שיטה של מבודד Ex Vivo ריאות זלוף במודל עכברוש: לקחים מפיתוח תכנית EVLP עכברוש
25 בפברואר 2015
Ex-Vivo ריאות זלוף (EVLP) אפשר השתלת ריאות בבני אדם להפוך לזמינה יותר בכך שיאפשר את היכולת להעריך איברים ולהרחיב את המאגר התורם. כאן אנו מתארים את הפיתוח של תכנית EVLP חולדה וחידודים המאפשרים למודל לשחזור להתרחבות עתידית.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להקים מודל עקבי של זלוף ריאות של חולדות, ex vivo שיניב תוצאות הניתנות לשחזור. השלב הראשון הוא קנולציה של קנה הנשימה ולהתחיל באוורור מכני. לאחר מכן, עורק הריאה והאטריום השמאלי הם קנולטים.
השלב האחרון הוא להסיר את בלוק ריאות הלב מחלל החזה ולהניח אותו במעגל זלוף הריאות ex vivo. בסופו של דבר, חיישני לחץ, מתמרי משקל ומנתח גזי דם משמשים להצגת מצב הריאה בזמן אמת על ידי מדידת לחץ עורקי ריאתי ופרמטרים אחרים. שפע ריאות ex vivo הוא טכנולוגיה יוצאת דופן שאפשרה לנו להרחיב את מאגר התורמים להשתלת ריאות.
אנו צופים שבאמצעות טכנולוגיה זו שתשמש פלטפורמה להערכת איברים, נוכל לשפר את איכות האיברים המובאים להשתלה ואת תוצאות ההשתלה הכוללות. כאן במעבדת הנחושת, טבענו את הביטוי חימוש האיבר, כלומר הערכה, שיפוץ או תיקון, ולאחר מכן שינוי האיבר כדי לשפר את האיכות ובכך לשפר את תוצאות ההשתלה. פיתחנו מודל חזק וניתן לשחזור של חולדות חיות קטנות של זלוף ריאות ex vivo.
באמצעות סרטון זה, נדגים את השלבים העיקריים והקריטיים עבורך לפיתוח מודל זלוף ריאות ex vivo זה, אשר לאחר מכן יכול לשמש פלטפורמה למחקר זלוף והשתלות. התחל בהגדרת מעגל EVLP והפצת שמונה חמים ברחבי המערכת. הגדר את אמבט המים החמים, מחליף החום ובית החזה המלאכותי ל-37 מעלות צלזיוס.
העבירו גז חמצון דאוקסי דרך ה-PERFUSE 8 במסנן הגז כדי להבטיח שיש בו כ-6% חמצן מומס לניסוי. לאחר פתיחת תוכנית רכישת הנתונים, חבר את מתמר לחץ עורק הריאה, קנה הנשימה, מתמר לחץ דיפרנציאלי, זרימת נשימה, מתמר לחץ דיפרנציאלי, מתמר משקל ריאות ומתמר מהירות משאבה לתיבת הממיר האנלוגי לדיגיטלי. לבסוף, ערכו את שולחן הניתוחים והכינו את כל כלי ההפעלה והאספקה הדרושים להליך.
לאחר אימות הרגעה על ידי הבוהן, צביטה, הנח את החיה המורדמת במצב שכיבה על שולחן הניתוחים. התחל להקליט נתונים באמצעות תוכנית רכישת הנתונים. כשהוא מוכן, היכנס לחלל הבטן והזריק הפרין לווריד הנבוב התחתון.
על פי נהלים סטנדרטיים, יש לזרוק את קנה הנשימה ולחבר את הצינורית למעגל אוורור. הפעל את מכונת ההנשמה המכנית כדי להתחיל לאוורר את הריאות באופן מכני. לאחר מכן, החזר את חלל בית החזה כדי לחשוף את הריאות תוך הקפדה להימנע מלגעת בהן.
הסר את בלוטת התימוס והעבר את תוכן הבטן לצד אחד כדי לחשוף את הווריד הנבוב התחתון או את הווריד המזנטרי. לאחר המתת חסד, הניחו תפר משי מאחורי עורק הריאה ואבי העורקים. כהכנה לאבטחת צינורית עורק הריאה, בצע חתך של שניים עד שלושה מילימטרים על המשטח הקדמי של דרכי היציאה של החדר הימני והכנס את הצינורית לעורק הריאה הראשי.
אבטח עם תפר משי, הסר קרישים מכלי הדם הריאתיים על ידי החדרת כ -15 מיליליטר של תמיסת אלקטרוליטים חיובית דלת אשלגן דרך עורק הריאה והחוצה דרך קודקוד הלב. לאחר מכן, מקם תפר משי מאחורי הלב וסביב החדרים. כדי להרחיב את המסתם המיטרלי ולהקל על הקנולציה, הכנס זוג קטן של מלקחיים כירורגיים לקודקוד דרך המסתם המיטרלי ולתוך הפרוזדור השמאלי.
