מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב Saccharomyces cerevisiae

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בתאי שמרים כדי למצוא את התהליכים הביולוגיים הממוקדים על ידי כימיקל מעניין. זה מושג על ידי קביעת פרופיל תגובת המינון של כימיקל לשמרים. השלב השני הוא לגדל אוסף שלם של זני נוקאאוט של גנים שמרים במינון תת-קטלני של כימיקלים ועל צלחת בקרה.

לאחר מכן מזוהים מוטציות שמרים רגישות יתר לכימיקל. רשימה זו מנותחת ביואינפורמטית כדי לחשוף את כל הגנים הדרושים כדי לסבול את הכימיקל. השלב האחרון הוא ביצוע שכפול ביולוגי של הניסוי בתפוקה נמוכה.

זה מאמת את כל האינטראקציות הגנטיות הכימיות שנמצאו. בסופו של דבר, שיטת סינון גנטית כימית זו בעלת תפוקה גבוהה משמשת כדי להראות אילו תוצרי גנים ומסלולים ביולוגיים משמשים לסבול את הכימיקל המעניין. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון גידול תחרותי של מוטציות ברקודיות בתרבית נוזלית הוא שאין צורך בטכניקות ביולוגיה מולקולרית.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הכימית, כגון כיצד מולקולה קטנה חדשה יכולה לעכב את הצמיחה של תאים אוקריוטיים. כדי להתחיל, הכינו תרבית שמרים למשך הלילה על ידי פיזור BY 4 7 4 1 תאים על צלחת A-Y-E-P-D ודגרו במשך 48 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס או עד להיווצרות מושבות גלויות. כשהמושבות יהיו מוכנות.

הכן תרביות נוזליות למשך הלילה על ידי בחירת מושבה בודדת וחיסון חמישה מיליליטר של מדיה נוזלית YEPD בכלי סטרילי. לאחר מכן דגרו למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס עם סיבוב או טלטול מתמשך. לאחר מכן, הכינו מצע אגר מוצק המכיל מינונים שונים של הכימיקל לבדיקה.

לשם כך. ראשית, הכינו מספר תמיסות מלאי של הכימיקל המעניין פי 100 מהריכוז הסופי בממס מתאים. לאחר מכן, עבור כל ריכוז שייבדק, יש להוציא שלושה מיליליטר של אגר YEPD מותך למספר צינורות תרבית סטריליים.

בסס את הצינורות המכילים את האגר לאמבט מים של 55 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות של האגר. כעת, עבור כל ריכוז של כימיקל שייבדק ב-13, שחרור לבן של תרכובת 100 x לאליקוטה של אגר טקס מותך, הצינור למשך שתיים עד שלוש שניות לערבב ואז פיפטה מיליליטר אחד מכל צינור לבארות כפולות בלוח 12 עולם, מאפשר לצלחת להתייצב למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, יש לחסן 10 מיליליטר של מדיה נוזלית YEPD בשני מיקרוליטרים של תרבית השמרים הרוויה בלילה.

לאחר מכן פיפטה 25 מיקרוליטר מתרבית זו על הכימיקל המכיל אגר בבארות של צלחת 12 הלווייתן ומפזרת באופן שווה באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים או מוט סטרילי. הניחו לצלחת להתייבש מתחת להבה ולאחר מכן דגרו את הצלחת בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר שחלף זמן הדגירה, העריכו את המספר הכולל והגודל של המושבות בבארות.

זהה ריכוז תת-קטלני של תרכובת שאינה מעכבת צמיחה ביותר מ-10 עד 15% לשימוש במסך. שמור על קצב מוטנטי המחיקה בצפיפות של 384 מושבות לצלחת על ידי שכפול על 16 לוחות אגר YEPD, המכילים 200 מיקרוליטר למיליליטר של G ארבע 18. שימוש במערכת רובוטית של מערך מיקרוביאלי או כלי הצמדה ידניים כל שלושה חודשים.

