRNA, או ב) טיפול במדגם עם homoharringtonine אשר מעכב טרנסלוקציה של הריבוזום הראשון רק בקודון ההתחלה, שוב גורם ל&#39;ניגר &#39;של כל ריבוזומים translocating במורד הזרם. השימוש בתמלילי שליטה לניתוח qPCR הוא גם קריטי. אין התמיכה בבחירהtion של תמלילים שאינם מושפעים מהתנאים טיפול שונים, כגון גנים מסוימים במשק בית (GAPDH, אקטין, טובולין, Nucleolin), mRNAs ריבוזומלי (18S, RPL13A) או במקרה זה גרסה הלא-IRES של IRES XIAP, הוא חשוב ב האימות אם ההשפעה של הטיפול על תרגום היא ספציפית או כללי. תמלילי שליטה אלה יכולים לשמש כדי לנרמל את ההפצה של mRNAs ניתח כפי שנעשה כאן (mRNAs XIAP וBcl-XL היה מנורמל GAPDH mRNA ומבוטא באחוזים מכלל תוכן mRNA המיוצגים בסכום של תוכן mRNA בכל שבריר ) או לחלופין, יכול לבוא לידי ביטוי mRNAs היעד והשליטה כערכים מוחלטים ומוצג בנפרד. ניתוח qPCR של lysates הקלט (בדרך כלל 10% מנפח כולל) הוא צעד נוסף שישלוט על חלוקת mRNAs הספציפי. באופן אידיאלי, תוכן mRNA של תמליל ספציפי בlysate הקלט צריך להיות דומה לסכום של תוכן mRNA בכל 10 הברים ניתחו. לבסוף, צעד אופציונאלי לשליטה לפנול: שלב חילוץ כלורופורם הוא ספייק כל חלק polysome עם במבחנה mRNA כתב עיבד (כגון CAT, אצטיל כלורמפניקול transferase) שניתן לכמת בהמשך על ידי qPCR ויכול גם לשמש כדי לנרמל 14 נתונים. כמו בכל טכניקה, פרופיל polysome מציג כמה מגבלות. העובדה שבדרך כלל מינימום של 10 שברים (משמרות עדינות יותר ביעילות תרגום עשויה לדרוש יותר או 20) צריכה להיות שנאספו על מנת לקבל הפצות polysome נחמדה עושה את הצעד הזה הגבלה, במובן זה שרק למקסימום של 4 דגימות יכול להיות ניתח בכל פעם כדי שתוכל לטפל בנוחות מיצוי RNA וניתוח qPCR של 40 דגימות ובקרת 4 קלט בבת אחת. גודל המדגם יכול בקלות להוסיף עם כמה תמלילים להיות מנותחים וכמה qPCR משכפל לעשות, וזה יכול להיות יקר. מגבלה נוספת של פרופיל polysomal מבוסס qPCRnalysis הוא שזה יכול להיעשות רק על גישה מבוססת מועמד (שבו התמלילים להיות מנותחות ידועים מראש) ולא יכולים להיות מיושמים לניתוח הגנום של תרגום. עם זאת, בתחילת המאה ה -21, חוקרים החלו לחקור RNA polysomal שלהם ברמה גנומית באמצעות DNA microarrays 15 ולאחרונה עם רצף של הדור הבא 16,17. בגישה זו עוצמה, פרופיל polysomal מתבצע כפי שתואר בפרוטוקול זה אלא שבמקום לבצע ניתוח qPCR של שברים בודדים, monosomes שברים (בדרך כלל חלק 2-4) וpolysomes שברים (בדרך כלל שברים) הם אספו יחד ושינויים בתרגום העולמי נתח על ידי מערך DNA או RNA רצף הגנום. מכאן עם גישה זו, ניתן להעריך את כל mRNAs הפצה שמשמרות מpolysomes לmonosomes (ירידה בתרגום) או להיפך (עלייה בתרגום) על טיפול ספציפיment. אימות וכימות הפצת polysomes mRNA ספציפית אז יכולים להיעשות על ידי qPCR. שימוש אפילו יותר חזק של עיקרון פרופיל polysomal הוא פרופיל הריבוזום. הארכת תפוקה גבוהה נוספת של טכניקה זו דווחה לאחרונה, המאפשרת ניטור בו-זמני של מאות polysome שברים 23. זה מספק יתרון ברור כאשר חיטוט יעילות translational של אוספי מוטציה או במסכי RNAi בקנה מידה גדולה. פרופיל הריבוזום הוא טכניקה שמנצלת רצף של הדור הבא למפה שברי RNA מוגנים על ידי ריבוזומים (עקבות הריבוזום) העוסקים בסינתזה של חלבוני 24,25. בטכניקה זו, טרנסלוקציה הריבוזום יכולה להיות מעוכבת עם cycloheximide (הפיך) או emetine (בלתי הפיך) ואחריו תמוגה תא ועיכול RNase להניב אוכלוסייה של עקבות הריבוזום. הריבוזומים מועשרים, RNA הכולל מבודד, וריבוזומלי זיהום וRNA ריבוזומלי המיטוכונדריה מוסר.