Name: הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: למד שתי שיטות לניתוח arborization דנדריטי בהיפוקמפוס של עכברים: מעקב בזמן אמת ודימות עומק שדה מורחב. השיטות מאפשרות מיפוי טופוגרפי מפורט והערכה כמותית של מורכבות דנדריטית במחקר נוירוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מקרן LuMind, Research Down Syndrome ואיגוד האלצהיימר (AS). CP נתמך חלקית על ידי מענק פיתוח סגל מהמכללה לסיעוד ומקצועות הבריאות באוניברסיטת ארקנסו.

הערה: ניסויים נערכו בהתאם לסטנדרטים האתיים אושרו על ידי הוועדה למחקר בבעלי חיים במערכת הבריאות לענייני יוצאי צבא פאלו אלטו. 1. Golgi-קוקס מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חילוץ מוח וצביעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 1 ב, עמוק להרדים עכברים עם 100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine לפני הרדמת החסד באמצעות exsanguination. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את calvarium ולנתח את המוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להסיר את העור בחלק העליון של הגולגולת, הצבת מספריים מעוגלים בחלקו העליון של המוח הקטן ובעדינות לחתוך המקביל calvarium למענית המרכזית עם הקצה של המספריים הצביע החוצה, נע בכיוון לכיוון הנורה חוש הריח. חזור על תהליך זה בשני הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pincet כירורגית להרים calvarium תוך הפיכתו לכיוון נורות חוש הריח ולשבור אותו. ואז, להפוך את הגולגולת הפוכה ולהשתמש איסוף לחתוך האופטיעצבים ולשחרר את המוח. לבסוף, השתמש בבחירה להפריד את המוח מחוט השדרה ברמה של מגנום foramen. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לטבול את המוח ב- 15 מיליליטר של תמיסה מסחרית-זמינה, חי Golgi-קוקס. אחסן את המוח בפתרון Golgi ב, בקבוק זכוכית 20 מיליליטר כתרים בטמפרטורת חדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , ביום 2 לשפוך לאט את הפתרון ולהחליף אותו עם 15 מיליליטר פתרון Golgi-קוקס טרי. לסכם את הבקבוק המכיל את המוח ולהשאיר ללא הפרעה לעוד 9 ימים בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתך וembedment <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ה -11, מקום המוח בתמיסת סוכרוז 30%, שהוכן DDH 2 O להתייבשות. לשנות את הפתרון עם סוכרוז 30% מוכנים טרי לאחר 12 שעות. דגירה המוח בתמיסת סוכרוז 30% במשך 3 ימים על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ה -14, למלא את המאגר של vibratome עם תמיסת סוכרוז 30% עד שהלהב מכוסה. קבע את המהירות 1 מ &#39;ים עם משרעת של 0.95 מ&quot;מ מ &#39;/. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחוק את המוח עם Kimwipe כדי להסיר לחות עודפת ולהסיר את המוח הקטן באמצעות סכין גילוח לחתוך coronally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף לעלות את המוח כולו על גבי פלטפורמת vibratome באמצעות דבק מגע ולאפשר לו להגדיר במשך 2-4 דקות. הכנס את הפלטפורמה עם המוח דבק לתוך המאגר ולהתאים את הלהב לחלק העליון של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות vibratome, פורס את המוח ל-150 מיקרומטר חלקים עבים בטמפרטורת חדר, לזכור להחליף את הלהב לאחר כל מוח 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את החלקים מהמאגר בעזרת מברשת היטה קטנה ולטבול אותם לתוך צלחת פטרי המכילה ג&#39;לטין 0.3% תוצרת DDH 2 O. בעוד הסעיפים יישארו בצלחת פטרי, להוסיף 0.5 מיליליטר של ג&#39;לטין 0.3% בכל שקופית ולהשתמש במברשת כדי להפיץ ומעיל Superfrost + השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להרים את החלקים שקועים מצלחת פטרי ומניח אותם על גבי שקופיות gelatinized. כוון את החלקים במוח על ידילגעת בם רק על צדם ולא על ראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כעשר דקות, מעיל הקטעים עם סוכרוז 30% לפני הרקמה מתייבשת לגמרי. לאחר מכן אוויר יבש השקופיות מוכנות במקום חשוך במעמד שקופית במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון 10x מסחרי-זמין לפיתוח 1x באמצעות DDH 2 O. לטבול את השקופיות בפיתוח פתרון ל7-10 דקות. יש לשטוף את השקופיות 3 פעמים בDDH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ופתרונות אתנול% 95 באמצעות DDH 2 O. מזוקק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את השקופיות בפתרונות אתנול גבוהים יותר ויותר במשך 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את השקופיות ב 100% פתרון אתנול 3 פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את השקופיות ב 100% קסילן 3 פעמים ברציפות במשך 5 דקות כל אחד, שמירה על הסעיפים בפתרון הסופי עד שהם