Name: נתיחה והתקנה דרוזופילה גלמי דיסקי העין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: למדו את שיטת נתיחת וניקוד גלמי עין של Drosophila melanogaster לחקר התפתחות העין. השיטה מאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של מבנים תאיים וחלבונים בדיסקית העין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מעריכים ורוצים להודות למכון הרפואי הווארד יוז על פרס הפרופסור HHMI לאוניברסיטת בנגלדש שאפשר את הפרויקט הזה. אנו מודים למכללה באוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס על מתן מתקנים ותשתיות הוראה לעבודה זו. העבודה נתמכה גם במימון מאוניברסיטת מידווסטרן ותרומה נדיבה מקרן מתנות הצדקה Fidelity. אנו מודים לג'ון ונדנברוקס על הערותיו על כתב היד ולקריסטה פירמן על הסיוע הטכני שלה.

הליך זה הוא הליך 2 יום. יום 1 (שעה 2 + לנתח זמן) Dissection 1. גלמי עין הדיסק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר גולם לנתיחה. הערה: גיל הגולם להיות גזורים תיקבע על ידי צרכי הניסיוניים. עם זאת, אם בוחן את המורפולוגיה של תאים, זה נעשה לעתים קרובות על 42 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF) של 25 מעלות צלזיוס, שהוא הגיל של הגלמים ניתן לראות בסרטון. אסוף לבנים גלמים (APF 0 שעה הנחשבת) עם מכחול רטוב ולסדר אותם בסדר כרונולוגי (המבוסס על זמן איסוף) בבקבוקון אוכל לטוס חדש נשמר על 25 מעלות צלזיוס. לנתח את הגלמים המיושנים באותו סדר כרונולוגי זה כדי לשמור על פרש הזמן בין שני גלמים קרובים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הגולם לירידה של פוספט שנאגרו מלוח (PBS, pH 7.4, לראות חומרים למתכון) על צלחת לנתח סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את החלק העליון של המקרה גלמי עם מלקחיים ופירס ולפתוח את lחלק ower של המקרה גלמי עם זוג מלקחיים חדים. הסר את הגולם מהמקרה לחור שהוקם זה עתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אלכסוני במספריים, באמצע בית חזה-, בגולם. הסר את הפסולת או להעביר את ראש הגולם לירידה חדשה של PBS. נקה באמצעות צינור מפוח פיפטה (ראה חומרים ואיור 1 לפרטים נוספים) ולהוסיף PBS נוסף בהתאם לצורך. ודא כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחיזה מאובטחת העליון של ציפורן ראש גלמים עם זוג המלקחיים. באמצעות הקצה של מפוח הצינור, דחף בעדינות על המקרה גלמי כדי למתוח את המוח וברקמות אחרות, כוללים דיסקי העין, מתוך המקרה גלמי. הקפד להימנע תופס את כל רקמה בתוך הציפורן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש במפוח הצינור מלא PBS, בעדינות לפוצץ את רקמת שומן בגוף ופסולת אחרת ממקרה הראש להפריד באופן ברור ולזהות דיסקי המוח ועיניים. הערה: שמירה על המוח המצורף במקרה ראש גלמים תאפשר לחוקר להשתמשמקרה מודעה כ&quot; ידית &quot;למניפולצית עתיד של הרקמה מבלי לפגוע בדיסקי עין או במוח. עם זאת, זה נפוץ כדי לסלק את דיסקי המוח והעין ממקרה הראש וזה לא פוגע בהליך והתוצאות הכוללים. זה לוקח בדרך כלל ניסיונות מרובים של פיצוץ ודוחף להצלחה לחלץ את דיסקי העין ומוח מבפנים מקרה ראש גלמים וכך שהם באופן ברור, בנפרד מרקמה הסובבת. נקי יותר ויותר נפרד אחד יכולים לקבל דיסקי עין מן הרקמה הסובבת יסייעו למנוע רקמות זרות מתיקון לדיסקי עין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות נתיחה, להעביר באופן מיידי את הרקמה לצלחת זכוכית 3 גם על קרח עם 0.5 מיליליטר של תמיסת תקן (ראה חומרים). לצוף הרקמה על פני השטח של פתרון תקן לכמה דקות (בדרך כלל הזמן שלוקח לנתח את הסדרה הבאה של דיסקי העין). הערה: אם זה לא דיסק העין הראשון להיות גזור בסיבוב הנתיחה, completel זהy להטביע את דיסק העין הקודם לפתרון תקן. אם ביצוע נהלים מיוחדים צביעה (לדוגמא, מיני חמצן תגובתי, lysosomes, וכו &#39;) זה חייב להיעשות לפני הקיבוע. כדי לעשות זאת, לאחסן את תקליטורי עין גזורים בPBS קר כקרח לפני המשך הפרוטוקול מכתים המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות נתיחה והטמעה של כל דיסקי העין עוברת ניתוחים, להעביר את צלחת זכוכית 3 גם לנדנדה ורוק בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. </li></ol> 2. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את פתרון התיקון ומוסיף 0.5 מיליליטר של PBS עם 0.3% Triton X-100 (PBT 0.3%, לראות חומרים) ולשטוף את הרקמה על כיסא נדנדה במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד). הערה: הסרה זהירה של הפתרון מהבאר ניתן לבצע תחת מיקרוסקופ לנתח כדי למנוע נזק לרקמות או הפסד. הפתרון יכול להישאף בזהירות עם pipet; אנחנו מעדיפים עדין tippeד, pipet העברה חד פעמי כי יש לו הפתיחה השטוחה כדי להקטין את הסיכוי של aspirating רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של השטיפה 4, להסיר את לשטוף ולהוסיף 0.5 מיליליטר פתרון לחסום (ראה חומרים) ולדגירה במשך 30 דקות. הערה: מסגרת זמן זו ניתנת להארכה בהתאם לצרכים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של זמן חסימת 30 דקות, pipet 10 μl של ראשי נוגדני פתרון (בדילול מלא פתרון בלוק) למספר המתאים של בארות בצלחת microwell. הערה: גם אחד מצלחת microwell יהיה להכיל כ 4 זוגות של דיסקי עין מצורפים במקרה גלמים או 8 זוגות בודדים של דיסקי עין עם המוח המצורף. הנוגדנים העיקריים בשימוש בפרוטוקול זה לנתונים הנציג הם אנטי-phosphotyrosine (1: 500 דילול) ואנטי-Cut (1: 200 דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה גזור לתוך בארות צלחת microwell מלאות היסודי נוגדני הפתרון מצלחת זכוכית 3 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקוםצלחת microwell על מגבת נייר רטובה (כדי למנוע התייבשות) בתיבת pipet הריק קצה (או מיכל דומה אחר) ולאחסן ב 4 ° C למשך הלילה. </li></ol> יום 2 (4 שעות + ההרכבה זמן) <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה מצלחת microwell לצלחת זכוכית 3 גם חדשה עם 0.3% PBT (≈0.5 מיליליטר) ולשטוף את הרקמות של 10 דקות על הנדנדה. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השטיפה האחרונה ומוסיף 0.5 מיליליטר של תמיסת הבלוק לבאר. לחסום למשך 30 דקות. הערה: מסגרת זמן זו ניתנת להארכה בהתאם לצרכים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון החסימה ולהוסיף 0.5 מיליליטר של משני נוגדני הפתרון (עשוי מנוגדנים שכותרתו fluorescently מתאימים לנוגדן העיקרי שלך ואורך גל ניאון, בדילול מלא בפתרון בלוק) לטוב ולהגן על צלחת זכוכית 3 גם מהאור עם כיסוי או אלומיניום לסכל ודגירה של לפחות 2 שעות בחדרטמפרטורה. הערה: כל הצעדים הבאים צריכים להיות מוגנים באופן דומה מחשיפה לאור. דגירה זה יכול להתארך עד הלילה ב 4 ° C, בהתקנה דומה לדגירת הנוגדן הראשונית, אך הוא גם יכול להתבצע בכלי זכוכית 3 גם מכוסים בסרט מעבדה, או צלחת microwell אם שימור נוגדן הוא רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה הנוגדנים, להסיר משני נוגדני הפתרון ולהוסיף 0.5 מיליליטר של PBT 0.3% לטובים ולשטוף בנדנדה במשך 10 דקות. חזור על שלב זה עבור הסכום כולל של 4 שטיפות (10 דקות כל אחד). הערה: אם מכתים DAPI הוא רצוי, לפני שמתחילים לשטוף הראשון, להוסיף 0.5 μl של פתרון מניות DAPI (ראה חומרים) ל-500 μl של PBT שישמש להדחה הראשונה (1: 1,000 דילול). </li></ol> 3. הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של השטיפה האחרונה, הר דיסקי מחושים / עין על שקופית באמצעות גליצרול 70% או PBS כמדיום כדי להסיר את brעין וברקמות לא רצויות אחרות בבריכה בצד אחד של השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזיז את הרקמות באמצעות לחץ ההידרוסטטי בין המלקחיים, או בעדינות עם קצה מלקחיים, ושורת דיסקי עין בטור לכיוון המרכז של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל גליצרול הזר או PBS מכל רחבי הרקמה (באמצעות פעולת הפתילה של מעבדה נגבתה או המלקחיים לעבוד על זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמות קטנה (≈10 μl) של מדיום גובר בצד אחד של טור דיסק העין ובמקום coverslip על הרקמה על מנת להפיץ את המדיום גובר על דיסקי עין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו לשבת שקופיות 1 עד 2 דקות כדי לאפשר לרקמות / ההרכבה בינונית להתפשט לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב כל מדיום הרכבה נוסף מן מסביב לקצוות של coverslip ולאטום אותו עם לק ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות ניאון של דיסקי העין באמצעות מיקרוסקופ confocal. </li></ol>