עקבות RNA של כ 26-28 נוקלאוטידים מבודדות, הפוך עיבד, הפך לספריית cDNA והרצף 26. בניגוד לפרופיל polysome סטנדרטי, גישה זו לא רק מזהה mRNAs הספציפי שמוסדרים translationally אלא גם מניבה מידע mRNA הספציפי ברזולוציה קודון כגון כיבוש המדויק וצפיפות של ריבוזומים לאורך תמליל ספציפי. זה מעניין בעיקר לmRNAs עם מצבים ספציפיים של תרגום כגון mRNAs IRES-מחסה, כפי שהוא יכול לתת מידע נוסף על מיקום בהריבוזומים לגיוס התמליל מתרחש.

רגולציה של סינתזת חלבון (תרגום) היא תהליך תאי חשוב שקשורה קשר הדוק להישרדות סלולרית. בהתחשב בעובדה שהתרגום צורך יותר מ -50% מהאנרגיה של התא, אין זה מפתיע שהתרגום מוסדר בחוזקה ושההפרעות בתרגום אינן נסבלות היטב. לעומת זאת, רבים תהליכים תאיים חריגים דורשים כי מכונות תרגום ופלט תרגום (כלומר proteome) צריכים להיות שונה. זה קורה לעתים קרובות במדינות תגובת לחץ ומחלות שונות, והוא כנראה הכי טוב שהודגם בסרטן. יתרון מפתח של שליטת translational הוא היכולת של תאים לתכנת מחדש במהירות את תפוקת החלבון בתגובה לטריגרים חיצוניים ופנימיים שונים, מנגנון כוונון ובכך בסדר שעצות האיזון בין הישרדות תא ומות 1. שני היבטים של שליטת translational מעניינים במיוחד; הבנה של הטבע של MEC הרגולציהאלמנטי hanism (ים) ובקרה המאפשרים לתרגום ספציפי, וזיהוי של mRNAs הספציפי ומוצרי החלבון שלהם, המשתתפים בתגובה התאית להדק המסוים שעורר תרגום סלקטיבי במקום הראשון. פרופיל Polysome הוא טכניקה המאפשרת לימוד אפקטיבי של שני התהליכים. המטרה הכללית של טכניקת פרופיל polysome היא ללמוד ולכמת את מצב התרגום של mRNAs המסוים בתנאים סלולריים שונים. העיקרון של השיטה הוא ללכוד תרגום mRNA על ידי &#39;&#39; הקפאה &#39;&#39; ריבוזומים פעילים תרגום בתמלילים שונים ונפרדים polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשרים להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר (מחויבת כמה ריבוזומים) ו גרוע מתורגם אלה (כפופים לריבוזומים אחד או שניים). בפרוטוקול ספציפי זה, cycloheximide האנטיביוטי שנקשר ל60S מקטע ריבוזומלי וחוסם את שחרורו של tRNA deacetylated מאתר E הריבוזום 2, משמש כדי לעכב טרנסלוקציה הריבוזום ולעכב ריבוזומים על mRNAs תרגום. עם זאת, סוכני חסימה אחרים כגון emetine שתרגום גם חוסם התארכות 3, ניתן להשתמש. בניגוד למערבי סופג ו -35 S-מתיונין טכניקות תיוג המודדות את התוצר הסופי של תהליך התרגום, polysome יש פרופיל את היתרון של מדידת עמותת ריבוזומים עם mRNAs באופן פעיל-המתורגם, ובכך מאפשר למחקר מפורט יותר של מנגנוני תרגום בתנאים שונים. לפיכך, הטכניקה ניתן להתאים בקלות ללמוד במיוחד מצבים שונים של תרגום 4-6, גורמי חלבונים מעורבים בויסות תרגום 7-9, תנאי לחץ משפיעים על סינתזת חלבון 1,10,11 או את ההשפעות של מבני mRNA כגון IRES או במעלה הזרם מסגרות קריאה פתוחות בסינטיסייזר החלבוןesis 12-14. כיום, polysome יישומי פרופיל הם אפילו רחבים יותר בשימוש במערכים DNA 15 או רצף של הדור הבא 16,17 לנתח mRNAs הקשורים polysomes.