הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להבחין בין mRNA המתורגם בשיעור גבוה לבין mRNA המתורגם בשיעור נמוך, באמצעות קיבוע והפרדה של פוליריבוסומים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הוספת cyclo heximide לתאים כדי לעכב את תנועת הריבוסומים (translocation) ואת תרגום ה-RNA. בשלב שני, ליזאטים של התאים המטופלים נטענים על מדרג סוכרוז ועוברים אולטרה-צנטריפוגה כדי להפריד את הפוליריבוסומים המאוחסנים בהתאם למסות שלהם.

בשלב הבא, הגרדיאנט מחולק לפרקציות שוות כדי להפריד בין התמלילים בעלי יעילות תרגום גבוהה לנמוכה בשלב הסופי. R-T-Q-P-C-R משמש לזיהוי נוכחותם של ה-mRNAs המבוקשים בתוך כל פרקציה. לבסוף, ניתן להשתמש בפרופיילינג של ריבוזומים כדי לזהות שינויים בתרגום גלובלי וספציפי של mRNA בתגובה למצבי עקה פיזיולוגיים ופאתופיזיולוגיים מובחנים.

פרופילינג PolyOne יכול לענות על שאלות מפתח בתחומי הביולוגיה המולקולרית ותאי, כגון אילו mRNAs נבחרים ומתורגמים במהלך stress S, וכיצד הדבר מאפשר לתאים להסתגל לתנאים אלו. הדגמה של הליך זה מבוצעת על ידי סטודנט לתואר שני במעבדה. כדי להשתמש במכשיר אוטומטי להכנת גרדיאנטים להכנת גרדיאנט סוכרוז, התחילו בהפעלת מכשיר הגרדיאנט ויישרו את הפלטה שתחזיק את הגרדיאנטים כאשר הפלטה מיושרת. לחצו על done.

כדי לבחור את תוכנית המדרג, פתחו את תפריט ה-grad ובחרו ברשימה (list). לחצו על SW 41 ולאחר מכן גללו ברשימה עד שתוכנית ה-10 to 50%gradient 11 steps תופיע במישור הראייה ולחצו על Use. לאחר מכן, הכניסו מבחנה קונית לאולטרסנטריפוגה מדגם SW 41 לתוך בלוק הסימון, והשתמשו במסמן המבחנות העדין המצורף כדי לסמן קו על המבחנה לאורך השלב העליון של הבלוק.

הניחו את המבחנות במעמד מתאים על משטח יציב, ולאחר מכן חברו את שתי הקנולות המסופקות לשתי מזרקים של 10 milliliter. שאיפו וסחטו מספר פעמים מים מזוקקים חמימים המכילים RNAs בתמיסת הפעלה כדי לשטוף את המזרקים. לאחר הסרת כל שאריות המים, מלאו את אחד המזרקים ב-10% sucrose בתוספת cyclo heide, והחדירו את הקנולה לתחתית מבחנת anultracentrifuge.

מזגו בעדינות את התמיסה עד שהיא חולפת מעט את הסימון שנעשה על המבחנה, תוך הקפדה להימנע מהיווצרות בועות. לאחר מכן, מלאו את המזרק השני ב-50% sucrose בתוספת cyclo heide, ונקו בעזרת ניגב כל שארית נוזל מהמבחנה.

השתמשו בקנולה כדי להחדיר בעדינות את תמיסת ה-50% sucrose לתוך הפחית, והפסיקו כאשר התמיסה מגיעה לקו הסימון, ולאחר מכן הוציאו את הקנולה במהירות ובחלקה. תמיסת ה-10% sucrose צריכה לעלות ולהיווצר מניסקוס בחלקו העליון של הפחית. לאחר מכן, הגו את פחית האולטרסנטריפוגה מעט כדי להוציא בועות אוויר, והחדירו את הפקק, תוך שימוש במיקרו-פיפט כדי להסיר נוזל עודף ממאגר הפקק.

הנח את המבחנות על מכשיר יצירת המעבר (gradient maker) ולאחר מכן לחץ על כפתור ההפעלה. שים לב שהפלטה תטה בזווית שצוינה. המתן חמש שניות, ואז יתחילו הסיבובים ליצירת המעבר.

לאחר כשתי דקות, המכונה תשמיע צפצוף המעיד על כך שיצירת הגרדיאנט הושלמה. העבירו בעדינות את המבחנות למעמד והסירו במהירות את הפקקים בתנועה אחת כלפי מעלה כדי למנוע הפרעה לגרדיאנט. לאחר מכן, טענו בעדינות 260 units של ליסאט תאים שהוכן מראש לכל גרדיאנט סוכרוז, וסובבו את המבחנות במשך שעה וחצי במהירות של 260,343 ×g ובטמפרטורה של 4 °C באולטרה-צנטריפוגה.

כדי להכין את מכשיר מערכת הפרדת הגרדיאנט, התחל בהפעלת הספקטרופוטומטר. לאחר מכן, לחץ פעמיים על אייקון התיקייה ואז פעמיים על חץ החזור כדי לחזור למסך הבית ולהגדיר את אספן הפракציות לשיטת PolyZone, כדי להבטיח שהשסתום באספן הפракציות מוגדר לניקוז (waste). לחץ על החץ המצביע על אייקון סל המחזור, ולאחר מכן הנח בקרא MIA בנפח 250 milliliter המכילה מים מזוקקים תחת צינור איסוף הניקוז.

