Name: מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב Saccharomyces cerevisiae (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: חקור אינטראקציות גנטיות כימיות ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות זיהוי מוטנטים רגישים לכימיקלים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לגלות תהליכים ביולוגיים וגנים חיוניים לסבילות כימית ביעילות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר במעבדה CJN נתמך על ידי מענקים הפועלים מNSERC, הקנדי למלחמה בסרטן אגודת מכון המחקר (CCSRI), והשד הקנדי קרן למלחמה בסרטן (BC-יוקון סניף).

הערה: העבודה הכללית של הליך זה מתואר באיור 2. 1. קביעת מינון צמיחה-מעכבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של תרבות לילה שמרים הערה: תקשורת שמרים-תמצית-peptone דקסטרוז הצמיחה (YEPD) שימוש בפרוטוקול זה היא מתכון סטנדרטי 13. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את BY4741 (his3 מאטה Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) תאים על צלחת אגר YEPD דגירה במשך 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס או עד מושבות גלויות טופס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבויות לילה בלחסן 5 מיליליטר של נוזל תקשורת YEPD בכלי תרבות סטרילי עם מושבה אחת. דגירה הלילה בשעה 30 ° C עם סיבוב רציף או רועד. התרבות בדרך כלל תגיע לרוויה בבוקר (~ 2 × 10 8 תאים / מיליליטר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדיה אגר מוצקה המכילים מינונים שונים כימיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמה מניות שלהכימי להיבדק ב100x ריכוז סופי רצוי בממס מתאים. הערה: ריכוזים אפקטיביים יהיו תלויים בחומר הכימי, ויש לקבוע באופן אמפירי. אי לכך, מומלץ תחילה לבחון מגוון רחב ריכוז סופי, כלומר, ממיקרומטר הנמוך לגבוה מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ריכוז של חומר כימי להיבדק, aliquot 3 מיליליטר של אגר YEPD המותך לכמה צינור תרבות סטרילי. מקום באמבט המים C ° 55 כדי לשמור לחיזוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ריכוז של חומר כימי להיבדק להוסיף 30 μl של מתחם 100x לתקשורת מותכת, מערבולת 2-3 שניות כדי לערבב, ופיפטה 1 מיליליטר לכל זוג של בארות כפולות בצלחת 12 גם. הקפד לכלול רכב רק שליטה. לאפשר צלחות להגדיר לילה בטמפרטורת חדר. לבטל את כל אמצעי תקשורת נוספת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי התפשטות ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מיליליטר של נוזל תקשורת YEPD עם 2 μl של תרבית שמרים רוויה, גדל הלילה כמו בשלב 1.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 25 μl של תרבית שמרים מדוללת היטב, להתפשט באופן שווה באמצעות חרוזים זכוכית סטרילית או מוט, ולאפשר את הצלחת לייבוש תחת אש. דגירה צלחת ב 30 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הצמיחה של שמרים (גם מספר והגודל כולל של מושבות) על הצלחות. בחר ריכוז תת-קטלני של מתחם שלא לעכב את הצמיחה על ידי יותר מ 10% -15% כדי לבצע את המסך. </li></ol></li></ol> 2. מסך כימי גנטי שיטתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזוקה של מחיקת מוטנטי-מערך (DMA) והכנה של צלחת המקור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיאור מפורט על בניית מערכי מוטציה מחיקה ממניות גליצרול עיין et al Baryshnikova. 14. ברגע שמוטציות מחיקה כבר ערוכות בצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת, DMA יכול להיות מאוחסן במשך כמה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. לשכפל על אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418 כנדרש כדי למנוע ממושבות גדלו לתוך כלאחר. יש להימנע משוכפלים סידוריים מרובה על מנת למנוע אובדן של זנים גדלו איטיים ולצמצם את המראה של מוטציות מדכאת: הערה. זה רלוונטי במיוחד אם שמירת האוספים כhaploids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את כל שלבי העתק-הציפוי באמצעות חיידקים עֲרִיכָה מערכת רובוטית. לחלופין, לתפעל ערוך מושבות באמצעות כלים pinning ידניים. הערה: אוסף שמרי המחיקה זמין כhaploids וdiploids ממספר מקורות מסחריים ונשלח בדרך כלל כמניות גליצרול ב96-גם צלחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיבוי מערך המוטציה המחיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 250 מיליליטר של תקשורת אגר YEPD המכילה 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418. הריכוז היעיל של G418 עשוי להשתנות וכל מגרש יש לבדוק באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חמש צלחות אגר YEPD על ידי שפיכת 50 מיליליטר של אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418 לכל צלחת. האם יום אחד זה לפני עיבוי המערך ולאפשר הצלחות להתקרר בטמפ &#39;החדרerature לילה על אף משטח שטוח. הערה: ארבע צלחות תידרש לאיסוף בצפיפות 1,536 מתח, הצלחת החמישית היא שפך כתוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את 16 צלחות פטרי המכילות את אוסף מחיקת המוטציה בצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת ולאפשר להגיע