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 יצרנית שיפוע אוטומטית</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>יצרנית שיפוע דו-קאמרית אוטומטית Densi-Flow</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>דגם # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>מפצל שיפוע צפיפות</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>מורכב מ: מערכת פירסינג צינורות, &nbsp; משאבה פריסטלטית, גלאי UA-6 עם מסנני 254 ו-280 ננומטר ו-Foxy R1 Fraction Collector</td></tr><tr><td>WinDaq תוכנת רכישת נתונים</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmצינורות אולטרה-צנטריפוגה של Pollyallomer (עבור SW41, 14 x 89 מ"מ)</td><td></td>צינורות צנטריפוגה של <td>בקמן קולטר</td> 331372 <td></td></tr> 2 <tr><td>מ"ל ללא נוקלאז (אף דולפין)</td><td></td>צינורות צנטריפוגה 2 מ"ל ללא נוקלאז DiaMed <td>PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>(תחתית שטוחה)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז (ללא נוקלאזות)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342.3 גרם/מול</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281.4 גרם/מול. יש להשעות ב-DMSO ולשמור על -80 מעלות צלזיוס לטרגדיה ארוכת טווח. זהירות: רעיל! יכול לגרום לדרכי החזרה ולגירוי בעור. חבשו מסכה בעת השקילה.</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (ללא נוקלאזות)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58.44 גרם/מול</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (ללא נוקלאזות)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203.3 גרם/מול</td></tr><tr><td>Tris Base (ללא נוקלאזות)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121.14 גרם/מול</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>זהירות: רעיל! יכול לגרום לדרכי החזרה ולגירוי בעור</td></tr><tr><td>מעכב RNasin Ribonuclease רקומביננטי</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap פתרון אינאקטיבציה של Rnase</td><td>אמביון, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 מ"ג/מ"ל)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>חומצה-פנול: כלורופורם, pH 4.5 (עם IAA, 125:24:1)</td><td>אמביון, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>זהירות: רעיל! יכול לגרום לגירוי בדרכי החזרה, כמו גם לגירוי וקורוזיה בעור</td></tr></tbody></table>

הערכת סלקטיבי mrna התרגום בתאי יונקים ידי polysome פרופיל

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

רגולציה של סינתזת חלבון מהווה נקודת שליטה מרכזית בתגובה תאית ללחץ. בפרט, יחידות בקרת RNA דיסקרטי הוצגו כדי לאפשר לתרגום סלקטיבי של mRNAs הספציפי, אשר בדרך כלל קשורים לחלבונים הנדרשים לתגובת לחץ מסוימת. זיהוי של mRNAs אלה, כמו גם האפיון של מנגנוני פיקוח אחראים לתרגום סלקטיבי היה בחוד החנית של ביולוגיה מולקולרית לכמה זמן. פרופיל Polysome הוא שיטת אבן פינה במחקרים אלה. המטרה של פרופיל polysome היא ללכוד תרגום mRNA על ידי משתק ריבוזומים פעיל תרגום בתמלילים שונים ונפרדת polyribosomes וכתוצאה מכך על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז, ובכך מאפשר להבחנה בין תמלילים מתורגמים ביותר ואלה תורגמו בצורה גרועה. אז יכולות להיות מאופיינות אלה נוספות על ידי שיטות ביולוגיה מולקולריות ביוכימי ומסורתית. חשוב לציין, עמ &#39;שילובolysome פרופיל עם גישות הגנומי תפוקה גבוהה מאפשר ניתוח בקנה מידה גדול של הרגולציה translational.

