Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl ערוצים ומסועים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע כמותית את פעילות ההובלה של תעלות כלוריד או טרנספורטרים משוחזרים. זה מושג על ידי בנייה מחדש של הטרנספורטר המטוהר הטהור לליפוזומים בצפיפות נמוכה כך שכל ליפוזום מכיל אפס או עותק אחד של הקומפלקס הפעיל לאחר הסרת יוני הכלוריד החיצוניים כך שיש שיפוע יוני מכוון כלפי חוץ, הליפוזומים מתווספים לתא ההקלטה בו מנוטר ריכוז הכלוריד באמצעות אלקטרודה רגישה לכלוריד. לאחר מכן, כלוריד flx מהליפוזומים מתחיל על ידי תוספת של Val Mycin, יונופור אשלגן, המגדיל את פוטנציאל הממברנה.

ברגע שהאות מגיע למצב יציב, הניסוי מסתיים על ידי הוספת חומר ניקוי להמסת הליפוזומים. בסופו של דבר, על ידי מדידת קצב פליטת הכלוריד מליפוזומי פרוטיאה, שהורכבו מחדש עם תעלה או טרנספורטר מטוהרים, ניתן לקבוע כמותית את קצב ההובלה היחידתי ואת הסטוכיומטריה של קומפלקס החלבון הפעיל. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני גישות קיימות אחרות, כגון מדידות שטף מבוססות פלואורסצנטיות, הוא שבעזרת טכניקה זו ניתן לקבוע כמותית פרמטרים מרכזיים של הטרנספורטר המשוחזר, כגון קצב התחלופה היחידתי, והגיאומטריה של המתחם.

בנוסף למתן מדדים כמותיים של פרמטרים מרכזיים אלה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע במהירות ובדייקנות את ההשפעה של מוטציות במולקולות קטנות, ולנטר תת-יחידות בחלבון ההעברה המשוחזר. מערך ההקלטה מורכב משני תאים, אלקטרודת כלוריד, מד pH עם פלט חשמלי אנלוגי או דיגיטלי, דיגיטייזר ומחשב עם תוכנת רכישה מתאימה. חבר את אלקטרודת הכלוריד למד ה- pH, ולאחר מכן חבר את הפלט של מד ה- pH לדיגיטייזר, המחובר למחשב.

הנח את אלקטרודת הייחוס בתא אחד ואת חוט הקידוד מחדש בשני. לאחר מכן, הניחו את התאים על צלחת ערבוב עם מוט הערבוב בתא ההקלטה. ודא שמוט הערבוב אינו נוגע באלקטרודה.

חבר את התאים באמצעות גשר אגר בלילה שלפני הניסויים מתנפחים גרם אחד של חרוזי cidex G 50 ב-15 מיליליטר של חיץ חיצוני עם ניעור עדין למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. כל ניסוי דורש כשלושה מיליליטר של חרוזים נפוחים בזמן שהליפוזומים מפשירים בטמפרטורת החדר. שופכים כשלושה מיליליטר חרוזי G 50 נפוחים לכל עמודה.

תן להם להתייבש על ידי כוח הכבידה. זרימה בטמפרטורת החדר. זה בדרך כלל לוקח דקה עד שתיים.

לאחר מכן, הכינו שלפוחיות על ידי הוצאת ליפוזומי הפרוטאה 11 פעמים דרך מכבש מיני באמצעות חתך טפלון של 0.4 מיקרון. לאחר מכן הנח את העמוד בצנטריפוגה תחתונה עגולה מפלסטיק למשך 20 עד 30 שניות ב-1400 גרם בצנטריפוגה קלינית כדי להסיר תמיסה עודפת. לאחר מכן, תוך שמירה על הזרימה, הניחו את העמוד בצינור זכוכית בגודל 13 על 100 מילימטר והוסיפו 100 מיקרוליטר מהשלפוחיות המוחצנות לעמוד.

סובב את העמודה למשך דקה אחת ב -500 G.In צנטריפוגה קלינית, אסוף כ -200 מיקרוליטר מהזרימה שדרכה יתווסף לתא ההקלטה. כדי לבצע מדידת שטף, הניחו שני מיליליטר של 100 מילי-מולרי אשלגן כלורי בתא הייחוס, ו-1.8 מיליליטר של המאגר החיצוני לתא ההקלטה. התחל את תוכנית הרכישה.

תן לקו הבסיס להתאזן. פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות. לאחר שהאות מגיע לקו בסיס יציב, התחל להקליט.

הוסף 15 מיקרוליטר של תמיסת אשלגן כלורי טוחנת שזופה כדי לכייל את המערכת. לאחר מכן מוסיפים ליפוזומים. קפיצה קטנה עשויה להיות נראית לעין עקב הסרה לא מלאה של כלוריד חיצוני מהליפוזומים של הפרוטאה.

המתן עד שקו הבסיס יתייצב. לאחר מכן, הוסף CIN כדי להפעיל את flx. תן ל-FLX לרוץ את מסלול הזמן שלו עד שהוא יתייצב.

בשלב זה, הוסף 40 מיקרוליטר של 1.5 בטא אוקטה גלוקוציד מולארי שהוכן במאגר החיצוני כדי להמיס את כל הליפוזומים. לאחר מכן המתן 10 עד 15 שניות. סיים את ההקלטה והמשך לניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

כאשר ליפוזומים המכילים כלוריד פנימי גבוה טובלים בכלוריד נמוך ומייצרים שיפוע כלוריד פי 300, לא נצפה שטף יונים נטו. הסיבה לכך היא שלליפוזומים נטולי החלבון יש חדירות פנימית נמוכה ליונים. לא נצפה FLX מקרוסקופי מליפוזומי פרוט שהורכבו מחדש עם טרנספורטר הכלוריד המצודד לפרוטונים, C-L-C-E-C אחד.

מכיוון שהכמות הקטנה של כלוריד היוצאת מהוסקו בונה מטען חיובי נטו בליפוזום, תוספת CIN מאפשרת ליוני אשלגן לנוע על פני הממברנה, להקל על הפוטנציאל החשמלי וליזום כלוריד flx. התגובה מסתיימת ונמדדת הכמות הכוללת של יוני הכלוריד הכלולים בשלפוחיות כדי לקבוע את המאפיינים של החלבונים הבודדים ששוחזרו. הנתונים הגולמיים של מהלך זמן הפליטה מומרים תחילה ממילי-וולט לריכוז כלוריד ולאחר מכן מנורמלים את מהלך הזמן לאחר מכן.

נקבע כי קבוע הזמן של הפליטה הוא 41 שניות וחלק הליפוזומים המכילים אפס עותקים פעילים של C-L-C-E-C אחד הוא נקודה 31, מה שמצביע על כך שכשליש מהליפוזומים מכילים אפס חלבונים פעילים מערכים אלה ומודד את תכולת הכלוריד של שלפוחיות המכילות לפחות עותק אחד של C-L-C-E-C אחד, ניתן לקבוע קצב הובלה יחיד של C-L-C-E-C אחד השווה לכ-2,500 יוני כלוריד לשנייה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את הצורך בתחלופה של מוביל. ניתן לבצע ניסויים אלה תוך 10 עד 15 דקות כאשר הם מבוצעים בזהירות.

חשוב להעריך בקפידה את איכות הליפוזומים, שכן דליפות משפיעות לרעה על הערכות קצב התחלופה.