כשהוא מוכן, הכנס צינורית לקודקוד דרך המסתם המיטרלי ולאטריום השמאלי. אבטח את צינורית האטריום השמאלית עם תפר המשי. לאחר מכן, חבר את צינורית עורק הריאה למעגל EVLP.
ודא שקו הזרימה המגיע מהמעגל מוכן עם פרפיוז שמונה. כדי למנוע כניסת אוויר ללב ולריאות, הפעל את המשאבה הפריסטלטית הראשית והגדר אותה למהירות נמוכה. זה יאפשר לחדירה שמונה לעבור דרך עורק הריאה ולצאת מהחדר השמאלי לחלל החזה.
עקוב אחר הלחץ של עורק הריאה כדי לוודא שהוא לא עולה מה שמעיד על סתימה או קנולציה לקויה. כשהוא מוכן, כבה את המשאבה הפריסטלטית. חבר את צינורית עורק הריאה למעגל זלוף הריאות ex vivo.
אין לחבר את צינורית האטריום השמאלית למעגל עד להסרת גוש ריאות הלב מהגוף. הסר את גוש ריאות הלב על ידי הידוק הוושט עם המוסטט וחיתוך מתחת למהדק כך שניתן יהיה להשתמש בוושט כדי להעלות את מבני הלב-ריאה בצורה בוטה, לנתח את הרקמה שמסביב ולחתוך את אבי העורקים היורד וכלי העזר כדי לשחרר את גוש ריאות הלב תוך כדי הרמתו דרך הוושט. חצו את קנה הנשימה כדי לשחרר את גוש ריאות הלב והנח אותו במיקום המיועד במעגל EVLP.
לאחר מכן חבר את צינורית האטריום השמאלית לקו היציאה והפעל את המשאבה הפריסטלטית. כדי להקליט נתוני אוורור ולנטר לחץ במהירות, הסר את קו האוורור מהחלק העליון של מכשיר EVLP והצמד את המארז עם חיישני הלחץ. לאחר מכן, הכנס מחדש את קו האוורור על גבי מנגנון EVLP.
ודא שמלכודת הבועות מלאה כראוי ב-perfuse eight. כדי להימנע מהכנסת בועות אוויר לריאות במהלך 15 הדקות הראשונות, שנה לאט את הגדרות האוורור והזלוף לרמות הניסוי הרצויות. הגדל את קצב זרימת הזלוף לקצב וללחץ הרצויים גם בשלב העלייה הראשוני הזה.
מומלץ לתכנת את מכונת ההנשמה לייצר נשימות צד לסירוגין כדי להקל על תנועת הנוזל מחוץ לחלל הריאות ולעכב את הופעת הבצקת. הגדר זמן אפס כזמן שבו פרמטרי האוורור נמצאים בנפח גאות של ארבעה מיליליטר לק"ג חיובי. סיים את לחץ הנשיפה בשני סנטימטרים.
פרמטרי H2O וזילוף נמצאים ברמתם הצפויה ונשארים קבועים. אם תרצה, קח את Perfuse שמונה דגימות מהקפאת הבזק יציאת הדגימה בחנקן נוזלי, ושים לב לזמן שבו נלקחו הדגימות. לאחר השלמת הניסוי, בודדו את כל החלקים האנטומיים הדרושים לאיסוף והקפיאו אותם בחנקן נוזלי או הניחו אותם בתמיסת קיבוע למחקרים נוספים.
משקל הריאות של חולדות ספראג לא השתנה באופן משמעותי במהלך 60 הדקות של זלוף ריאות ex vivo לאחר 10 הדקות הראשונות. כמו כן, לא היה שינוי בלחץ העורקי הריאתי. באופן דומה, תנגודת כלי הדם הריאתיים לא השתנתה לאורך כל המחקר.
לאחר שעה אחת של אוורור בנפחי גאות גבוהים וריכוזי ציטוקינים פרו-דלקתיים גבוהים עלו בשמונה PERFUSE, בעוד שריכוזי הציטוקינים האנטי דלקתיים נותרו ללא שינוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את השלבים העיקריים הדרושים להקמת מודל שפע ריאות של בעלי חיים קטנים לשעבר Viva בחולדות במעבדה שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את ביסוסו של מודל פרפוזיה של ריאה ex vivo (EVLP) בחולדה, שמטרתו לשפר את תוצאות השתלות ריאה. המודל מאפשר הערכה של מצב הריאות בזמן אמת, ובכך מרחיב את מאגר התורמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של השתלות
- פרפוזיה של ריאות Ex Vivo
- שימור איברים
רקע
- טכנולוגיית פרפוזיה של ריאות ex vivo מאפשרת הערכה טובה יותר של ריאות תורם.
- יש לה פוטנציאל לשפר את תוצאות ההשתלה באמצעות הערכת איכות האיבר.
- פיתוח מודל חיות הניתן לשחזור הוא קריטי לקידום המחקר.