יש לנו לאחרונה תיארתי תפקיד חדש למדכא גידול PDCD4 כמעכב תרגום סלקטיבי של IRES-מחסה mRNAs קידוד מעכבים אפופטוטיים XIAP וBcl-XL 12. פרופיל Polysome היה טכניקת מפתח כדי להדגים את המעורבות הספציפית של PDCD4 בתרגום תיווך IRES. HEK293 תאים היו transfected זמני לרוקן רמות אנדוגני של PDCD4 (איור 1 א), ואז העביר לpolysome ניתוח פרופיל. הבחנו כי רמות הפחתה של PDCD4 לא לפגוע בתרגום סלולארי הגלובלי, כמו להישפט על ידי חוסר השינויים בפרופיל polysome כאשר משווים siCTRL וsiPDCD4 תאים שטופלו (איור 1). באופן דומה, polysome הפצה של גרסה הלא-IRES של XIAP 19 הייתה ללא שינוי בין תאים שטופלו ולא טופלו (איור 1 ג &#39;). בניגוד לכך, polysome הפצה של mRNAs שני IRES-מחסה, XIAP וBcl-XL, הייתה שונה באופן משמעותי. בהעדר PDCD4 ההפצה של שני mRNAs אלה מוסטת לribopolysomes הכבד (1D איור, E). מכיוון שזו אינה מלווה בשינויים ברמות מצב היציב של XIAP וBcl-XL mRNA (איור 1F) תוצאות אלו מראות משופרים תרגום של XIAP וBcl-XL בתאים עם רמות PDCD4 מופחתות, אשר אושר גם על ידי מערבי (איור סופג 1G). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> איור 1:. פרופיל Polysome מזהה PDCD4 כמעכב סלקטיבי של תרגום XIAP וBcl-XL () טופלו HEK293 תאים עם PDCD4 siRNA או שליטה (CTRL), ללא מיקוד siRNA, lysed ונתון ניתוח כתם מערבי עם אנטי PDCD4 ונוגדנים נגד Nucleolin כדי לוודא את מידת PDCD4 לדפוק למטה. (ב) PDCD4 ופל כמו ב() וlysates התא היו נתונים לpolysome פרופיל. פרופיל polysome נציג מוצג בפנל העליון; חלוקת הלא IRES XIAP (C), Bcl-XL (ד &#39;), וXIAP IRES (E) mRNAs ביחס לזה של GAPDH מוצג כאחוז מה- mRNA הכולל (% mRNA) בכל חלק. (F) יציב רמות ה- mRNA -state נמדדו על ידי RT-qPCR בPDCD4 siRNA או שליטה (CTRL) siRNA תאים שטופלו. (G) lysates מ (A) גם היו נתונים לניתוח כתם מערבי עם אנטי XIAP, אנטי-Bcl-XL, ו נוגדנים נגד Nucleolin. (NB. הנתונים המוצגים באיור 1 פורסם במקור ב -12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להבחין בין mRNA המתורגם בשיעור גבוה לבין mRNA המתורגם בשיעור נמוך, באמצעות קיבוע והפרדה של פוליריבוסומים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הוספת cyclo heximide לתאים כדי לעכב את תנועת הריבוסומים (translocation) ואת תרגום ה-RNA. בשלב שני, ליזאטים של התאים המטופלים נטענים על מדרג סוכרוז ועוברים אולטרה-צנטריפוגה כדי להפריד את הפוליריבוסומים המאוחסנים בהתאם למסות שלהם.בשלב הבא, הגרדיאנט מחולק לפרקציות שוות כדי להפריד בין התמלילים בעלי יעילות תרגום גבוהה לנמוכה בשלב הסופי. R-T-Q-P-C-R משמש לזיהוי נוכחותם של ה-mRNAs המבוקשים בתוך כל פרקציה. לבסוף, ניתן להשתמש בפרופיילינג של ריבוזומים כדי לזהות שינויים בתרגום גלובלי וספציפי של mRNA בתגובה למצבי עקה פיזיולוגיים ופאתופיזיולוגיים מובחנים.