אחסן את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. לאחר מכן הכינו 250 מיליליטר של מדיה אגר YEPD באותו ריכוז של G ארבע 18 או חמש צלחות אגר, והשאירו אותם להתקרר למשך הלילה בטמפרטורת החדר על משטח ישר ואחיד. הסר את הצלחות המכילות את אוסף מוטנטי המחיקה מהאחסון בארבע מעלות צלזיוס ואפשר לצלחות להגיע לטמפרטורת החדר.

השתמש במגבון משימות עדין כדי להסיר כל עיבוי שנוצר על המכסה של כל צלחת כדי למנוע טיפות מים להצטבר על המערך וזיהום צולב של מוטציות המערך. בקש מרובוט הצמדת המערך המיקרוביאלי לעבות את מערך מוטנטי המחיקה מצפיפות של 384 מושבות לצלחת על 16 צלחות פטרי ל-1,536 מושבות לצלחת על ארבע צלחות פטרי. לאחר הדגירה של המערך ב-30 מעלות צלזיוס למשך הלילה, בדוק את המערך כדי להבטיח העברה אחידה של מושבות מלוחות המקור.

יהיו מספר מיקומים ריקים המשולבים במערך, המשמשים כמדריך לכך שמערך מוטנטי המחיקה התעבה כהלכה. אלה יהיו לוחות המקור המשמשים לשכפול על מדיה המכילה את מתחם העניין שלך. ניתן להשתמש בלוחית מקור אחת עבור הצמדות מרובות.

כמו כן, לרובוטים רבים יש תכונות אופסט שיאפשרו, מה שיבטיח מספר דומה של שמרים המועברים בכל פעם. כדי להגדיר את תיקון מערך המוטאנטים של מחיקת לוחית העתק, 700 מיליליטר של רכב בקרה בלבד ואגר YEPD ניסיוני המכיל את הכימיקל המעניין. זה מספיק לביצוע הבדיקה בשלוש עותקים.

יוצקים את הצלחות בעזרת אגר הבקרה והניסיוני. הוספת 50 מיליליטר לכל צלחת. הניחו לצלחות להתקרר בטמפרטורת החדר למשך הלילה על משטח ישר ואחיד, באמצעות הרובוט כדי לחדש צלחת.

חסנו את מערך המוטאנטים הכפול על שלוש קבוצות של צלחות המכילות כימיקלים בריכוז שנקבע בניסוי, כמו גם איפוסים של לוחות המכילים את בקרת הרכב. דגרו את הצלחות על הספסל בטמפרטורת החדר לתמונה של 24 עד 48 שעות בסך הכל. הצלחות הן 24 ו-48 שעות של דגירה על ידי הסרת המכסה והנחתן עם הפנים כלפי מטה על סורק שטוח.

צלם תמונות ברזולוציה של 300 DPI לפחות. לחלופין, השתמש במצלמה דיגיטלית כדי לצלם תמונות. אם עושים זאת, הניחו את הצלחות עם הפנים כלפי מעלה על רקע כהה והסירו את המכסים לתמונה.

לאחר מכן בצע כימות והשוואה של גדלי מושבות מערך באמצעות אחת מכמה תוכנות קוד פתוח, כולל כלי SGA כדוריים וטחנת מסך. בשלב זה, מספר מוטציות של מחיקת שמרים יקבלו ציון כרגישות יתר לכימיקל המעניין להוציא את המוטציות הרגישות יתר הרצויות מאוסף מחיקת השמרים ל-YEPD. אגר המכיל 200 מיקרוגרם למיקרוליטר של G ארבע 18 דוגרות ב-30 מעלות צלזיוס עד להיווצרות מושבות.

לאחר אימות הגנוטיפ של הזן על ידי PCR אבחנתי ואלקטרופורזה של אגל, יש לחסן חמישה מיליליטר של נוזל ה-YPD בכל זן ולדגור למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס עם סיבוב או טלטול. מדוד את ה-OD 600 של כל תרבית ודלל כל זן ל-OD 600 של אחד במים מזוקקים סטריליים. אלה הן כעת תרבויות השמרים המנורמלות.