<ol><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+adhesion+mediated+by+Hibris+and+Roughest+regulates+morphogenesis+and+patterning+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+cell%22%5BJournal%5D)">Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye.</a> Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).</li>
<li>Grzeschik, N. A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IrreC%2Frst-mediated+cell+sorting+during+Drosophila+pupal+eye+development+depends+on+proper+localisation+of+DE-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin.</a> Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).</li>
<li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).</li>
<li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40 (4), 851-858 (1985).</li>
<li>Voas, M. G., Rebay, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+during+development%3A+insights+from+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Signal integration during development: insights from the Drosophila eye.</a> Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).</li>
<li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+immunohistochemistry+of+larval%2C+pupal+and+adult+Drosophila+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas.</a> J Vis Exp. , 4347(2012).</li>
<li>Call, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+clonal+analysis+of+lethal+mutations+in+the+Drosophila+melanogaster+eye%3A+comparison+of+the+X+chromosome+and+autosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes.</a> Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery-based+science+education%3A+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3 (2), 59(2005).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. 37, 1936(2010).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אמנם נראה שהתהליך פשוט וקל לביצוע, אך במציאות, טכניקה זו דורשת תרגול רב כדי לשלוט בה. באופן שגרתי, אנו מתחילים את התלמידים בלימוד לנתח ולהרכיב דיסקים של עין כוכב שלישי12, שהרבה יותר קל לעבוד איתם. תרגול זה מסייע לפתח תנוחת דיסקציה מתאימה של הזרועות, הידיים והאצבעות13 כך שמניפולציה של המלקחיים תחת מיקרוסקופ הניתוח תהיה יציבה, קלה ומנוסה. בעיקרו של דבר, תקופת התרגול אמורה להשיג את המטרה של הפיכת המלקחיים להרחבה טבעית של האצבעות והאגודל, המאפשרת את התנועות הדיסקרטיות והעדינות הנדרשות בדיסקציה. </p...