כעת בחרו את ההגדרות הבאות במכשיר רישום התרשימים: את חיוג הרגישות (sensitivity dial) להגדרת המנורה והאופטיקה, את מסנן הרעשים (noise filter) למצב 1.5, את חיוג מפריד השיאים (peak separator dial) למצב off, ואת חיוג מהירות הרישום (chart speed dial) ל-30 centimeters per hour. את חיוג כיוון קו הבסיס (baseline adjust dial) בחלקו העליון של יחידת הספקטרופוטומטר הגדירו למצב max open. לאחר מכן, מקמו את המזרק והבוכנה במשאבה והשתמשו בברגים ובמפתח אלן המסופקים כדי להדק אותם למקומם.

השתמשו בפקודת rev במהירות גבוהה כדי למלא את המזרק בתמיסת דחיפה (chase solution). לאחר מכן, הניחו את המשאבה במצב זקוף והשתמשו בפקודת forward כדי לדחוף את האוויר דרך הפיתוליות. לאחר מכן, התקינו במחזיק מבחנת אולטרה-צנטריפוגה מלאה במים נטולי RNA, ודקרו את המבחנה בעזרת הקנולה עד להופעת שני הסימונים השחורים.

חור החלוקה נמצא בין שני הסימונים. הפעל את משאבת המזרק במצב ידני קדימה בקצב של 6.0 milliliters per minute. כאשר תמיסת הדחיפה ממלאת שליש מהפרוטסבה, העבר את המהירות למצב משתנה עם קצב זרימה של 1.0 milliliters per minute.

כעת סובב את חוגת כיוון קו הבסיס (baseline adjust) בספקטרופוטומטר עד שהמתח המוצג בטבלה יהיה אפס. מים יתחילו לזרום מצינור הפסולת אל תוך בקבוק ה-el Mya. לאחר מכן, הגדר את הרגישות הרצויה ל-1.0 au.

לאחר כיוון הרגישות, לחצו על כפתור ה-baseline וסובבו את חיוג ה-offset של המקליט כדי להתאים את הגדרת קו הבסיס לסימון של 10% במקליט הגרפים. ברגע שהושג קו בסיס יציב, העבירו את מתג המשאבה ואת חיוג מהירות הגרף למצב off. לאחר כיבוי המשאבה, העבירו אותה למצב rev כדי להחזיר את תמיססת הדחיפה (chase solution) עד שתגיע לסימון הראשון בקנולה המנקבת.

לאחר מכן הוציאו את מבחנת הצנטריפוגה, פזרו בועות אוויר שנותרו בקנולה באמצעות מעט תמיסת דחיפה (chase solution), ונקו שאריות מים שייתכן ודלפו מתא הזרימה כדי להפריד את הגרדיאנט לפרקציות. לאחר מכן, התקינו במחזיק את מבחנת הצנטריפוגה המכילה את גרדיאנט הסוכרוז ונקבו את המבחנה בעזרת הקנולה. לאחר מכן, הניחו עשרה מיקרו-מבחנות צנטריפוגה של 2 mL בתבנית אספן הפרקציות במיקומים 2 עד 11, ומבחנת פסולת במיקום 1, באופן שבו המכסים אינם בולטים כלפי מעלה.

כוון את חוגת בקרת המשאבה למצב ידני (manual) ואת קצב הזרימה במשאבת המזרק ל-6.0 milliliters per minute. לאחר מכן, לחץ על כפתור ההפעלה (play) באספן השברים ברגע שהזרוע מגיעה למבחנה הראשונה. לחץ על כפתור העצירה (pause) כדי למקם את הזרוע ולפתוח את שסתום חלוקת השברים.

לאחר מכן, השתמש בפקודת forward כדי להפעיל את המשאבה ועקוב אחר עט רשום התרשים. כאשר העט מתחיל לסטות כלפי מעלה, מה שמעיד על כך שהמדגם עובר דרך תא הזרימה, החלף במהירות את צינור הפסולת בצינור מספר אחת. כאשר נאספת הטיפה הראשונה, העבר במהירות את הפקודות ל-remote start, stop ו-variable 1.0 milliliters per minute, ולחץ על play כדי לאפשר לממשק אספן הפרקציות לאסוף פרקציות של one milliliter בכל דקה.

לבסוף, לאחר שתמיסת הדחיפה הכחולה נכנסת למבחנה האחרונה, לחצו על עצור. פרופיל PolyZone הוא טכניקה מרכזית להדגמת המעורבות הספציפית של PD CD4 בתרגום המתווך על ידי IRAs. לדוגמה, בניסוי זה, תאי HEC 2 93 עברו טרנספקציה זמנית כדי להדל רמות אנדוגניות של PDC D four, ולאחר מכן הוכנסו לניתוח פרופיל PolyZone.

הפחתת הרמות של PDC D four לא פגעה בתרגום הגלובלי של הגן, כפי שהוכח מהיעדר שינויים בפרופיל ה-PolyZone. בהשוואה בין תאי בקרת SI לבין תאים שטופלו ב-IPD CD four, התפלגות הפוליסומים של גרסה שאינה IRAs של XIAP נותרה ללא שינוי בין התאים המטופלים לבלתי המטופלים. לעומת זאת, התפלגות הפוליסומים של שני ה-mRNAs הנושאים IS, XIAP ו-BCL XL, השתנתה באופן משמעותי.

בהיעדרו של PD CD4, התפלגותם של שני ה-mRNAs הללו זחזחה לעבר ריבוזומים כבדים. מכיוון ששינוי זה אינו מלווה בשינויים ברמות המצב היציב של XIAP ו-BCL XL mRNA, תוצאות אלו מדגימות תרגום מוגבר של XIAP ו-BCL XL בתאים עם רמות PDC D ארבע מופחתות, כפי שאושש בהמשך באמצעות Western blossoming. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה על האופן שבו ניתן למדוד תרגום mRNA על ידי הכנת מדרג סוכרוז והפרדת פוליסומים באמצעות an ultracentrifugation.