חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא לבחון את ההתפשטות והרעילות המורכבת של חלבונים דמויי PreOn באמצעות אורגניזם מודל Metazoan C elegance. זה מושג על ידי ניטור ההובלה התוך-תאית והתוך-תאית של שלפוחיות המכילות חלבון דמוי PreOn, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן-lapse. לאחר מכן חיישני קיפול ספציפיים לרקמות ומתח מבוטא בכל מקום.

מדווחים משמשים להערכת השפעות אוטונומיות של תאים ולא תאים אוטונומיים על הכושר התאי. לאחר מכן מבוצע מסך RNAi בכל הגנום על מנת לזהות משנים חדשים של רעילות הנגרמת על ידי PreOn. המסך מבוצע בתרבית נוזלית באמצעות חבטה כקריאה לרעילות.

לבסוף, גשש תולעת, תוסף לתמונה J משמש לכימות תנועה של אלגנטיות C בשילוב. שיטות אלה מאפשרות להפריד בין מסלולים גנטיים המעורבים בתנועה הבין-תאית של חלבונים דמויי PreOn והרעילות האוטונומית שלהם שאינה תאית. לאחר הכנת בקרת אלגנטיות ים מסונכרנת וקווים טרנסגניים בתחום PreOn ורפידות אגרוס של 10%, על פי פרוטוקול הטקסט הנלווה, פיפטה שלושה מיקרוליטרים של 100 ננוגרם חרוזי פוליסטירן ושלושה מיקרוליטרים של ארבעה לימסול מילימולר לתוך כרית האגרוס.

בעזרת חוט פלטינה מעבירים תולעים בגיל הרצוי מצלחת לתמיסה ומשתמשים בכיסוי כדי לכסות כדי לדמות את התולעים ברמה התת-תאית. הנח שקופית לתוך מחזיק שקופיות המיקרוסקופ של מיקרוסקופ קונפוקלי והשתמש במטרת שמן 63 x או 100 x 1.4 NA. לאחר מכן, פתח את METAMORPH ובחר רכישה רב-ממדית.

ותחת הכרטיסייה הראשית, סמן את התיבות עבור טיים לאפס והפעל יומנים. תחת לשונית השמירה, בחר או צור את תיקיית הספרייה לשמירת files והקצה שם לקובץ תחת לשונית אורך הגל, השתמש באדום Yoko מרובע או בתאורה מקבילה של הדמיית MRFP והתאם את החשיפה בין 100 ל-300 אלפיות השנייה ואת רווח המצלמה בין 100 ל-300. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה Time lapse, הגדר את מרווח הזמן לשנייה אחת, משך הזמן לחמש דקות ואת מספר נקודות הזמן ל-301.

תחת הכרטיסייה יומנים. עבור יומן בחר ערכת FC, החזקת Z ו- A FC חוזרים לחסימת Z עבור סוג בחר מיוחד פעמיים ועבור נקודה התחלתית, בחר נקודת התחלה ונקודת זמן של סוף בסיום ההגדרה, לחץ על רכישה בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו יישומי מעקב אחר חלקיקים על מנת למדוד את המאפיינים הדינמיים של discus.

לאחר סנכרון טרנסגני של תחום פריון ותוך כדי סוג נמטודות והעתקת לוחות ספריית ה-RNAI של אינגר בהתאם לפרוטוקול הטקסט, דגרו לוחות RNAi משוכפלים ב-37 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד כדי להשתמש בחיידק HT אחד 15 E coli המכיל את הווקטור הריק L 4 4 4 0 כבקרה. גדלו אותו בנפרד בצינור תרבית ואז השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להעביר 65 מיקרוליטר מהתרבות לרבע הבארות של 2 96. ובכן חולקו צלחות עם תחנת עבודה אוטומטית המכילה ראש רב ערוצי.

10 מיקרוליטר של חמישה, מילימולר של IPTG מדולל לכל באר של חיידקי ה-RNAi ולוחות הבקרה. אטמו אותם מחדש לפני הדגירה למשך שלוש שעות בזמן שהחיידקים דוגרים. מערבבים היטב בקרה מסונכרנת מסוג בר ובאר חיץ L אחת ו-M תשע ו-M 9 ופיפטה חמישה עד 10 מיקרוליטר על מיקרוסקופ זכוכית.