תחומי ביולוגיה התפתחותית ותא כבר הושפע רב מאורגניזם המודל: דרוזופילה melanogaster. בתוך מודל זה, מחקרים של דיסק העין תרמו רב איתות ידע הנוגע ל, ביולוגיה של תא ובאזורים אחרים. דיסק הזחל השלישי מאוחר עין instar נחקר בהרחבה והוא מודל רב עוצמה לנצל, כפי שהוא נותן תמונת מצב של סדרה של תקופות התפתחותיות, כל אחד עם המולקולות שלו האיתות ייחודית ותהליכים, כמו תלם המוךפו&quot;גנטי מתקדם פני דיסק העין 8. עם זאת, יש צורך להרחיב עוד יותר את ההבנה של תהליכים התפתחותיים שלנו לשלב גלמים של פיתוח. אמנם היו מחקרים על דיסק עין גלמי 3-7, הידע שלנו לא מתקרב לרוחבה של עבודה שבוצעה על דיסק עין instar השלישי. זאת בשל, בחלקו, לקושי הגדול יותר בלנתח את דיסק עין גלמים. לכן, הצגתשיטה נכונה של נתיחה יכולה להרחיב מאוד את המחקר בתחום זה. אמנם יש שלבים בהתפתחות דיסק עין גלמים שבקלות גזורים, במיוחד סביב תקופת אמצע גלמים-, תקופות זמן אחרות הן הרבה יותר מאתגר לנתח. פרוטוקול זה מייצג שיטה אחת ללנתח דיסקי עין גלמים שניתן להשתמש בי אוניברסלי לכל מסגרות הזמן התפתחותי גלמים. פרוטוקול זה יכול לשמש כתחליף לעוד פרוטוקול 9 שמראה שיטה קלה ומהירה יותר לנתח דיסקי עין מנקודות זמן midpupal. פרוטוקול זה צולם במקור ופיתח להכשרת סטודנטים לתואר ראשון מתקדמים באוניברסיטת UCLA לתואר ראשון קונסורציום המחקר בגנומיקה פונקציונלית (URCFG) 10,11 בטכניקה של נתיחת עין גלמים. סטודנטים לתואר ראשון רבים היו מסוגלים לנצל את וידאו ובשיטה זו כדי ללמוד את הטכניקה מאתגרת זו.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח עם חומצת פוספט (PBS, pH 7.4)80</td><td></td><td></td> <td>גרם NaCl, 2 גרם&nbsp; KCl, 14.4 גרם Na2HPO4, 2.4 גרם KH2PO4, הביא את הנפח ל-1 &#956; l, כוונן את ה-pH ל-7.4, חיטוי או מסנן לעקר, לדלל ל-1x PBS עם חיטוי ddH2O לפני השימוש.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>זהירות: מגרה! ללבוש כפפות.</td></tr><tr><td>0.3% PBT</td><td></td><td></td><td>1.5 מ"ל של Triton X-100, 500 מ"ל 1X PBS.</td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד 37%</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>F75P1GAL</td><td>זהירות: רעיל, ככל הנראה מסרטן בבני אדם! ללבוש כפפות.&nbsp;</td></tr><tr><td>תיקון פתרון</td><td></td><td></td><td>(&asymp; 4% פורמלדהיד ב-PBS) 50 &mu; l של 37% פורמלדהיד, 450 &mu; l 1x PBS, לעשות טרי לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>נוגדנים ובדיקות</td><td>רוקלנד B304</td><td>Aliquot בנפחים של 1 מ"ל ולאחסן ב -80 & #176; </td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> בלוק C <td>10% NGS ב-PBT.&nbsp; ניתן להכין ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C למספר ימים לפני השימוש.</td></tr><tr><td>פתרון מלאי DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>לגרעיני צביעת קוטנר הכן תמיסה של 1 מ"ג/מ"ל עם ddH2O.</td></tr><tr><td>VectaShield הרכבה בינונית</td><td>וקטור מעבדות</td><td>H-1000</td><td>הרכבה בינונית</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>להרכבה. הכן דילול של 70% עם ddH2O.</td></tr><tr><td>מיקסר אגוזים</td><td>ציוד</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> VWR 82007-202 משמש לרקמות סלע בצלחת זכוכית 3 באר <tr><td>SylGard 182 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>Krayden</td><td>NC9897184</td><td>משמש להכנת צלחת חיתוך סיליקון</td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td> <td>חיתוך סיליקוןיש לערבב בעדינות את ערכת האלסטומר של Sylgard (למעלה) לפי ההוראות (כדי למנוע בועות). יוצקים את התערובת לצלחת פטרי (בכל גודל). אפשר ל-SylGard להתרפא למשך הלילה ב-37 מעלות; חממת C.</td></tr><tr><td>צלחת זכוכית 3 בארות</td><td>קורנינג</td><td>7220-85</td><td>מגוון 3 הבארות של אלה כבר לא זמין, זהו המוצר 9 בארות.</td></tr><tr><td>72 באר מיקרווול מיני-מגש</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים חדים (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מיקרו מסוג Vannas, ישר, להב 5 מ"מ</td><td>טד פלה</td><td>1346</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ נימי זכוכית בורוסיליקט 100 מ"מ</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>משוך עם מושך מחט כדי ליצור קצה נקודתי עדין המאפשר לזרם קטן של PBS לזרום.</td></tr><tr><td>צנרת העברה חד פעמית, קצה עדין</td><td>Samco Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>מידות הצינורות שניתנו הן קוטר פנימי (ID) x קוטר חיצוני (OD) x עובי דופן באינצ'ים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות PVC (1/8 x 3/16 x 1/32)</td> <td>Nalgene</td><td>8000-0010</td><td>השתמש בהם עם מחט משוכה כדי להרכיב את צינור המפוח כפי שמוצג באיור 2.</td></tr><tr><td>צינורות סיליקון Tygon (3/32 x 5/32 x 1/32</td>)<td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>ABW00004</td><td></td></tr><tr><td>צינורות סיליקון Tygon (1/32 x 3/32 x 1/32</td>)<td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>ABW00001</td><td></td></tr></tbody></table>