- מעבדת Copper שואפת לשכלל את טכניקות הערכת האיברים.
מטרת המחקר
- ליצירת מודל עכבר עקבי עבור פרפוזיה של ריאות ex vivo.
- לקידום מחקרים על השתלת ריאות ושיפור איכות האיברים.
- להדגמת השלבים הקריטיים בהקמת מודל ה-EVLP.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קנולציה של הקנה, העורק הריאתי והעליה השמאלית.
- שימוש בחשכני לחץ ובאיסוף נתונים לצורך ניטור בזמן אמת.
- הקמת מערכת פרפוזיה חמה ושמירה על תנאים פיזיולוגיים.
- ביצוע שלב אחר שלב של הפרוצדורות הכירורגיות להוצאת הריאה.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של מודל EVLP בחולדה עם תוצאות הניתנות לשחזור.
- ניטור בזמן אמת של מצב הריאות במהלך הפרפוזיה.
- הדגמה של טכניקות לשיפור איכות האיבר לצורך השתלה.
- פוטנציאל לשיפור התוצאות בהשתלות ריאה באמצעות מודל זה.
מסקנות
- מודל ה-EVLP בחולדות הוא כלי בעל ערך למחקר בתחום השתלות ריאה.
- שיפורים במודל יכולים להוביל להערכה טובה יותר ולשימור יעיל יותר של איברי תורם.
- מחקר זה תורם למאמצים המתמשכים לשיפור שיעורי ההצלחה של השתלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביסוס של מודל הדיסו-ויבו (ex vivo) הדינמי לפרפוזיית ריאות של חולדה (EVLP) הניתן לשחזור מספק פלטפורמה פרה-קלינית להערכת אסטרטגיות לשימור ריאות ולהערכת איכות האיבר לפני השתלה. מודל זה תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית של התערבויות טיפוליות המכוונות לפגיעות ריאות מושרית-אוורור ולפתולוגיות אחרות הרלוונטיות לאופטימיזציה של ריאות תורם. על ידי מתן אפשרות לניטור בזמן אמת של פרמטרים ריאתיים, המערכת מגבירה את הביטחון החזוי בתהליכי גילוי בשלבים מוקדמים המתמקדים בביולוגיה של השתלות ובתיקון איברים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות לפגיעה בריאה ומנגנוני תיקון תחת תנאי פרפוזיה מבוקרים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי מתן אפשרות להערכה של מסלולים מולקולריים במערכת איברים שלמה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף, לצורך בדיקת תרכובות המיועדות לשיפור איכות הריאות.
- ערך תפעולי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות מדידה בזמן אמת של לחץ העורק הריאתי, משקל הריאות ופרמטרים של גזי דם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדמה פגיעה ריאתית המושרית an-וונטילציה (VILI) כדי להעריך תגובות פתופיזיולוגיות ולבחון אסטרטגיות פוטנציאליות להפחתת הנזק.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על תנאים פיזיולוגיים במהלך הפרפוזיה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מודל ה-EVLP בחולדה משתלב ברצף הגילוי על ידי תמיכה בבדיקת היפותזות בשלבים ביולוגיים מוקדמים, מתן אפשרות להכנת בדיקה (assay readiness) לסריקת תרכובות, ואספקת פלטים כמותיים לקבלת החלטות לגבי המשך קידום (go/no-go) בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת מעורבותם של מסלולים בתהליכי פגיעה וריפוי של הריאה.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון לחץ ריאתי ומשקל הריאה, לצורך השוואה בין תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מאפשרת רכישת נתונים בזמן אמת באמצעות חיישני לחץ, מתמירים של משקל ובדיקות גזי דם להערכת תפקוד הריאה.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות מידול של VILI, פתולוגיה רלוונטית קלינית בהשתלות ריאה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לצורך בדיקות איטרטיביות של תמיסות שימור, אסטרטגיות הנשמה וחומרים פרמקולוגיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות בתגובת הריאה להתערבויות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות פרוטוקולים מוגדרים של קנולציה, פרפוזיה וניטור.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מותאמת סיכון במחקר של שימור איברים, ובכך מפחית כשלים בשלבים מאוחרים של פיתוח השתלות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מועמדים על בסיס תוצאות תפקודיות של הריאה במקום על בסיס סממנים חלופיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בקנולציה של מיקרו-כלי דם ובאנטומיה קרדיו-pulמונרית במודלים של מכרסמים.
- תלוי בציוד הכולל משאבות פריסטלטיות, חיישני לחץ (pressure transducers), חיישני משקל ואנליזים לגזים בדם.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי פרפוזיה, הגדרות מאוורר ופרוטוקולים לרכישת נתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר ממודלים של חולדות למודלים של יונקים גדולים יותר או להערכת ריאה אנושית.
- כולל מגבלות מעשיות כגון מורכבות טכנית של הוצאת בלוק לב-ריאה ושמירה על סטריליות במהלך הפרפוזיה.