לטמפרטורת חדר (~ 1 שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב כל עיבוי שנוצר על המכסה של כל צלחת באמצעות משימה עדינה לנגב. אם לא יעשה זאת עלולה לגרום לטיפי מים שהופקדו על המערך וזיהום צולב של מוטנטים ערוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רובוט מערך תולה חיידקים, להתעבות DMA מצפיפות של 384 מושבות בכל צלחת (16 צלחות פטרי) ל1,536 מושבות בכל צלחת (4 צלחות פטרי). לבצע את זה כדי שמושבת -1 מפינים 1 הצלחת לחתור עמודה 1 1 של מערך תמצית, המושבה -1 בצלחת 2 לחתור 1 טור 2, המושבה -1 בצלחת 3 לחתור 2 ועמודה 1, ו המושבה -1 בצלחת 4 לחתור 2עמודה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המערך המאוחד על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את המערך כדי להבטיח העברה אחידה של מושבות מצלחות מקור. תהיה כמה עמדות ריקות, שהתאגדו בכוונה תחילה את המערך, המשמשים כמדריך כדי להבטיח את DMA כבר מרוכז בצורה נכונה (איור 4 א). הערה: אלה יהיו צלחות המקור לציפוי העתק על גבי מדיה המכילה את תרכובת המבחן. צלחת מקור יחידה יכולה לשמש לpinnings מרובה. גם רובוטים רבים יהיו תכונת קיזוז, אשר תבטיח מספרים דומים של שמרים מועברים בכל פעם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך מוטציה מחיקת צלחת Replica <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 700 מיליליטר של שליטה (רכב בלבד) ו -700 מיליליטר של תקשורת הניסיונית (המכיל כימית). זה מספיק לביצוע assay בשלושה עותקים (12 צלחות לכל מצב, בתוספת שתי תוספות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50 מיליליטר של אגר YEPD מכיל כימי מבחן או שליטה לכל צלחת. לאפשר t הצלחותo להתקרר בטמפרטורת חדר למשך לילה על אף משטח שטוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ברובוט לצלחת העתק, לחסן DMA על שלושה סטים של צלחות המכילות כימיקלים בריכוז בניסוי הנחוש, כמו גם שלושה סטים של צלחות המכילות שליטה ברכב. דגירה צלחות בטמפרטורת חדר למשך 24-48 שעות. </li></ol></li></ol> 3. צלחות הדמיה וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות מהחממה ולאפשר להם להגיע לטמפרטורת חדר (~ שעה 1) לפני ההדמיה. זה ימנע עיבוי מ טביעה בזמן ההדמיה הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות תמונה ב 24 ו 48 שעות על ידי הסרת המכסה והצבה עם פנים כלפי מטה על סורק למיטה שטוח. צלם תמונות ברזולוציה של לפחות 300 dpi. לחלופין, להשתמש במצלמה דיגיטלית כדי ללכוד תמונות. אם כך צלחות מקום, עם הפנים כלפי מעלה על רקע כהה ולהסיר את המכסים לתמונה. הערה: תבנית הקובץ והמיקום של צלחות תהיה תלויה בתכנית הכימות בשימוש. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות והשוואה של גדלי מושבה מערך באמצעות אחד מכמה תוכנות קוד פתוחות, כוללים 15 &quot;שטויות, SGAtools 16, וScreenMill 17. </li></ol> 4. אישור של מסך הערה: בשלב זה מוטציות כמה מחיקות שמרים את הציון רגישה כמו לכימי של עניין. אינטראקציות כימיות-גנטי אלה חייבים להיות מאומתים הבאות בשתי דרכים. ראשית את זהותו של זנים רגישים צריכה להיות מאושרת על ידי PCR. שנית, רגישות כימית חייבת להיות הבקיע באופן עצמאי. המפורטים להלן הוא פרוטוקול קצר לביצוע מבחני איתור כדי לאמת את רגישות יתר לחץ, טכניקה נפוצה בשמרי ביולוגיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak את מוטציות רצויה (רגישות יתר) מאוסף מחיקת השמרים על אגר YEPD המכיל 200 מיקרוגרם / מיליליטר של G418. לדגור על 30 מעלות צלזיוס עד טופס מושבות. ודא גנוטיפ של המתח על ידי PCR עם פריימרים אבחון על פיהפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של נוזל YEPD עבור כל זן ודגירת הלילה בשעה 30 ° C עם רוטציה או רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד OD 600 ולדלל כל זן לOD 600 = 1 בסטרילי DH 2 O. אלה נמצאים כעת תרביות שמרים מנורמלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על שמרים מנורמלים wild-type (BY4741) תרבות 100 μl ולA1 של צלחת 96-היטב. לוותר של עד שבעה זנים נוספים 100 μl לבארות B1-H1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipettor רב-ערוצי לוותר 90 μl של סטרילי DH 2 O לבארות A2-H2 דרך A6-H6. לבסוף, להכין סדרה של דילולים 1:10 תרבויות שמרים מנורמלות. התחל על ידי סדרתי pipetting 10 μl של עמודת 1 לעמודה 2 עם pipettor רבי ערוצים, ותמשיך על פני הצלחת 96-היטב עד שישה דילולים נעשים (כלומר, 10 0-10 -5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 2-5 μl של תרבויות שמרים מדוללים ברשת באמצעות רב-ערוציpipettor על גבי מדיה מוצקה YEPD מכילה שליטה כימית ורכב. דגירה צלחות בטמפרטורה המתאימה ל24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחות ולהשוות את הרגישות של מוטציות בחרו לכימי (יחסית לBY4741 שליטה). צלחות תמונה ב 24 ו -48 שעות כמו בשלב 3.2. הערה: בעוד שזיהוי של מספר זנים רגישים עם אונטולוגיות גן קשור או פונקציות מעניק ביטחון לתוקף של המסך, הפיכתו של זן מחיקה רגיש עם פלסמיד המכיל עותק wild-type של הגן נדרש לקבוע רשמית כי גן מחיקה של עניין (ומוטציות אתר השניה לא מוסתרות) גורם לרגישות לסמים. </li></ol>

