תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר שתי מערכות בדיקת רעילות התפתחותיות במבחנה המבוססות על תאי גזע עובריים אנושיים ומחקרי טרנסקריפטום. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של תאי גזע עובריים אנושיים על פיברובלסטים עובריים של עכברים. השלב השני הוא לאפשר לתאי הגזע העובריים האנושיים ליצור גופי אמברי שבהם הם יכולים ליצור תאים מכל שלוש שכבות הנבט או להבדיל אותם לאבות נוירואקטודרמליים.

לאחר מכן, גופי העובר או האבות הנוירו-אקטודרמליים מטופלים בתרכובות מעניינות בריכוזים שונים במהלך ההתמיינות. השלבים האחרונים הם להעריך את כדאיות התאים ולבודד את ה-RNA. בסופו של דבר נעשה שימוש בניתוח מיקרו-מערך טרנסקריפטום כדי להראות את השינויים בביטוי ה-RNA של תאים שטופלו בתרכובת מעניינת בהשוואה לתאי ביקורת לא מטופלים בהתבסס על תאי גזע ניאוניים אנושיים ואזורי מאקרו של DNA, הקמנו מתודולוגיה במבחנה המאפשרת ניטור השפעות רעילות התפתחותיות רלוונטיות לבני אדם.

המתודולוגיה יכולה להיות מיושמת על ידי תעשיית התרופות והכימיה לסינון בטיחות של תרופות פוטנציאליות וחומרים רעילים סביבתיים. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הרעילות ההתפתחותית, כגון השפעת כימיקלים על התפתחות נוירולוגית מוקדמת מאוד. כדי להתחיל, הפשירו את תוסף מדיום תאי הגזע בטמפרטורת החדר והוסיפו 100 מיליליטר ממנו ל-400 מיליליטר של מדיום תאי הגזע הבסיסיים.

לאחר מכן, הפשירו את מטריצת קרום המרתף על קרח, ואז הוסיפו את נפח המטריצה המשלים ל -24 מיליליטר של dmm צונן. מדיום בסיסי F 12 לפי המלצת היצרן, ערבב תמיסה על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה, ולאחר מכן הוסף שני מיליליטר מהתערובת ל -12 צלחות נפרדות של שישה סנטימטרים. דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך שעה בזמן שהמטריצה מצפה את הצלחות.

לאחר מכן הסר את המדיום והוסף שני מיליליטר של מדיום תאי גזע. לאחר מכן, הסר ארבע צלחות קונפלואנט מהחממה המכילה עובר אנושי. H תשעה תאים הגדלים על שכבות הזנה של פיברבסטים עובריים של עכברים המוכנים כמתואר בפרוטוקול הטקסט המלווה תחת סטריאוסקופ, משתמשים בקצה פיפטה של מיליליטר אחד ומסירים את המושבות המובחנות מהצלחת.

למושבות לא ממויינות יש גבולות מוגדרים היטב והתאים קומפקטיים, בעוד שתאים ממוינים מתחילים להתפשט החוצה מהגבולות והתאים שלהם גדולים יותר בגודלם. שאפו את המדיום ושטפו את התאים בארבעה מיליליטר PBS. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של מדיום תאי גזע עם שמונה של סטריאוסקופ.

חותכים את המושבות לשש עד תשע חתיכות כל אחת עם מחט בגודל 26 ומגרדים את הגושים בעזרת קצות פיפטה של מיליליטר אחד. אספו בעדינות את המושבות החתוכות בצינור בז של 50 מיליליטר וגלו אותן בחום של 200 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו את הסנאט והשעו מחדש את התאים ב-12 מיליליטר של מדיום תאי גזע.

הניחו 20 מיקרוליטר של מתלה התא על שקופית זכוכית וספרו את מספר הגושים מתחת למיקרוסקופ. התאם את ריכוז המתלה ל -150 גושים למיליליטר ולאחר מכן הוסף שני מיליליטר מהמתלה לכל צלחת של שישה סנטימטרים. הזיזו את הצלחות קדימה ואחורה ומצד לצד כדי לפזר את התאים באופן אחיד, ולאחר מכן דגרו את הצלחות בחממת תרבית תאים אחת ליומיים.