לאחר מכן, חלק 100 מיקרוליטר מסוג בר מנורמל על ידי 4 7 4 1 תרבית שמרים לבאר A אחת מצלחת 96 בארות לחלק 100 מיקרוליטר של עד שבעה זנים נוספים לבארות, B אחד עד H אחד. לאחר מכן, חלקו 90 מיקרוליטר מים סטריליים לבארות, A שתיים ל-H שתיים עד שש עד H שש. לבסוף הכינו סדרה של דילול אחד עד 10 של פסלי G מנורמלים.

התחל בפיפטינג סדרתי של 10 מיקרוליטר של עמודה אחת לעמודה שתיים עם פיפטה רב-ערוצית והמשך על פני צלחת 96 הבארות עד לביצוע דילול של שישה. לאחר מכן השתמש בפיפטה הרב-ערוצית לשניים עד חמישה מיקרוליטרים של תרביות השמרים המדוללות ברשת על YEP D's, מדיה מוצקה המכילה בקרה כימית ורכב. דגרו את הצלחות בטמפרטורה המתאימה למשך 24 עד 48 שעות לאחר הדגירה.

בדוק את הלוחות והשווה את הרגישות של מוטציות נבחרות לכימיות ביחס ללוחות תמונת הבקרה BY 47 41 ב-24 ו-48 שעות. כמו קודם, התמונות הבאות מציגות תוצאות מההליך לקביעת הריכוז המעכב של הכימיקלים. התמונה הראשונה מציגה צמיחה של תרבית רוויה BY 4 7 4 1 מדוללת מאחד ל -5,000 ומצופה בריכוזים הולכים וגדלים של חמישה פלואורו אורציל.

ריכוז 10 מיקרומולרי נבחר כמינון מעכב תת-פנימה. תמונה זו מציגה את עקומת הצמיחה של BY 4 7 41 תאים במדיה נוזלית המכילה חמישה פלורו אורציל. בערך ארבע פעמים 10 לארבעת התאים הופקדו בשלוש עותקים וריכוזים הולכים וגדלים של חמישה פלואורו אורציל וצפיפות אופטית נמדדו כל 10 דקות למשך 22 שעות.

שוב, ניתן לראות כי המינון של 10 מיקרו-מולרי הוא המינון המעכב של סובין. התמונות הבאות מציגות את התוצאות מגנטיקה כימית ירוקה של חמישה פלואורו אורציל. כאן, מוצג מערך מוטנטי של מחיקת S sachar visier המשוכפל על אגר YPD המכיל 10 מיקרו-מולרי חמישה אורציל פלואור מימין ובקרת DMSO משמאל.

הגרף הזה מראה את התוצאות של הגנטיקה הכימית בירוק, הצמיחה היחסית של מוטאנטים על 10 מיקרו-טוחנות. חמישה אורציל פלואור בהשוואה לבקרת DMSO מסודרים לפי מיקום קרן כאן. גידול יחסי של מוטציות על 10 מיקרומולר, חמש פלורה אורציל בהשוואה לבקרת DMSO מסודרים לפי יחס גודל המושבה.

סף יחס של פחות מ-0.8 מצוין בשני הגרפים. תמונה סופית זו מציגה תוצאות של שלוש בדיקות אימות. דילולים סדרתיים של מספר זנים מוטנטיים מבודדים גודלו על בקרת DMSO משמאל, 10 מיקרומולר, חמישה פלואורו UIL במרכז ו-0.015% מתיל מתאן סולפונאט מימין.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לוודא שאתה עובד עם עותק אמין של מערך מוטנטי המחיקה גם כדי לאמת תוצאות כלשהן באמצעות מתודולוגיה עצמאית כגון מבחני איתור שמרים או דיסקציה של טטראד שמרים. טכניקה זו מספקת אמצעי יעיל למדענים בתחום חקר מולקולות קטנות לחקור את אופן הפעולה של תרכובת באמצעות גישות ברמת המערכת בשמרים ניצנים.