<ol><li>Giaever, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+profiling+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome.</a> Nature. 418, 387-391 (2002).</li>
<li>Winzeler, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+S.+cerevisiae+genome+by+gene+deletion+and+parallel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5, 711-718 (2008).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+exploration+of+essential+yeast+gene+function+with+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants.</a> Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Parsons, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+mode-of-action+of+bioactive+compounds+by+chemical-genetic+profiling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast.</a> Cell. 126, 611-625 (2006).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+genome-wide+fitness+data+in+yeast+reveals+novel+gene+function+and+drug+action%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action.</a> Genome Biol. 11, R30(2010).</li>
<li>Smith, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+genomic+screens+of+barcoded+yeast+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+identification+of+the+biochemical+targets+of+polyalkyl+guanidinium+biocides%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+%26+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides.</a> Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).</li>
<li>Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical-genetic+profile+analysis+of+five+inhibitory+compounds+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast.</a> BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).</li>
<li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory.+Methods+In+Yeast+Genetics%3A+A+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+Course+Manual%22">Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).</li>
<li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+%28SGA%29+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).</li>
<li>Young, B. P., Loewen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balony%3A+a+software+package+for+analysis+of+data+generated+by+synthetic+genetic+array+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments.</a> BMC Bioinformatics. 14, 354(2013).</li>
<li>Wagih, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SGAtools%3A+one-stop+analysis+and+visualization+of+array-based+genetic+interaction+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens.</a> Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).</li>
<li>Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScreenMill%3A+a+freely+available+software+suite+for+growth+measurement%2C+analysis+and+visualization+of+high-throughput+screen+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 353(2010).</li>
<li>Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil%3A+mechanisms+of+action+and+clinical+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies.</a> Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).</li>
<li>Lum, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+modes+of+action+for+therapeutic+compounds+using+a+genome-wide+screen+of+yeast+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes.</a> Cell. 116, 121-137 (2004).</li>
<li>Toussaint, M., Conconi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+and+sensitive+assay+to+measure+yeast+cell+growth%3A+a+bench+protocol+for+testing+genotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents.</a> Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).</li>
<li>Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunSpec%3A+a+web-based+cluster+interpreter+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast.</a> BMC Bioinformatics. 3, 35(2002).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).</li>
<li>Hong, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Ontology+annotations+at+SGD%3A+new+data+sources+and+annotation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods.</a> Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).</li>
<li>Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-fluorouracil+enhances+exosome-dependent+accumulation+of+polyadenylated+rRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs.</a> Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol Syst Biol. 2, 0008(2006).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+landscape+of+a+bacterial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic landscape of a bacterial cell.</a> Cell. 144, 143-156 (2011).</li>
<li>Dai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nucleosome+function%3A+a+highly+versatile+library+of+synthetic+histone+H3+and+H4+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants.</a> Cell. 134, 1066-1078 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מתואר כאן הוא גישה ליצירת פרופילי אינטראקציה כימית-גנטית. השיטה היא פשוטה: על ידי השוואת גדלי מושבה של כל זן באוספי מחיקת גן מקיפים בנוכחות והיעדרות של חומר כימי, כל הגנים הדרושים כדי לסבול עלבון כימי מזוהים. ניתוח העשרת ביאור של הרשימה של זנים רגישים וכתוצאה מכך לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לספק תובנה למצב של פעולת כימיקלים. בעוד פרוטוקול זה כבר מותאם לשמרי ניצנים, זה גם יכול להיות מותאם לשימוש עם אוספים אחרים ערוכים חיידקי מחיקה, כגון E. אוסף coli Keio, אשר שמש בהצ...