ספרו את התולעים וחישבו את מספר התולעים למיקרוליטר. לאחר שלוש שעות הדגירה של החיידקים, הוציאו את הצלחות מהחממה ואפשרו להן להגיע לטמפרטורת החדר כדי למנוע לחץ חום על התולעים. לאחר מכן, השלם את מאגר M nine עם כולסטרול IPTG ואנטיביוטיקה בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

והוסף את הנפח המתאים של תמיסת תולעת טרנסגנית בתחום PreOn לריכוז סופי של 15 תולעים לתערובת מיקרוליטר לפיזור שווה. לאחר מכן הוצא 50 מיקרוליטר לכל באר של לוחות ה-RNAi והבארות של אחת מלוחות הבקרה הווקטוריים הריקות. יש להוציא תמיסת תולעים מסוג בר לתוך לוחית הבקרה השנייה.

לאחר מכן השאירו את כל הצלחות לא אטומות כדי לאפשר אוורור ולמנוע מהתרבית הנוזלית להתאדות על ידי ערימת ארבע עד חמש צלחות יחד, עטיפתן במגבת נייר לחה ואחריה נייר אלומיניום. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ו -200 סל"ד למשך ארבעה ימים. לצלחות, השתמש במצלמת Falcon four M 60 המחוברת למחשב עם צג כדי לסנן חזותית להגברת החבטות בהשוואה לבעלי חיים טרנסגניים בתחום PreOn שטופלו בביקורת.

היתרון העיקרי בשימוש בתחנת עבודה אוטומטית לטיפול בנוזלים כדי להוציא את התולעים לתוך לוחות R RNAi הוא שהוא מפחית מאוד את השונות ואת מספר התולעים לבאר. כדי לבצע בדיקת תנועתיות על צלחות מוצקות ולאמת שיבוטי RNAi מועמדים, מגדלים חיידקי RNAi בן לילה על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן השתמש ב-IPTG מילי-מולרי אחד כדי לגרום לביטוי של DS RNA למשך שלוש שעות.

השתמש ב-150 מיקרוליטר מכל שיבוט חיידקי RNAi כדי לזרוע לוחות NGM שהוכנו בעבר ומתפשטים לשכבה דקה. הניחו לחיידקים להתייבש במשך יומיים בטמפרטורת החדר בחושך תחת מיקרוסקופ סטריאו. קבע את כמות התולעים והתרחיף המסונכרנים כפי שתואר קודם לכן והוסף 25 עד 30 ליטר זחל אחד לכל צלחת ניסוי.

דגרו על הנמטודות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך ארבעה ימים עד שהתולעים מגיעות. היום השני לבגרות כדי לכמת את תנועתיות התולעים, הפעל את המצלמה ואת תוכנת ההדמיה הפשוטה PCI. לחץ על סמל המצלמה כדי לאפשר התאמה של תנאי ההדמיה.

לאחר מכן, הגדר את מצב ההדמיה באופן הבא. הגדר את הרווח למצב אור אפס לאינדקס מהירות גבוהה לאחד ול-binning לשתיים. לאחר מכן לחץ על חי וחשיפה אוטומטית והתאם את תנאי התאורה על ידי הזזת מראות המיקרוסקופ וחוגות הבהירות והניגודיות.

לחץ על זמן, סרוק והקלד תיקיה ושם קובץ הגדר את עיכוב השדה ל-20 אלפיות השנייה ועצור בכל פעם ל-30 שניות. לחץ על סקירה חיה על מנת לבחור את אזור הצלחת להקלטה. לאחר מכן הקש על הצלחת שלוש או ארבע פעמים על הבמה.

אשר במהירות את מיקומו בשדה הראייה ולחץ על התחל לאחר סיום הקלטת הסרט, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ובחר ייצוא רצף מונטאז' כדי לייצא את הסרט מפורמט CXD לקובץ A VI. כדי לנתח את סרטוני התנועתיות, פתח את תמונה J בחר בכרטיסייה תוספים, ולאחר מכן בחר Worm Tracker ובחר אצווה של Worm Tracker, ובחר את הספרייה המכילה את כל הקבצים שיש לנתח בחלון הקלט הראשי של אצווה Worm Tracker לטעון את ערכי הקלט כמפורט כאן. הסבר לכל אחד מהפרמטרים ניתן למצוא בהוראות הנלוות לתוסף.