נתיחה והתקנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי דיסקי העין

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

דיסק העין Drosophila melanogaster הוא מערכת רבת עוצמה שניתן להשתמש בה כדי לחקור תהליכים ביולוגיים רבים ושונים. הוא מכיל כ-800 יחידות עיניים נפרדות, הנקראות אומטידיה1. כל אומטידיום מכיל שמונה קולטני אור עצביים המתפתחים מתאים לא ממוינים לאחר מעבר התלם המורפוגנטי בכוכב הזחלהשלישי 2. בעקבות ההתמיינות הרציפה של קולטני האור, מתפתחים תאים לא עצביים, כולל תאי חרוט ופיגמנט, יחד עם תאי זיפים מכניים-סנסוריים3. תהליכי התמיינות סופיים, כולל הסידור המובנה של כל סוגי התאים האומטידיאליים, מוות תאי מתוכנת של סוגי תאים לא ממוינים וביטוי רודופסין, מתרחשים דרך שלבהגולם 4-7. טכניקה זו מתמקדת במניפולציה של דיסק עין הגולם, ומספקת תובנה והדרכה כיצד לנתח את דיסק העין במהלך שלב הגולם, שהוא מטבעו קשה יותר לביצוע מאשר דיסק העין השלישי המנותח בדרך כלל. טכניקה זו מספקת גם פרטים על צביעה חיסונית כדי לאפשר הדמיה של חלבונים שונים ורכיבי תא אחרים.