הכלים ומשאבים זמינים באורגניזם המודל Saccharomyces cerevisiae הגנטיים אפשרו מחקרי גנומיקה התפקודית בקנה מידה גדולה שביחד מספקים תובנה חדשה איך גנים לתפקד כרשתות כדי למלא את הדרישות של מערכות ביולוגיות. אבן הפינה של כלים אלה הייתה היצירה המשותפת של סט שלם של מחיקות גן שאינו חיוניות של כל מסגרות הקריאה הפתוחה בשמרי 1,2. תצפית מדהימה הייתה שרק ~ 20% מגנים של שמרים נדרשים לכדאיות כאשר גדלו כhaploids בתנאי מעבדה סטנדרטיים. זה מדגיש את יכולתו של תא לחיץ נגד הפרעות הגנומי באמצעות הניצול של מסלולים ביולוגיים חלופיים. מוטציות גנטיות כי הן מבחינה אישית, אך קטלניות בשילוב, לאותת מסלולים ביולוגיים מקבילים מחוברים או מתכנסים ויוצרות רשתות אינטראקציה גנטיות המתארות פונקציה ביולוגית. עם התפתחותה של te המותנהאללים mperature רגישים וhypomorphic של גנים חיוניים הטכנולוגיה לא מוגבל למחקר של גנים שאינם חיוניים 3,4. מושג זה יושם בקנה מידה הגנומי לייצר מפת אינטראקציה גנטית משוחדת הממחישה את הגנים מעורבים בתהליכים תאיים דומים להתקבץ יחדיו 5. הפרעות כימיות של רשתות גנטיות מחיקות גן לחקות (איור 1) 6. שאילתות תרכובות צמיחה מעכבת כנגד מערך צפיפות גבוהה של זני מחיקה לרגישות יתר מזהה פרופיל אינטראקציה כימית-גנטי, כלומר רשימה של גנים שנדרשו לסבול מתח כימי. כמו אינטראקציות גנטיות, מסכי בקנה מידה גדולה של ספריות כימיות הראו כי תרכובות עם מצב דומה של אשכול פעולה יחד 7. לכן, על ידי הקמת פרופיל האינטראקציה הכימית-גנטית של מתחם המצב של פעולה ניתן ללמוד על ידי השוואתו עם larאינטראקציה גנטית וכימית סינתטית ge בקנה המידה גנטית מערכי נתונים 8,9. מסכי כימיים-גנטית בקנה מידה גדול, שבו עשרות רבות של תרכובות נחקרו, בוצעו על ידי מבחני תחרות ברקוד. בגישה זו, האוסף המשולב של זני מחיקה הוא גדל בהמוניהם לכמה דורות בנפח קטן של מדיה המכילה חומר כימי. מאז כל מוטציה מחיקת נמלים ברקוד גנטי ייחודי, את הכדאיות / הצמיחה של מוטציות בודדות בתוך הבריכה של זני מחיקה היא מעקב על ידי microarray או תפוקה גבוהה רצף 10. הסיק כושר על ידי ניטור גודל מושבה של מוטציות ערוכות מבחינה פיזית גדלו על אגר מוצק המכיל תרכובת ביו-אקטיבית הוא גם שיטה יעילה לזיהוי אינטראקציות כימיות-גנטי 11,12. גישה זו מספקת חלופה חסכונית להקרנה מבוססת תחרות והוא גם מתאים למנסה לאמוד ספריות קטנות של כימיקלים.מתואר כאן היא מתודולוגיה פשוטה להפקת רשימה של אינטראקציות כימיות-גנטי בS. cerevisiae שאינו מסתמך על מניפולציות מולקולריות ביולוגיה או תשתיות. זה דורש רק אוסף שמרי מחיקה, מנגנון נעיצה רובוטית או ידני, ותוכנת ניתוח תמונה זמינה באופן חופשי.

