Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע באופן כמותי את פעילות ההובלה של תעלות כלוריד או נשאי כלוריד ששוחללו מחדש. דבר זה מושג תחילה על ידי שחלוול מחדש של הנשא המזוקק והטהור לתוך ליפוזומים בצפיפות נמוכה, כך שכל ליפוזום יכיל אפס או עותק אחד של הקומפלקס הפעיל; לאחר הסרת יוני הכלוריד החיצוניים כדי ליצור מפל יוני המופנה החוצה, מוסיפים את הליפוזומים לתא ההקלטה שבו מנוטר ריכוז הכלוריד באמצעות אלקטרודה רגישה לכלוריד. לאחר מכן, זרימת הכלוריד מהליפוזומים מופעלת על ידי הוספה של Val Mycin, יוניפור של אשלגן, המפחית את פוטנציאל הממברנה.

ברגע שהאות מגיע למצב יציב, הניסוי מסתיים על ידי הוספת דטרגנט להמסת הליפוזומים. בסופו של דבר, על ידי מדידת קצב השטף של כלוריד מליפוזומים פרוטאיים, שהורכבו מחדש עם תעלה או נשא מטוהר, ניתן לקבוע כמותית את קצב התובלה היחידתי ואת הסטוכיומטריה של קומפלקס החלבון הפעיל. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני גישות קיימות אחרות, כגון מדידות שטף מבוססות פלואורסצנציה, הוא שבאמצעות טכניקה זו ניתן לקבוע כמותית פרמטרים מרכזיים של הנשא שהורכב מחדש, כגון קצב התחלופות (turnover rate) היחידתי והגיאומטריה של הקומפלקס.

בנוסף לאספקת מדדים כמותיים של פרמטרים מרכזיים אלה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע במהירות ובדיוק את ההשפעה של מולקולות קטנות מוטסות, ולנטר תתי-יחידות בחלבון ההעברה המשוחזר. מערך ההקלטה כולל שתי תאים, אלקטרודת כלוריד, מד pH עם פלט חשמלי אנלוגי או דיגיטלי, דיגיטייזר ומחשב עם תוכנת רכישה מתאימה. חברו את אלקטרודת הכלוריד למד ה-pH, ולאחר מכן חברו את הפלט של מד ה-pH לדיגיטייזר, המחובר למחשב.

הנח את אלקטרודת הייחוס בתא אחד ואת תיל ההקלטה בתא השני. לאחר מכן, הנח את התאים על בוחש מגנטי כאשר מוט הבחישה נמצא בתא ההקלטה. ודא שמוט הבחישה אינו נוגע באלקטרודה.

חברו את התאים באמצעות גשר אגר בלילה שלפני הניסויים. השרו גרם אחד של חרוזי cidex G 50 ב-15 milliliters של בופר חיצוני עם ניעור עדין למשך שלוש שעות לפחות בטמפרטורת החדר לפני השימוש. כל ניסוי דורש כ-three milliliters של חרוזים מושרים בזמן שהליפוזומים מפשירים בטמפרטורת החדר. שפכו כ-three milliliters של חרוזי G 50 מושרים לתוך כל עמודה.

הנח להם להתייבש באמצעות כוח הכבידה. הזרימה מתבצעת בטמפרטורת החדר. תהליך זה אורך בדרך כלל דקה עד שתי דקות.

בשלב הבא, הכין וסיקולות על ידי דחיפתה של הליפוזומים 11 פעמים דרך מיני-אקסטרודר באמצעות מסנן טפלון של 0.4 מיקרון. לאחר מכן, הנח את העמודה במבחנה פלסטית בעלת תחתית עגולה וסובב אותה למשך 20 עד 30 שניות ב-1400 G בצנטריפוגה קלינית כדי להסיר עודפי תמיסה. לאחר מכן, תוך שמירה על הזרימה, הנח את העמודה במבחנה מזכוכית של 13 על 100 מילימטר והוסף לעמודה 100 µL של הוסיקולות שהועברו באקסטרודריה.

סובב את העמודה למשך דקה אחת ב-500 G. באמצעות צנטריפוגה קלינית, אסוף כ-200 µL מהנוזל שעבר (flow through), אשר יתווסף לתא ההקלטה. לביצוע מדידת אפלוקס (efflux), הנח 2 mL של potassium chloride בריכוז 100 mM בתא הייחוס, ו-1.8 mL של הבאפר החיצוני בתא ההקלטה. הפעל את תוכנת הרכישה.

המתינו עד להתייצבות קו הבסיס. תהליך זה עשוי להימשך מספר דקות. ברגע שהאות מגיע לקו בסיס יציב, התחילו בהקלטה.

הוסף 15 µL של תמיסת פוטסיום כלוריד בריכוז מולרי כדי לכייל את המערכת. לאחר מכן הוסף ליפוזומים. ייתכן שייראה קפיצה קטנה עקב הסרה חלקית של כלוריד חיצוני מהליפוזומים של הפרוטאי.

המתינו עד להתייצבות קו הבסיס. לאחר מכן, הוסיפו CIN כדי להתחיל את ה-flx. הניחו ל-FLX להמשיך במהלך הזמן שלו עד שיגיע למישור (plateau).

בשלב זה, הוסף 40 µL של beta Octa glucocide בריכוז 1.5 M שהומס בבופר החיצוני כדי להמיס את כל הליפוזומים. לאחר מכן המתן 10 עד 15 שניות. הפסק את ההקלטה ועבור לניתוח הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

כאשר ליפוזומים המכילים ריכוז פנימי גבוה של כלוריד מוטבלים בסביבה עם ריכוז כלוריד נמוך, היוצרים גרדיאנט כלוריד של 300 ממים, לא נצפה שטף יונים נטו. זאת מכיוון שליפוזומים נטולי חלבונים הם בעלי חדירות פנימית נמוכה ליונים. לא נצפה FLX מאקרוסקופי מליפוזומים ששוחלל בהם נשא כלוריד המצומד לפרוטון, C-L-C-E-C one.

מכיוון שהכמות הקטנה של כלוריד היוצאת מהוסיקולות יוצרת מטען חיובי נקי בליפוזום, הוספת CIN מאפשרת ליוני אשלגן לנוע דרך הממברנה, מה שמקל על הפוטנציאל החשמלי ומניע את זרימת הכלוריד. התגובה מופסקת והכמות הכוללת של יוני כלוריד המכילה בוסיקולות נמדדת כדי לקבוע את התכונות של החלבונים הבודדים ששוחללו. הנתונים הגולמיים של מהלך זמן ה-efflux מומרים תחילה ממילי-וולט לריכוז כלוריד ולאחר מכן מנורמלים; לאחר מכן מבוצע התאמה (fitting) של מהלך הזמן.

נקבע כי קבוע הזמן של השטף הוא 41 שניות וכי חלקם של הליפוזומים המכילים אפס עותקים פעילים של C-L-C-E-C one הוא 0.31, מה שמעיד על כך שכשליש מהליפוזומים אינם מכילים חלבונים פעילים. מערכים אלו, יחד עם מדידת תכולת הכלוריד של וסיקולות המכילות לפחות עותק אחד של C-L-C-E-C one, מאפשרים לקבוע קצב הובלה יחידאי של C-L-C-E-C one השווה לכ-2,500 יוני כלוריד לשנייה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו קובעים את קצב התחלופות (turnover) של נשא. ניתן לבצע ניסויים אלו בתוך 10 עד 15 דקות כאשר הם מבוצעים בקפידה.

חשוב להעריך בקפידה את איכות הליפוזומים, שכן דליפות משפיעות לרעה על הערכות של קצב התחלופה.