פרופילינג PolyOne יכול לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה המולקולרית ותאי, כגון אילו mRNAs נבחרים ומתורגמים במהלך stress S, וכיצד הדבר מאפשר לתאים להסתגל לתנאים אלו. הדגמה של הליך זה מבוצעת על ידי סטודנט לתואר שני במעבדה. כדי להשתמש במכשיר אוטומטי להכנת גרדיאנטים להכנת גרדיאנט סוכרוז, התחילו בהפעלת מכשיר הגרדיאנט ויישרו את הפלטה שתחזיק את הגרדיאנטים כאשר הפלטה מיושרת. לחצו על done.כדי לבחור את תוכנית המדרג, פתחו את תפריט ה-grad ובחרו ברשימה (list). לחצו על SW 41 ולאחר מכן גללו ברשימה עד שתוכנית ה-10 to 50%gradient 11 steps תופיע במישור הראייה ולחצו על Use. לאחר מכן, הכניסו מבחנה קונית לאולטרסנטריפוגה מדגם SW 41 לתוך בלוק הסימון, והשתמשו במסמן המבחנות העדין המצורף כדי לסמן קו על המבחנה לאורך השלב העליון של הבלוק.הניחו את המבחנות במעמד מתאים על משטח יציב, ולאחר מכן חברו את שתי הקנולות המסופקות לשתי מזרקים של 10 milliliter. שאיפו וסחטו מספר פעמים מים מזוקקים חמימים המכילים RNAs בתמיסת הפעלה כדי לשטוף את המזרקים. לאחר הסרת כל שאריות המים, מלאו את אחד המזרקים ב-10% sucrose בתוספת cyclo heide, והחדירו את הקנולה לתחתית מבחנת anultracentrifuge.מזגו בעדינות את התמיסה עד שהיא חולפת מעט את הסימון שנעשה על המבחנה, תוך הקפדה להימנע מהיווצרות בועות. לאחר מכן, מלאו את המזרק השני ב-50% sucrose בתוספת cyclo heide, ונקו בעזרת ניגב כל שארית נוזל מהמבחנה.השתמשו בקנולה כדי להחדיר בעדינות את תמיסת ה-50% sucrose לתוך הפחית, והפסיקו כאשר התמיסה מגיעה לקו הסימון, ולאחר מכן הוציאו את הקנולה במהירות ובחלקה. תמיסת ה-10% sucrose צריכה לעלות ולהיווצר מניסקוס בחלקו העליון של הפחית. לאחר מכן, הגו את פחית האולטרסנטריפוגה מעט כדי להוציא בועות אוויר, והחדירו את הפקק, תוך שימוש במיקרו-פיפט כדי להסיר נוזל עודף ממאגר הפקק.הנח את המבחנות על מכשיר יצירת המעבר (gradient maker) ולאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה. שים לב שהפלטה תטה בזווית שצוינה. המתן חמש שניות, ואז יתחילו הסיבובים ליצירת המעבר.לאחר כשתי דקות, המכונה תשמיע צפצוף המעיד על כך שיצירת הגרדיאנט הושלמה. העבירו בעדינות את המבחנות למעמד והסירו במהירות את הפקקים בתנועה אחת כלפי מעלה כדי למנוע הפרעה לגרדיאנט. לאחר מכן, טענו בעדינות 260 units של ליסאט תאים שהוכן מראש לכל גרדיאנט סוכרוז, וסובבו את המבחנות במשך שעה וחצי במהירות של 260,343 ×g ובטמפרטורה של 4 °C באולטרה-צנטריפוגה.