<table><tbody><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>למדיה נוזלית/מוצקה YEPD הוסף ל-1% ריכוז סופי (w/v)</td></tr> <tr><td>אבקת טירפטון</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>למדיה נוזלית/מוצקה YEPD הוסף ל-2% ריכוז סופי (w/v)</td></tr> <tr><td>דקסטרוז</td><td>אנכימיה</td><td>31096-380</td><td>עבור מדיה נוזלית/מוצקה YEPD הוסף ל-2% ריכוז סופי (w/v) &#8212; אין לבצע חיטוי. הכן תמיסת מלאי של 20%, עקר מסנן והוסף למדיה לאחר החיטוי.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>עבור מדיה מוצקה YEPD הוסף ל -2% ריכוז סופי (w/v)</td></tr> <tr><td>G418</td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>הכן מלאי פי 1,000 ב-200&nbsp; מ"ג/מ"ל ב-dH2O ולעקר את המסנן.&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>צינורות תרבית 5 מ"ל</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>רובוט הצמדת מערך מיקרוביאלי בעל תפוקה גבוהה</td></tr><tr><td>PLUSPLATE &copy; פטרי דיש</td><td>זמר אינסטרומנטס&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>קופסה של 200 כלים</td></tr><tr><td>384 סיכות קצרות RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-384</td><td>קופסה של 1,000 רפידות</td></tr><tr><td>1536 פינים קצרים RePad</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>קופסה של 1,000 רפידות</td></tr><tr><td colspan="4">כלי הצמדה חלופיים:</td></tr> <tr><td>מערכות רובטיות אוטומטיות לחלוטין</td><td>S& P רובוטיקה</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>מספר מערכות אוטומטיות לטיפול במושבות רוביטיות ודמיון זמינות.</td></tr><tr><td>כלי הצמדה ידניים</td><td>V& P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>כלים ואביזרים לשכפול כף יד.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