החלף בזהירות את המדיום לאחר הסרת המושבות המובחנות, הוסף 40 מיקרוליטר של תמיסת קופולימר בלוק סטרילית של 5% לכל באר של צלחת באר Vbo 96 ותן לה לדגור בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. הסר צלחת קונפלואנט המכילה מושבות מהחממה ובחר את כל המושבות המובחנות תחת מיקרוסקופ סטריאו עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר מכן שאפו את המדיום מהצלחת ושטפו בעדינות את התאים עם ארבעה מיליליטר PBS.

לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של מדיום בידול אקראי לכל צלחת. השתמש בכלי המעבר כדי לחתוך את מושבות תשעת התאים H בגושים בגודל אחיד. מגרדים את הגושים בעזרת מגרד תאים ואוספים אותם בעדינות לצנטריפוגה של צינור בז של 50 מיליליטר.

המושבה מתקבצת ב-200 גרם למשך חמש דקות ואז שואבת את הסנאט ומשהה מחדש את התא ואת מדיום ההתמיינות האקראית ב-1000 גושים למיליליטר. לאחר מכן, שאפו את קופולימר הבלוק מצלחת 96 הבאר התחתונה V בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 100 מיקרוליטר את תרחיף המושבה לכל באר צברו את הגושים לתחתית הבארות בצורת V על ידי צנטריפוגה של הצלחת בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות ב -400 גרם. הסר את גופי העוברים מצלחת 96 הבאר והנח אותם בצלחת סטרילית בגודל 122 מילימטר רבוע.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה סרולוגית סטרילית של 10 מיליליטר כדי להעביר את גופי העוברים מהצלחת המרובעת לצינור בז של 15 מיליליטר. הניחו לגופי העוברים להתיישב במשך שתי דקות ולאחר מכן שאפו את החטף ושטפו את גופי העובר בחמישה מיליליטר PBS. שוב, המתן עד שגופי העובר ישקעו במשך שתי דקות ואז שאפו את הסופרנטנט.

הפעם השעו מחדש את גופי העוברים בחמישה מיליליטר של מדיום התמיינות אקראי. לאחר מכן, העבירו את גופי העוברים לצלחת בקטריולוגית של 10 סנטימטר והוסיפו עוד 10 מיליליטר של התמיינות אקראית. בינוני. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 על שייקר אופקי.

ב-50 סל"ד, גופי העוברים המייצגים מוצגים ליום החמישי, היום התשיעי והיום ה-14. החלף בזהירות את המדיום כל יומיים, והחלף את כל 15 המיליליטר בבידול אקראי טרי. בינוני. כדי להעריך את השפעת התרופה על התמיינות, התחל להוסיף תרופה למדיום ביום החמישי למשך 10 ימים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה.

בעזרת פיפטה סטרילית, אספו את גופי העוברים מלוחות 10 סנטימטר לתוך צינור בז של 15 מיליליטר. הניחו להם להתיישב במשך שתי דקות, ואז שאפו את הסופרנטנט. שטפו אותם עם חמישה מיליליטר PBS והעבירו אותם לצינור 1.5 מיליליטר נטול נוקלאז.

אפשר להם להתיישב ולשאוף את העלאת הסנאטים. השעו את גופי העובר במיליליטר אחד של מגיב טריול והעבירו תמיסה דרך מחט בגודל 24 עם מזרק מיליליטר אחד כ-15 פעמים כדי לשבש את התאים. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר כלורופורם לכל דגימה.