כדי להכין את מכשיר מערכת הפרדת הגרדיאנט, התחל בהפעלת הספקטרופוטומטר. לאחר מכן, לחץ פעמיים על אייקון התיקייה ואז פעמיים על חץ החזור כדי לחזור למסך הבית ולהגדיר את אספן הפракציות לשיטת PolyZone, כדי להבטיח שהשסתום באספן הפракציות מוגדר לניקוז (waste). לחץ על החץ המצביע על אייקון סל המחזור, ולאחר מכן הנח בקרא MIA בנפח 250 milliliter המכילה מים מזוקקים תחת צינור איסוף הניקוז.כעת בחרו את ההגדרות הבאות במכשיר רישום התרשימים: את חיוג הרגישות (sensitivity dial) להגדרת המנורה והאופטיקה, את מסנן הרעשים (noise filter) למצב 1.5, את חיוג מפריד השיאים (peak separator dial) למצב off, ואת חיוג מהירות הרישום (chart speed dial) ל-30 centimeters per hour. את חיוג כיוון קו הבסיס (baseline adjust dial) בחלקו העליון של יחידת הספקטרופוטומטר הגדירו למצב max open. לאחר מכן, מקמו את המזרק והבוכנה במשאבה והשתמשו בברגים ובמפתח אלן המסופקים כדי להדק אותם למקומם.השתמשו בפקודת rev במהירות גבוהה כדי למלא את המזרק בתמיסת דחיפה (chase solution). לאחר מכן, הניחו את המשאבה במצב זקוף והשתמשו בפקודת forward כדי לדחוף את האוויר דרך הפיתוליות. לאחר מכן, התקינו במחזיק מבחנת אולטרה-צנטריפוגה מלאה במים נטולי RNA, ודקרו את המבחנה בעזרת הקנולה עד להופעת שני הסימונים השחורים.חור החלוקה נמצא בין שני הסימונים. הפעל את משאבת המזרק במצב ידני קדימה בקצב של 6.0 milliliters per minute. כאשר תמיסת הדחיפה ממלאת שליש מהפרוטסבה, העבר את המהירות למצב משתנה עם קצב זרימה של 1.0 milliliters per minute.כעת סובב את חוגת כיוון קו הבסיס (baseline adjust) בספקטרופוטומטר עד שהמתח המוצג בטבלה יהיה אפס. מים יתחילו לזרום מצינור הפסולת אל תוך בקבוק ה-el Mya. לאחר מכן, הגדר את הרגישות הרצויה ל-1.0 au.לאחר כיוון הרגישות, לחצו על כפתור ה-baseline וסובבו את חיוג ה-offset של המקליט כדי להתאים את הגדרת קו הבסיס לסימון של 10% במקליט הגרפים. ברגע שהושג קו בסיס יציב, העבירו את מתג המשאבה ואת חיוג מהירות הגרף למצב off. לאחר כיבוי המשאבה, העבירו אותה למצב rev כדי להחזיר את תמיססת הדחיפה (chase solution) עד שתגיע לסימון הראשון בקנולה המנקבת.לאחר מכן הוציאו את מבחנת הצנטריפוגה, פזרו בועות אוויר שנותרו בקנולה באמצעות מעט תמיסת דחיפה (chase solution), ונקו שאריות מים שייתכן ודלפו מתא הזרימה כדי להפריד את הגרדיאנט לפרקציות. לאחר מכן, התקינו במחזיק את מבחנת הצנטריפוגה המכילה את גרדיאנט הסוכרוז ונקבו את המבחנה בעזרת הקנולה. לאחר מכן, הניחו עשרה מיקרו-מבחנות צנטריפוגה של 2 mL בתבנית אספן הפרקציות במיקומים 2 עד 11, ומבחנת פסולת במיקום 1, באופן שבו המכסים אינם בולטים כלפי מעלה.