קביעת מצב פעולה של כימיקלים ביו-אקטיביים היא עניין למגוון רחב של אקדמיות, תרופות, ומדענים תעשייתיים. Saccharomyces cerevisiae, או שמרי ניצנים, הוא מודל לeukaryote שאוסף של ~ 6000 מוטציות מחיקת גן וגן חיוני hypomorphic מלא מוטציות זמינות מסחרי. אוספים אלה של מוטציות יכולים לשמש כדי לזהות באופן שיטתי אינטראקציות כימיות-גן, גנים כלומר צורך לסבול כימי. מידע זה, בתורו, דיווחים על המצב הסביר של פעולה של המתחם. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי המהיר של אינטראקציות כימיות-גנטית בשמרי ניצנים. אנו מדגימים את השיטה באמצעות הסוכן כימותרפיות 5-fluorouracil (5-FU), שבה יש מנגנון מוגדר היטב של פעולה. התוצאות שלנו מראות כי הנווד הגרעיני RNA אנזימי exosome ותיקון DNA נחוצים לשגשוג בנוכחות 5-FU, שעולה בקנה אחד עם מ &#39;קודםicroarray גישות המבוססות על קידוד בר כימיות גנטיות והידע ש5-FU משפיע לרעה על חילוף חומרים הן RNA ו- DNA. פרוטוקולי האימות המבוקשות למסכי תפוקה גבוהה אלה גם מתוארים.

כאימות של גישה זו הופענו מסך נציג כימי גנטי אינטראקציה של 5-fluorouracil הסוכן כימותרפיות (5-FU) בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. 5-FU ידוע לשבש synthase thymidylate כמו גם DNA ו- RNA חילוף חומרים 18. האינטראקציות הגנטיות הכימית של 5-FU היטב למדו ונחקרו על ידי טכניקות microarray השמרים ברקוד באמצעות שני אוספי מחיקה הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים 8,19. כאן אנו מראים כי ניתן להשיג תוצאות דומות על ידי quantitation ההשוואתי של גודל מושבה מוטציה. <p class="jove_content...

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית להגדרת אינטראקציות כימיות-גנטיות בשמרים ניצנים. הגישה בנויה על טכניקות בסיסיות בביולוגיה מולקולרית של שמרים ומתאימה היטב לחקירה מכניסטית של אוספים קטנים עד בינוניים של כימיקלים וסביבות מדיה אחרות.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בתאי שמרים כדי למצוא את התהליכים הביולוגיים הממוקדים על ידי כימיקל מעניין. זה מושג על ידי קביעת פרופיל תגובת המינון של כימיקל לשמרים. השלב השני הוא לגדל אוסף שלם של זני נוקאאוט של גנים שמרים במינון תת-קטלני של כימיקלים ועל צלחת בקרה.לאחר מכן מזוהים מוטציות שמרים רגישות יתר לכימיקל. רשימה זו מנותחת ביואינפורמטית כדי לחשוף את כל הגנים הדרושים כדי לסבול את הכימיקל. השלב האחרון הוא ביצוע שכפול ביולוגי של הניסוי בתפוקה נמוכה.זה מאמת את כל האינטראקציות הגנטיות הכימיות שנמצאו. בסופו של דבר, שיטת סינון גנטית כימית זו בעלת תפוקה גבוהה משמשת כדי להראות אילו תוצרי גנים ומסלולים ביולוגיים משמשים לסבול את הכימיקל המעניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון גידול תחרותי של מוטציות ברקודיות בתרבית נוזלית הוא שאין צורך בטכניקות ביולוגיה מולקולרית.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הכימית, כגון כיצד מולקולה קטנה חדשה יכולה לעכב את הצמיחה של תאים אוקריוטיים. כדי להתחיל, הכינו תרבית שמרים למשך הלילה על ידי פיזור BY 4 7 4 1 תאים על צלחת A-Y-E-P-D ודגרו במשך 48 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס או עד להיווצרות מושבות גלויות. כשהמושבות יהיו מוכנות.הכן תרביות נוזליות למשך הלילה על ידי בחירת מושבה בודדת וחיסון חמישה מיליליטר של מדיה