מערבל את התוכן לזמן קצר, ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב-12,000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, אסוף את הסופרנטנט בצינורות של 1.5 מיליליטר מבלי להפריע לאף אחת מהשכבות האחרות. לאחר מכן הוסיפו נפח שווה של אתנול צונן של 70% לסופרנטנט וערבבו בעדינות את התכולה על ידי ניעור. העבירו 700 מיקרוליטר מהתערובת לעמודת סיבוב מיני ופעל לפי הוראות היצרן לטיהור ה-RNA בשלב הפליטה הסופי.

מרחו 22 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז על עמוד הסיבוב וצנטריפוגה את הצינורות ב-12,000 גרם למשך דקה אחת. לאחר מכן הסר את צינור האיסוף והניח את ה- RNA על קרח. הוסף מיליליטר אחד של שטח דיסק חם מראש לכל בקבוק T 25 של תשעה תאי H, ודגירה על הבקבוק למשך תשע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

ואז להוסיף שני מיליליטר של חום מראש. שטפו את המדיום לתאים המטופלים שנעקרו והעבירו בעדינות למעלה ולמטה חמש פעמים עם פיפטה של חמישה מיליליטר. העבירו את תמיסת התא לצינור בז.

לאחר מכן, שטפו את הבקבוק עם תשעה מיליליטר של מדיום כביסה והוסיפו אותו לצינור עם התאים. PT את הקציר את התאים שלו במשך שלוש וחצי דקות ב 500 גרם.ואז הסר את החטיפה והשהה מחדש את התאים ב -10 מיליליטר של מדיום כביסה. יש לטפט את התאים שוב למשך שלוש וחצי דקות ב-500 גרם ואז להסיר את ה-sup natant ולהשעות מחדש את התאים בארבעה מיליליטר של מדיום תאי גזע עובריים אנושיים, להוסיף 0.5 מיליליטר של תרחיף התאים ו-4.5 מיליליטר של מדיום טרי לבקבוק PBS T 25 טרי המכיל פיברובלסטים עובריים של עכברים מומתים מיטוטית.

החלף את המדיום בבקבוק כל יום. מצפים צלחת של 10 ס"מ עם 0.1% ג'לטין ב-PBS ודוגרים במשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן קצרו תאי גזע עובריים אנושיים על ידי הסרת המדיום והוסיפו מיליליטר אחד של אקוטה לבקבוק T 25 בזמן שהתאים מתנתקים.

הוסף 6.6 מיליליטר של מדיה קרה ל -330 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף קפואה. סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר והשתמש במיליליטר אחד של התמיסה המסוננת כדי לכסות כל באר של צלחת שש בארות. התאים יצופו מאוחר יותר על הלוחות המצופים לאחר הדגירה של 30 דקות של התאים העובריים האנושיים עם אקוטן, יעצרו את התגובה על ידי הוספת 1.5 מיליליטר של מדיום הס.

מגרדים את התאים מהבקבוק ואז מוסיפים עוד שמונה מיליליטר של מדיום הס. לייצר תמיסת תא בודד על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה עם תאי סינון פיפטה של 10 מיליליטר דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן צנטריפוגה של התאים למשך שלוש דקות ב-500 גרם, הסר את הסופרנטנט S והשהה מחדש את התאים ב-10 מיליליטר של תאי ספין בינוני שוב למשך שלוש דקות ב-500 גרם. השעו את התאים ב -10 מיליליטר של מדיום Hess S המכיל מעכב סלע Y 2 7 6 3 2 בריכוז סופי של 10 מיקרומולר.

לאחר מכן, הוציאו את הסופרנטנט מצלחת הכלים המצופה ג'לטין, את תרחיף התאים על הצלחת המצופה ג'לטין ודגרו במשך שעה בדיוק בחום של 37 מעלות צלזיוס. במהלך שלבים אלה, ההיפופלסט יתיישב על הלוחות המצופים בג'לטין שם תאי הגזע העובריים האנושיים יישארו חופשיים. זמן הציפה הוא קריטי שכן דגירה ארוכה תגרום לגושים של תאי הגזע ודגירה קצרה תסיר רק כמה מהפיברובלסטים הללו כאשר הפיברובלסטים נצמדים.

