אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מהדק דינמי במבחנה בנוירונים בקליפת המוח באמצעות ארגז הכלים הזמין בחינם, LCG. זה מושג על ידי הכנת פרוסות של קליפת המוח הסומטוסנסורית של חולדה להקלטות מהדק טלאי מתאי הפרמטאל. כשלב שני, סדרה של פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיים אוטומטיים מיושמת על התא המוקלט, המספק אפיון סטנדרטי של התא שיהיה שימושי לניתוחים והשוואות עוקבים בין סוגי תאים.

לאחר מכן, מדמה הזרקה של אירועים סינפטיים מעוררים ומעכבים. על מנת לשחזר את מצב המוליכות הגבוהה שחווים הנוירונים הניאו-קורטיקליים in vivo, התוצאות מראות כיצד הזרקה סינפטית ברקע מווסתת את הרווח של תאי קליפת המוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא האפשרות להטמיע הקלטות ניסיוניות בתהליכי עבודה מורכבים יותר על ידי שימוש, למשל, בתוצאה של פרוטוקול ניסיוני אחד כקלט לפרוטוקול אחר.

שיטה זו יכולה לעזור לתקנן פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיים, להאיץ את ניתוח הנתונים ולסלול את הדרך לשיתוף נתונים בין מעבדות. למרות ששיטה זו פותחה במקור עבור הקלטות CLA סיטונאיות במבחנה, ניתן להשתמש בה בנוחות גם להכנות ופרוטוקולים ניסיוניים אחרים, כגון תיקון in vivo, הקלטות CLA או הקלטות מאיץ עם מיקרו למערך המירוץ. לאחר חילוץ מוח החולדה השליכו את המוח הקטן והפרידו את שתי ההמיספרות לאורך קו האמצע באמצעות אזמל, הסירו עודפי נוזלים מאחת ההמיספרות והדביקו אותו על פלטפורמה משופעת עם טיפת דבק סופר.

לאחר מכן הוסיפו במהירות כמה טיפות של CSF מעל המוח והעבירו אותו לתא הוויברם. הסר את 2.5 עד 3 המילימטרים הראשונים של רקמת המוח בעזרת להב. לאחר מכן, התאם את מהירות החיתוך ותדירותו על מנת להגביל את הנזק למשטח הפרוסה.

לאחר מכן, הגדר את העובי ל -300 מיקרומטר והתחל לפרוס. לאחר שהלהב עבר את קליפת המוח, השתמשו בסכין גילוח או במחט כפופה כדי לבצע חתך מעל ההיפוקמפוס ובשולי אזור העניין בקליפת המוח. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לתא דגירה מרובה בארות בטמפרטורה של 36 מעלות צלזיוס.

בהליך זה, הנח פרוסה בתא ההקלטה עם עדשת ההגדלה של פי 40. חפש תאים בריאים בשכבה חמש ו-600 עד 1000 מיקרומטר. מתחת לפני השטח של המוח, לתאים האלה יש בדרך כלל ניגודיות נמוכה יותר, מראה חלק והם לא נפוחים.

לאחר שנמצא תא בריא, טען שליש מהמיקרו פיפטה בתמיסה תוך-תאית. לאחר מכן הנח אותו בשלב הראש במערכת ההפעלה לינוקס שהוגדרה מראש. הפעל פקודה.

מעטפת מוסיפה את ההנחיה שלה. הקלד פקודה זו כדי לוודא שלוח רכישת הנתונים אינו מניע את המגבר. לאחר מכן הפעל 30 עד 50 מיליבר של לחץ חיובי על ידי לחיצה על בוכנה של המזרק, המחוברת למחזיק הפיפטה.