כדוגמא לשימוש בפרוטוקול זה, תוצאות ממחישות midpupal (42 שעות APF של 25 מעלות צלזיוס) דיסקי עין immunostained עם נוגדנים שונים מוצגים באיור 2. על ידי שימוש בנוגדן מכוון נגד שאריות phosphotyrosine, הקרום של התאים יכול להיות (איור 2 א) שנצפה. זה יכול לשמש כדי לזהות את ההסדר הקבוע של תאי ommatidial בעיני גלמים בעקבות תהליכי הדפוסים הסופיים המתרחשים לפני שלב midpupal. תמונת נציג אחרת מתארת ​​את הגרעינים של תאי חרוט יכולים מזוהים על ידי שימוש בנוגדנים נגד גורם השעתוק חת...

מטרת טכניקה זו היא לאפשר לחוקרים לבצע דיסקציה, צביעה חיסונית והרכבה של דיסקים של עין גולם מדרוזופילה מלנוגסטר בכל גיל.

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

ברוכים הבאים להדגמה של דיסקציה של דיסקת העין של בובת דרוזופילה (drosophila melanogaster) והרכבתו. יש לבחור בובת דרוזופילה בשלב התפתחותי מתאים. הדיסקציה מתחילה בחירור מעטפת הבובה והוצאת הבובה מהמעטפת.מבצעים חיתוך אלכסוני במרכז החזה של הגולם. לאחר חיתוך הגולם, יבודדו המוח וה-iis ויעובדו לפני הרכבת ה-iis. כדי להתחיל בתהליך המיקרוסקופיה, נבחר גולם בגיל מתאים לביצוע הדיסקציה.הנח את הגלגול בטיפה גדולה של PBS על צלחת הניתוח. הפרקטיקה המומלצת היא לכוון את הגלגול כך שוויתרי הפה (mouth hooks) פונים כלפי מטה. אלו הם ויתרי הפה הפונים כלפי מטה.אחזו בבובה בעדינות באמצעות זוג פינצטות. היזהרו לא ללחוץ חזק מדי על הבובה המתפתחת בתוך מארז האישון עם פינצטות חדות. נקבו את מארז האישון ואפשרו לארבעה שלבים להתפשט כדי לקרוע את הקצה.הגיעו פנימה והוציאו את הגלגול המתפתח מהחור שנוצר הרגע. לאחר מכן, קחו מספריים וגזרו את הגלגול בערך במפלס מרכז החזה. בצעו את החיתוך באלכסון.בשלב זה עדיף להסיר את השאריות או להעביר את ה-PU קדימה לטיפה חדשה של PBS. ניתן לבצע את הניקוי באמצעות צינור נשיפה של פיפטה ויש להוסיף PBS נוסף לפי הצורך, תוך הקפדה על מניעת התייבשות. לאחר מכן, אחזו בחוזקה בחלק העליון של הקוטיקולה של ראש האישון באמצעות פינצטה.הקפידו להימנע מתפיסת רקמה כלשהי בתוך הקוטיקולה באמצעות קצה צינור הנשיפה. דחפו בעדינות את מארז האישון כדי להוציא את המוח ואת דיסק העין מתוך מארז האישון. כדי לסייע בתהליך זה, השתמשו ב-PBS בצינור הנשיפה כדי לנשוף בעדינות את השאריות, כפי שניתן לראות כאן, אל מחוץ למארז הראש כדי לאפשר הפרדה וזיהוי ברורים של המוח ושל דיסקי העין. המשיכו בתהליך זה של דחיפה ונשיפה לפי הצורך, עד שהמוח ודיסקי העין יופרדו מהרקמה שסביבם וניתן יהיה לזהותם בקלות. כעת ניתן לראות כאן את דיסק העין; בבובה זו כבר החלה הפיגמנטציה, ולדיסקי העין יש צבע קל.דיסקיות העין מסומנות באדום והמוח מודגש ביניהן. בהגדלה גבוהה יותר, ניתן לזהות בקלות כל אחת מדיסקיות העין. שוב, דיסקיות העין סומנו באדום כאשר המוח נמצא ביניהן.יש להמשיך לנקות ולהפריד את המוח ואת ה-I.Discs מהרקמה שנותרה באמצעות פינצטה וצינור נשיפה באופן אופטימלי; המוח ודיסק העין צריכים להישאר מחוברים לקוטיקולה של הראש, כך שהיא תשמש כידית עבור הפינצטה למניפולציות עתידיות. עם זאת, תהליך הנשיפה והדחיפה עלול להוביל לניתוק נפוץ של המוח ודיסק העין מהקוטיקולה של הראש. לאחר בידוד זהיר של ה-I dis והמוח, יש להניח בעדינות את הרקמה לתוך תמיסת הקיבוע.