השתמש במדיום בצלחת כדי לשטוף בעדינות את תאי הגזע שאינם נדבקים מהצלחת. שטפו את הצלחת פעם שנייה עם 10 מיליליטר של מדיום הס ואגד את התאים, צנטריפוגה את התאים למשך שלוש דקות ב-500 גרם, הסר את הסופרנטנט S שנוצר והשהה מחדש את התאים בכארבעה מיליליטר של מדיום מותנה המכיל 10 מיקרו-מולרי של מעכב סלע Y 2, 7, 6, 3, 2 ו-10 ננוגרם למיליליטר של גורם גדילה פיברבלסט שתיים. לאחר מכן, ערבבו את התאים עם טריאן כחול וספרו אותם בצלחת ציטומטר המו.

18,000 תאים לסנטימטר רבוע על הצלחת לפני המרתף. צלחות מצופות קרום מכסות את התאים ב -1.5 מיליליטר מדיום לבאר ודוגרות ב -37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות, רענן את המדיום לאחר 24 שעות נוספות, שנה את המדיום למדיום המותנה הטרי בתוספת 10 ננוגרם בלבד למיליליטר של גורם גדילה פיברובלסטים 2 72 שעות.

לאחר זריעת התאים, שנה את המדיום למדיום החלפת סרום. נקודת זמן זו מכונה יום האפס של הבידול. רענן את התאים במדיום טרי בכל יום במשך שלושת הימים הבאים.

כאשר מחליפים את המדיה ביום הרביעי והחמישי, יש להוסיף תחליף סרום המורכב מ-25%N שני מדיום מוסף ו-75% החלפת סרום נוק-אאוט. בינוני ביום השישי קוצר את התאים לניתוח. גופי העוברים יכולים לשמש למחקרים רבים ושונים.

להלן דוגמה למחקר ציטוטוקסיות המראה את ההשפעה של ריכוזים משתנים של מתיל כספית על כדאיות התאים. מגרף זה נקבע כי נקודה 24 מיקרומולר גרמה ל-10% מוות תאים וריכוז של 1.61 מיקרומולר גרם ל-50% מוות תאים לאחר חשיפה למשך 14 יום. RNA שבודדו מגופי עוברים של שלוש קבוצות טיפול במתיל כספית הופעלו על מיקרו-מערך כדי לבחון מגוון רחב של סמנים ביולוגיים.

אלה שנחשפו לכספית מיקרו-מולרית בנקודה 25 מוצגים באדום. אלה שנחשפו למתיל כספית מיקרו-מולרי אחד מוצגים בכחול, וה-RNA הבקרה מוצג בירוק. מפת ניתוח מרכיבי עיקרון זו מראה כי המאפיינים הגנטיים של כל קבוצת טיפול שונים באופן משמעותי מהאחרת בסך הכל יותר מ-276 גנים שונו יותר מפי שניים כאשר נחשפו לריכוז מיקרו-מולרי אחד של מתיל כספית.

30 מהגנים הללו שונו גם על ידי קבוצת הריכוז הנמוך יותר בנקודה 25 מיקרומולרית. במפת חום זו, ניתן לראות ש-233 מהגנים ששונו בקבוצת הטיפול המיקרו-מולרית האחת היו גנים שעברו ויסות נמוך ורק 43 היו מווסתים על ידי הטיפול. אל תשכח שעבודה עם טריאזול או נמלים התפתחותיות עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לשקול תמיד אמצעי זהירות כגון חבישת משקפי ספיטי, כפפות ידיים עמידות לכימיקלים וביצוע כל העבודות הקשורות לטריול במכסה אדים בעת ביצוע הליך זה.

בצע הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעה, היווצרות פרוס, שעלולות לערבב את היווצרות הצינור שלך על מנת לענות על שאלות נוספות כמו עיגון פנוטיפי.