rapid-identification-chemical-genetic-interactions-saccharomyces

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

בסרטון זה, אנו מדגימים את בדיקת השמרים ההיברידית האחת, אשר מזהה חלבונים מרובים המקיימים אינטראקציה עם דנ"א המטרה. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה מכילים את רצף דנ"א המטרה במעלה הזרם של הגן המדווח. בנוסף, הם מבטאים חלבונים של פקטור שעתוק. כאשר החלבונים יוצרים קומפלקסים ונקשרים לדנ"א המטרה, הגן המדווח מתבטא וניתן לזהותו באופן אנזימטי.

בדיקה היברידית שונה של שמרים-אחד לזיהוי אינטראקציות קומפלקס חלבונים הטרומריים-DNA

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

השפעה הדדית באמצעות רצף (RH-seq) היא שיטה חדשה ורבת עוצמה למפות את הבסיס הגנטי של הבדל תכונה בין מינים. בריכות המייזוליטיס נוצרות על ידי הטרנספורזיס והכושר שלהם מתבצע באמצעות הצמיחה התחרותית באמצעות רצף ברמה גבוהה. ניתוח הנתונים הנובעים מנקודות גנים שבבסיס התכונה.

מיפוי גנטי של הבדלי התרמוסבילות בין מינים של שמרים באמצעות הגנום ההופכי לניתוח המייזוליסיטי

פתוגנים חיידקיים מפרישות חלבונים לתוך המחשב המארח המטרה תהליכים ביולוגיים קריטיים. זיהוי מסלולים המארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור הוא המפתח לטיפול פתוגנזה מולקולרית. כאן, שיטה באמצעות מדכא שמרים שונה ומסך רעילות כדי להבהיר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור רעיל מתואר.

זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

עבודה זו מתארת פרוטוקול לבדיקה גנטית מדכאת מולטי-קופיות בסכיזוזאכרומיצס פומבה. מסך זה משתמש בספריית פלסמידים כלל-גנומית כדי לזהות שיבוטים מדכאים של פנוטיפ אובדן תפקוד הקשור לזן מוטנטי שאילתה. מדכאים גנטיים חדשים של מוטציית האפס ell1 זוהו באמצעות מסך זה.

בדיקה גנטית לזיהוי מדכאי ריבוי עותקים בסכיזוזאכרומיצס פומבה

מבחני לכידת לולאת D (DLC) והרחבת לולאת D (DLE) משתמשים בעקרון קשירת הקרבה יחד עם PCR כמותי כדי לכמת היווצרות לולאת D, הרחבת לולאת D והיווצרות מוצרים באתר של שבר דו-גדילי אינדוקטיבי ב- Saccharomyces cerevisiae.

איתור מתווכי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות קשירת קרבה ו-PCR כמותי ב-Saccharomyces cerevisiae

חקור אינטראקציות גנטיות כימיות ב-Saccharomyces cerevisiae באמצעות זיהוי מוטנטים רגישים לכימיקלים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לגלות תהליכים ביולוגיים וגנים חיוניים לסבילות כימית ביעילות ובעלות נמוכה.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב

גלה סרטונים נוספים