בתחילה, יש להניח לדיסקיות ה-I לצוף על פני המקבע כדי שלא יקרסו על עצמן ויקבעו במצב סגור; הפרקטיקה המומלצת היא להוציא את דיסקיות ה-I באמצעות דיסקציה ולהניח להן לצוף על המקבע. הן נשארות לצוף בזמן שסבב הבא של דיסקיות I מופק בדיסקציה, ולאחר מכן הן טובלות במקבע להמשך קיבוע. הן מעובדות לפי הצורך, למשל באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית, ולאחר מכן מורכבות על תבנית לצורך ויזואליזציה.כאן מוצגות דיסקיות pupil I מקובעות כאשר המוח עדיין מחובר אליהן בטיפה גדולה של PBS. ההרכבה והשימוש בגליצרול הם קשים מאוד לביצוע, למרות שהצלחנו לבצע הרכבה ב-50% glycerol ו-PBS. אם אתם מבצעים הרכבה ב-PBS, הקפידו למנוע דהידרטציה.שימו לב כי הקוטיקולה של הראש הוסרה. כל דיסק עין (I disc) מוקף בקו אדום. המוח מודגש ביניהם.השתמשו בפינצטה חדה כדי לנתק את הקשר בין דיסקית העין למוח. פעולה זו מבוצעת על ידי החזקת המוח והנחת הפינצטה החדה בנקודת החיבור כאן. שלב זה עלול להיות קשה מאוד.חשוב להשתמש בפינצטה חדה כיוון שהיא מקלה מאוד על תהליך זה. ניתן לבצע הפרדה זו גם באמצעות מחט דיסקציה עדינה, כפי שניתן לראות. לעיתים קל יותר למשוך את המוח תוך ייצוב של דיסקת העין בנקודת החיבור.נשארת כמות ניכרת של רקמה עודפת על דיסקת העין הזו, שאינה אמורה להשפיע על הדמיית דיסקת העין כל עוד דיסקת ה-I מורכבת על תבנית המיקרוסקופ כאשר צד זה פונה כלפי מעלה. דבר זה מאפשר למשטח האפיקלי של דיסקת ה-I להישען בצורה שטוחה על תבנית המיקרוסקופ. מצאנו כי הסרה נוספת של רקמה זו מובילה בדרך כלל לנזק לרקמה של דיסקת ה-I.לכן, עדיף להשאיר רקמה זו ולהימנע ממנה בשלב הדמיון. טכניקה נוספת להסרת המוח כוללת קיבוע של דיסק העין בנקודת החיבור באמצעות מחט דיסקציה או פינצטה חדה, כפי שניתן לראות כאן, ולאחר מכן משיכת המוח החוצה. ניתוק זה היה נקי יותר, עם פחות רקמה שנותרה על דיסק ה-I.לאחר שסיימת להכין את כל דיסקי ה-I, סדרו אותם בשורה כאשר המסלול האופטי פונה כלפי מעלה. הסירו את ה-PBS והחליפו אותו ב-VTA shield או במדיום קיבוע אחר, וכסו אותם בזכוכית כיסוי. דיסקי ה-I מוכנים כעת לדימות באמצעות הטכניקות המתוארות כאן, יחד עם הפרוטוקול המפורט לצביעה אימונוהיסטוכימית.בכתב היד ניתן לדמיין את ה-I disc באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך בחינת מאפיינים מורפולוגיים, כפי שניתן לראות כאן בצביעת phosphotyrosine, החושפת את המורפולוגיה האפיקלית של תאי ה-omel ב-I disc. ניתן להשתמש בנוגדנים נוספים ובטכניקות גנטיות כדי לזהות סוגי תאים ותבניות ביטוי, כפי שמוצג כאן עבור הביטוי של גורם השעתוק cut בתאי הקונוס של ה-I disc. סרטון זה מהווה גרסה משופרת (remastering) של סרטוני הדרכה שהופקו כדי להדריך סטודנטים לתואר ראשון בטכניקה זו.סטודנטים רבים הוכשרו בהצלחה בטכניקה זו באמצעות סרטון זה, ואנו מקווים שגם הוא יסייע לכם. אנו מאחלים לכם הצלחה רבה בניסוייכם ומקווים שטכניקה זו תועיל לכם.

