אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבצע dynamic clamp במקום (in vitro) בנוירונים קורטיקליים באמצעות ארגז הכלים של התוכנה החופשית LCG. זאת מושג על ידי הכנת פרוסות של קורטקס סומטוסנסורי של חולדה להקלטות patch clamp מתאי parametal. כשלב שני, סדרה של פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיים אוטומטיים מיושמת על התא המוקלט, מה שמעניק אפיון סטנדרטי של התא אשר יהיה שימושי לניתוחים ולהשוואות עוקבות בין סוגי תאים.

בשלב הבא, מודמים הזרקות של אירועים סינפטיים מעוררים ומעכבים. כדי לשחזר את מצב המוליכות הגבוהה שחווים נוירונים ניאו-קורטיקליים in vivo, התוצאות מראות כיצד הזרקה סינפטית של רקע מושפעת מההגבר של התאים הקורטיקליים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא האפשרות להטמיע הקלטות ניסיוניות בתוך תהליכי עבודה מורכבים יותר, באמצעות שימוש, למשל, בתוצאה של פרוטוקול ניסיוני אחד כקלט לפרוטוקול אחר.

שיטה זו יכולה לסייע בסטנדרטיזציה של פרוטוקולים אלקטרו-פיזיולוגיים, להאיץ את ניתוח הנתונים ולסלול את הדרך לשיתוף נתונים בין מעבדות. למרות ששיטה זו פותחה במקור להקלטות patch-clamp wholesale in vitro, ניתן להשתמש בה בנוחות גם עבור הכנות ופרוטוקולים ניסויים אחרים, כגון patch-clamp in vivo, הקלטות CLA, או הקלטות עם מערכי מיקרו-אלקטרודות. לאחר הוצאת מוח החולדה, השליכו את הדגיאה והפרידו בין שתי ההמיספרות לאורך קו האמצע באמצעות סקלפל, הסירו נוזלים עודפים מאחת ההמיספרות והדביקו אותה על פלטפורמה נטויה באמצעות טיפה של דבק מהיר.

לאחר מכן, הוסיפו במהירות מספר טיפות של CSF על המוח והעבירו אותו לתא ה-Vibram. הסירו בעזרת להב את 2.5 עד שלושת המילימטרים הראשונים של רקמת המוח. לאחר מכן, כווןו את מהירות ותדירות החיתוך כדי להגביל את הנזק לפני השטח של הפרוסה.

בשלב הבא, הגדירו את העובי ל-300 micrometers והתחילו בחיתוך. לאחר שהלהב חלף את הקורטקס, השתמשו בתער או במחט כפופה כדי לבצע חיתוך מעל ההיפוקמפוס ובקצות האזור הקורטיקלי המבוקש. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות לתא דגירה בעל מספר בארות בטמפרטורה של 36 degrees Celsius.

בנוהל זה, מקם פרוסה בתא ההקלטה עם עדשה בהגדלה של 40x. חפש תאים בריאים בשכבה חמישה ובמרחק של 600 עד 1000 מיקרומטרים מתחת לפני השטח של המוח; תאים אלו מתאפיינים בדרך כלל בניגודיות נמוכה יותר, במראה חלק ואינם נפוחים.

לאחר מציאת תא בריא, מלא שליש מהמיקרו-פיפט במ 용ממס לתוך התא. לאחר מכן, מקם אותו ביחידת הראש במערכת ההפעלה Linux שהוגדרה מראש. הפעל פקודה.

המעטפת (Shell) תוסיף את סימן ההזנה שלה. הקלידו פקודה זו כדי לוודא שכרטיס רכישת הנתונים אינו מפעיל את המגבר. לאחר מכן, גרמו ללחץ חיובי של 30 עד 50 millibars על ידי לחיצה על בוכנת המזרק, המחוברת למחזיק הפ pipette.