לאחר מכן, הניחו את הפיפטה כ-100 מיקרומטר מעל הפרוסה והזיזו את הפיפטה לכיוון תא המטרה באמצעות מצב הגישה של מניפולטור המיקרום. לאחר מכן, כוונן את קיזוז הפיפטה על מגבר האלקטרופיזיולוגיה והוציא דופק בדיקה של 10 מילי-וולט במצב מהדק מתח. שימוש בבדיקת הפקודה LCG SEAL כדי לנטר את התנגדות הפיפטה, ולאחר מכן להפחית את הלחץ ל-10 עד 30 מיליבר על ידי משיכת הבוכנה של המזרק.

התקרב בעדינות לתא ובדוק אם נוצרת גומה על ידי התבוננות בתמונה על צג מצלמת הווידאו. במקביל, עקוב אחר עלייה בהתנגדות שמעורר דופק הבדיקה על ידי צפייה בצורת הגל הנוכחית המוצגת על הצג. כאשר יש עלייה בהתנגדות הפיפטה והיווצרות גומה על התא, שחרר מיד את הלחץ והפעל לחץ שלילי עדין על הפיפטה כדי לסייע להיווצרות החותם.

בינתיים, הפחיתו בהדרגה את פוטנציאל ההחזקה ל-70 מילי-וולט שלילי. הפעל יניקה עדינה כדי לקרוע את קרום התא ולבסס את כל תצורת התא. לאחר מכן אפיינו את התא מבחינת תכונותיו החשמליות.

באמצעות הפקודה קוד LCGE. להלן פוטנציאל הפעולה הממוצע של נוירון פרמטאלי בשכבה מתוקנת עם סף שלילי של 50.5 מילי-וולט. איור זה מציג את מדידת התגובות הפסיביות לזרמים ההיפר-פולריזציה.

זיהוי התכונות הפעילות הבסיסיות של התא מגלה כי התא הוא נוירון מזנק רגיל, ויש הסתגלות מינימלית להזרקת פוטנציאלים מעוררים ופוסט-סינפטיים מדומים לספרייה שבה יישמר הניסוי הבא על ידי הקלדת פקודה זו בשורת הפקודה של המעטפת. במקום לפעול על בקרות חומרה קונבנציונליות של המגבר. כדי ליישם איזון גשר וקיזוז קיבול, הערך את גרעין האלקטרודה הדרוש לביצוע פיצוי האלקטרודה הפעילה על ידי הוצאת פקודה זו.

הגרעין המלא הוא סכום של שני מרכיבים, גרעין אלקטרודה מהיר, וגרעין ממברנה איטי יותר המוליד את הזנב המעריכי שנצפה בגרעין המלא. הראשון מהווה מודל לא פרמטרי של הפיפטה עם הזרקת זרם להפרדת גרעיני ממברנה ואלקטרודה, פקודת ליבת LCG תנחה את המשתמש למספר הנקודות המרכיבות את גרעין האלקטרודה המהיר. לאחר מכן, בחר מספר כך שגרעין האלקטרודה יכסה את קצה זנב הדעיכה המעריכית.

לאחר מכן בצע את ניסוי המהדק הדינמי באמצעות פקודה זו. לבסוף, דמיין את התוצאות. הנה בילוי של פעילות דמוית in vivo באמצעות מהדק דינמי.

עקבות אדומים וכחולים מייצגים סימולציה של סינפסות מעוררות ומעכבות בהתאמה. והנה עקבות המתח שתועדו מנוירון פרמטאלי L 5, שהיה נתון להפצצה של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים או מעכבים. הזרם המעורר, המעכב והזרם הכולל המתאים המוזרק לתא מוצגים בתרשים.

תרשים הרסטר של הקוצים שנוצרו ב-20 ניסויים מראה כי הנוירון יכול להיות אמין ומדויק ביותר בתגובה לאותו קלט. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע ניסויי מנורות דינמיות באמצעות ארגז הכלים של התוכנה הזמין בחינם. LCG. ניתן להרחיב הליך זה לפרוטוקולי לולאה סגורה אחרים כדי לחקור מגוון רחב של נושאים החל מריגוש עצבי ועד אינטראקציות רשת מורכבות.