כוון את חוגת בקרת המשאבה למצב ידני (manual) ואת קצב הזרימה במשאבת המזרק ל-6.0 milliliters per minute. לאחר מכן, לחץ על כפתור ההפעלה (play) באספן השברים ברגע שהזרוע מגיעה למבחנה הראשונה. לחץ על כפתור העצירה (pause) כדי למקם את הזרוע ולפתוח את שסתום חלוקת השברים.לאחר מכן, השתמש בפקודת forward כדי להפעיל את המשאבה ועקוב אחר עט רשום התרשים. כאשר העט מתחיל לסטות כלפי מעלה, מה שמעיד על כך שהמדגם עובר דרך תא הזרימה, החלף במהירות את צינור הפסולת בצינור מספר אחת. כאשר נאספת הטיפה הראשונה, העבר במהירות את הפקודות ל-remote start, stop ו-variable 1.0 milliliters per minute, ולחץ על play כדי לאפשר לממשק אספן הפרקציות לאסוף פרקציות של one milliliter בכל דקה.לבסוף, לאחר שתמיסת הדחיפה הכחולה נכנסת למבחנה האחרונה, לחצו על עצור. פרופיל PolyZone הוא טכניקה מרכזית להדגמת המעורבות הספציפית של PD CD4 בתרגום המתווך על ידי IRAs. לדוגמה, בניסוי זה, תאי HEC 2 93 עברו טרנספקציה זמנית כדי להדל רמות אנדוגניות של PDC D four, ולאחר מכן הוכנסו לניתוח פרופיל PolyZone.הפחתת הרמות של PDC D four לא פגעה בתרגום הגלובלי של הגן, כפי שהוכח מהיעדר שינויים בפרופיל ה-PolyZone. בהשוואה בין תאי בקרת SI לבין תאים שטופלו ב-IPD CD four, התפלגות הפוליסומים של גרסה שאינה IRAs של XIAP נותרה ללא שינוי בין התאים המטופלים לבלתי המטופלים. לעומת זאת, התפלגות הפוליסומים של שני ה-mRNAs הנושאים IS, XIAP ו-BCL XL, השתנתה באופן משמעותי.בהיעדרו של PD CD4, התפלגותם של שני ה-mRNAs הללו זחזחה לעבר ריבוזומים כבדים. מכיוון ששינוי זה אינו מלווה בשינויים ברמות המצב היציב של XIAP ו-BCL XL mRNA, תוצאות אלו מדגימות תרגום מוגבר של XIAP ו-BCL XL בתאים עם רמות PDC D ארבע מופחתות, כפי שאושש בהמשך באמצעות Western blossoming. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה על האופן שבו ניתן למדוד תרגום mRNA על ידי הכנת מדרג סוכרוז והפרדת פוליסומים באמצעות an ultracentrifugation.

assessment-selective-mrna-translation-mammalian-cells-polysome

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) מסוגל ללכוד תרגום ספציפי לסוג התא של mRNA. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול TRAP הראשון המוקדש לבידוד mRNA באוכלוסיות תאים נדירות של עוברי דרוזופילה.

מלכודת RC, תרגום ריבוזום זיקה טיהור מאוכלוסיות תאים נדירות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

למדו פרופיל פוליזומים לזיהוי mRNA מתורגם באופן סלקטיבי בתאי יונקים תחת לחץ. פרוטוקול זה מאפשר הפרדה של פוליריבוזומים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה וניתוח תרגום mRNA.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

גלה סרטונים נוספים