dissection-and-mounting-of-drosophila-pupal-eye-discs

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה לנתיחה משמש לבידוד דיסקים דמותי מן הזחלים תסיסנית בשלב instar 3. שיטות לתיקון רקמות אחרי אומר והסרה של הזרוע, רגל, עין ודיסקים הם הוכיחו ישירות על שקופיות מיקרוסקופ להדמיה הבאים.

Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar

אנו מתארים רומן אדום חלבון פלואורסצנטי (RFP) כתב כי באה לידי ביטוי במיוחד...

RFP כתב רומן על סיוע ויזואליזציה של דיסק העין דמותי ב תסיסנית</em

הגישה הסטנדרטית כדי להכין את...

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

בעת צביעת דיסקים דמיוניים של דרוזופילה, לעיתים קרובות מתבצעת דיסקציה גסה בה הדיסקים חשופים אך נשארים מחוברים לגוף. לאחר המוכתמים, הדיסקים המעניינים מבודדים ומורכבים. הפרוטוקול לדוגמה מדגים הליך לדיסקציה והרכבה של דיסק דמיוני בכנף.

דרוזופילה דיסקציה דמיונית של הזחל: שיטה להתבוננות בהתפתחות אפיתליה

סרטון זה מתאר כיצד לנתח ולבודד את קומפלקס עין-מוח מגלמי דרוזופילה. הפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך המניב רקמות באיכות גבוהה, התואמות, למשל, immunostaining, כמו גם, ניסויים אחרים ביטוי גנים.

דיסקציה של קומפלקס עין-מוח מגלמי זבובים: שיטה לבידוד רקמת רשתית

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה להדמיה של נוירואפיתל עין גולם חי של דרוזופילה. שיטה זו מפצה על תנועת רקמות וטופולוגיה לא אחידה, משפרת את ההדמיה של גבולות התא באמצעות שימוש בחלבוני צומת מרובים המתויגים ב-GFP, ומשתמשת במתקן הדמיה המורכב בקלות.

Live-הדמיה של דרוזופילה גלמי עין

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת עבור תרבות הדמיה חיה vivo לשעבר לטווח ארוך של דיסק דמותי דרוזופילה. זה מדגים בידול קולטי אור וסיבוב ommatidial בתוך התקופה 10 שעות של הדמית חיה של דיסק העין. הפרוטוקול הוא פשוט ואינו דורש התקנה יקרה.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

מאמר זה מציג שיטה כירורגית ניקוד דרוזופילה הרשתיות הגולמי יחד עם פרוטוקולים עיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA-חילוץ.

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

למדו את שיטת נתיחת וניקוד גלמי עין של Drosophila melanogaster לחקר התפתחות העין. השיטה מאפשרת הדמיה מיקרוסקופית של מבנים תאיים וחלבונים בדיסקית העין.

נתיחה והתקנה

גלה סרטונים נוספים