לחץ על אישור ואפשר לניתוח התנועה לפעול. לבסוף, כדי לאצור את התוצאות, ודא שכל העקבות שזוהו הן מאלגנטיות ים אמיתית והסר חפצים. פתח את קבצי ה-TXT שנוצרו עבור כל סרט והעתק את המידע לקובץ תוכנה לניתוח נתונים.

פתח את קבצי ה- zip של התוויות שנוצרו והפעל את התוויות המתקבלות TIFF כדי לבדוק באופן ידני ולחסל עקבות תולעת כוזבות. יספר פיטרסון, פוסט-דוקטורנט לשעבר במעבדה, הגה לראשונה את הרעיון של עוקב התולעים כתחליף להערכה הידנית שלנו של מוטיל CL Elegance, שהוא קריאה לרעילות. עוקב התולעים מאפשר לנו לבצע את הניסויים הללו בצורה אוטומטית ללא הטיית משתמש תוך הערכת תנאים נוספים בפרק זמן קצר יותר באמצעות הדמיית זמן-lapse.

ה-RFP שתויג R two E two, המצטבר בשלפוחיות צינוריות נראה מועבר בתוך ובין תאים על ידי coex המבטא חיישן מתקפל או מדווח מתח. יחד עם תא חלבון דמוי PreOn, ניתן להעריך השפעות אוטונומיות ואוטונומיות שאינן תאיות. הביטוי של R שתיים E שתיים בתאי שריר מוביל להופעה מוקדמת יותר של צבירת Q 44 במעי ומגלה כי ל- R שתיים E שתיים יש השפעות אוטונומיות שאינן תאיות על ביטוי משותף של פרוטאוסטזיס של R שתיים E שתיים עם ה- SOD שלוש PGFP מדווח מתח חמצוני שעתוק מוביל לוויסות יתר של המדווח ברקמות שונות, מה שמדגים כי תחום ה-PreOn גורם לתגובת עקה חמצונית שאינה תאית באופן אוטונומי בעקבות כל מסך הגנום.

סרט זה מדגים כי הדמיה והדמיה ברזולוציה גבוהה על מסך המחשב מאפשרים הקרנה של רבע צלחת בו זמנית לאחר שליטה, ניתן לבצע את פרוטוקול ההקרנה ב-12 סבבים של 25 צלחות בכל מפגש. אם מבוצעים שני מפגשים בשבוע, ניתן לסנן את כל ספריית ה-RNAi תוך שישה שבועות. גשש התולעים שימש לכימות תנועתיות אלגנטית C כפי שניתן לראות כאן.

Worm Tracker ממיר סרטון מקורי לפורמט בינארי ולכל תולעת מוקצה רצועה. ניתן לצפות בסרטונים מעובדים עם רצועות על גבי רצועות כדי לחסל ידנית כל חפצים. פרמטר אורכי הגוף לשנייה מנרמל להבדלי גודל פוטנציאליים. נמטודות.

שיטה זו זיהתה 35 מדכאים של רעילות הנגרמת על ידי PreOn שהגדילו את פנוטיפ התנועתיות ל-133% לפחות ועד 256% בהשוואה לתולעים שטופלו בביקורת. בעת השכרת גשש התולעים, חשוב לזכור לאמת ידנית את עקבות התולעת להשגה. התוכנה עושה עבודה מצוינת בזיהוי התולעים, אך לפעמים עדיין ניתן לזהות בטעות את הרקע כבעל חיים.

לכן, זכור לבדוק את הסרטונים שלך לאחר הפעלת גשש תולעים עליהם. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחלות הנוירודגנרטיביות כגון האם חלבון קשר למחלה מסוים מסוגל להתפשט מתא לתא, או האם יש קשר בין ההעברה הבין-תאית לבין הרעילות המורכבת של חלבונים אלה. ילדים.