בשלב הבא, מקמו את הפפטה בגובה של כ-100 micrometers מעל לפרוסה והזיזו אותה לעבר תא המטרה באמצעות מצב הגישה (approach mode) של המיקרו-מניפולטור. לאחר מכן, כווןנו את היסט הפפטה (pipette offset) במגבר האלקטרופיזיולוגי והוציאו פולס בדיקה של 10 millivolt במצב clamp voltage. השתמשו בפקודה LCG SEAL לבדיקת התנגדות הפפטה, ולאחר מכן הפחיתו את הלחץ ל-10 עד 30 millibars על ידי נסיגת בוכנת המזרק.

התקרבו בעדינות לתא ובדקו אם נוצר שקע (dimple) באמצעות צפייה בתמונה על מסך מצלמת הווידאו. במקביל, עקבו אחר עלייה בהתנגדות שמעוררת פולס הבדיקה על ידי צפייה בצורת גל הזרם המוצגת על המסך. כאשר חלה עלייה בהתנגדות הפ pipette ונוצר שקע על התא, שחררו מיד את הלחץ והפעילו לחץ שלילי עדין על ה-pipette כדי לסייע ביצירת האיטום.

בינתיים, הנמיקו בהדרגה את פוטנציאל ההחזקה למינוס 70 מילי-וולט. השתמשו ביניקה עדינה כדי לקרוע את ממבנה העטוף של התא ולהגיע לתצורת התא השלם. לאחר מכן, אפינו את התא על פי תכוניו החשמליים.

שימוש בקוד LCGE. זהו פוטנציאל הפעולה הממוצע של נוירון פרמיאל בשכבה חמישית עם סף של 50.5- millivolts. איור זה מציג את המדידה של תגובות פסיביות לזרמים היפר-פולריים.

זיהוי התכונות הפעילות הבסיסיות של התא מגלה כי התא הוא נוירון בעל פריקה סדירה (regular spiking neuron), וכי קיימת הסתגלות מינימלית להזרקת פוטנציאליים פוסט-סינפטיים מעוררים מדומים; שנה את הספריה שבה יישמר הניסוי הבא על ידי הקלדת פקודה זו בממשק השורה של המעטפת (shell). במקום להשתמש בבקרים הפיזיים הרגילים של המגבר, כדי לבצע איזון גשר (bridge balancing) ופיצוי קיבול (capacitance compensation), העरक את גרעין האלקטרודה הדרוש לביצוע הפיצוי האקטיבי של האלקטרודה באמצעות הרצת פקודה זו.

הגרעין המלא הוא סכום של שני רכיבים: גרעין אלקטרודה מהיר, וגרעין ממברנה איטי יותר הגורם לזנב המעריכי הנצפה בגרעין המלא. הראשון מהווה מודל לא-פרמטרי של הפיפטה. בעת הזרקת זרם להפרדה בין גרעיני הממברנה והאלקטרודה, פקודת ה-LCG kernel תבקש מהמשתמש את מספר הנקודות המרכיבות את גרעין האלקטרודה המהיר. לאחר מכן, בחר מספר כך שגרעין האלקטרודה יכסה את סוף זנב הדעי המעריכי.

לאחר מכן, בצע את ניסוי ה-dynamic clamp באמצעות פקודה זו. לבסוף, בצע ויזואליזציה של התוצאות. להלן שחזור של פעילות דמוית in vivo באמצעות dynamic clamp.

קוים אדומים וכחולים מייצגים את הסימולציה של סינפסות מעוררות ומעכבות בהתאמה. וכאן מוצגים רשומות מתח שהוקלטו מנוירון פירמידלי בשכבה 5 (L5), שהוכפח בהפצצה של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים או מעכבים. הזרמים המעוררים, המעכבים והזרם הכולל הפ corresponding שהוזרקו לתא מוצגים בתרשים.

תרשים הראסטר (raster plot) של הפריקות (spikes) שנוצרו לאורך 20 ניסויים מראה כי הנוירון יכול להיות אמין ומדויק ביותר בתגובה לאותו קלט. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של אופן ביצוע ניסויי מנורה דינמיים באמצעות מארז התוכנה הזמין בחינם LCG. ניתן להרחיב פרוצדורה זו לפרוטוקולים אחרים של לולאה סגורה כדי לחקור מגוון רחב של נושאים, החל מעירור עצבי ועד לאינטראקציות רשת מורכבות.