החליקו-כיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמות נדיבה של DPX (phthalate Di-n-בוטיל בקסילן) הרכבה בינונית (ab1-1.5 מתוך מיליליטר) על כל שקופית באמצעות pipet העברת פלסטיק. זהירות במקום coverslips כדי למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי האוויר יבש החליק-מוח סעיפים אופקי במשך 3 ימים. </li></ol></li></ol> 2. Doublecortin מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים (ראה שלב 1.1.1) בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זלוף לב עם paraformaldehyde 4% מוכנים טרי שנעשה בחיץ פוספט 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח (ראה 1.1.2) וחנות ב -45 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב 4 ° C למשך לילה על שייקר נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוח לפתרון סוכרוז 30% ולחכות להתייבשות מלאה במשך 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את המוח מסוכרוז ומניח אותם ישירות על בלוקי נחושת מונחים על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הבלוק עם טמפרטורה אופטימלית חיתוך מתחם (אוקטובר) ולסמן את הכיוון של המוח באמצעות הנורה חוש הריח כנקודת ציון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות cryostat, לחתוך 70 סעיפים מיקרון עבים ב -20 ºC ולמקם אותםבפתרון cryoprotectant (25% אתילן גליקול, גליצרול 25%, ב0.05 חיץ פוספט M נתרן, pH 7.4) ולשמור ב -20 ° C עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון של 50% מתנול cryoprotectant ו -50%. לפתרון זה מוסיף 0.5% מי חמצן (כרך / כרך). סעיפי דגירה צף במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטעים חמים ב -37 ºC בTBS (נאגר מלוח טריס) במשך 30-40 דקות על ידי הצבת אותם בתנור היסטולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הקטעים עם טריטון 0.3% ו -3% בסרום סוס רגיל במשך 45 דקות בטמפרטורת חדר לפני immunostaining. דגירה הסעיפים ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב 3 מיליליטר פתרון של נוגדן DCX בדילול 1: 500 בTBS עם טריטון 0.3% ו -1% בסרום סוס רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת לשטוף את הסעיפים 3 פעמים רצופות בTBS (10 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה עם אנטי-עז סוס biotinylated (1: 200 בTBS) לשתי שעות בטמפרטורת חדר. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים רצופות בTBS (10 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה tמכפלת עם ABC לייט (1: 1000) תמורת 1.5 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של H 30% 2 O 2 לטבליה אחת של 10 מ&quot;ג של DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) פתרון המומס ב 15 מיליליטר של 1 M טריס- HCl (pH 7.6). דגירה הסעיפים מייד בפתרון זה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את התגובה על ידי שטיפתם עם כפות קרות כקרח שלוש פעמים ואחרי שטיפה אחת בTBS בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש חלקים באמצעות סדרה של פתרונות אתנול (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 5 דקות כל אחד), ברורה בקסילן, ואז לכסות להחליק באמצעות DPX כמו בשלב 1.3. </li></ol> 3. ויזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות ייבוש של החלקים שלמים, להסיר DPX העודף על גבי השקופיות עם להב חד, ומניח אותם על הבמה הסריקה של מיקרוסקופ. המערכת מורכבת של מיקרוסקופ מצויד בשלב סריקה, ג&#39;ויסטיק, ומצלמה 12-bit צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התכנית. פתיחת קובץ נתונים חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקוםנקודת התייחסות על המסך על ידי לחיצה עם סמן העכבר בכל מקום. זה יהיה להפעיל את כל הסמלים מהלוח הכלי של חלון תכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הסמל &quot;ג&#39;ויסטיק חינם&quot; בסרגל הכלים ולאחר מכן להשתמש בג&#39;ויסטיק כדי לאתר את gyrus המשונן של ההיפוקמפוס בסעיף הראשון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה &quot;כלים&quot; של חלון התכנית, בחר &quot;מנהל מדור סידורי&quot;. לחץ על הסמל &quot;סעיף חדש&quot; בפינה השמאלית התחתונה של החלון. הפעולה זו תפתח את החלון &quot;הגדרת סעיף סידורי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את חלון הגדרת סעיף הסידורי ולאחר מכן להזין את המספר הכולל של קטעים המכילים אזורים בהיפוקמפוס. בחר את מרווח ההערכה. הזן את עובי חתך סעיף (70 מיקרומטר לDCX ו -150 מיקרומטר לחלקים צבעוניים Golgi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל התחקות אזור gyrus המשונן על ידי לחיצה על הסמל &quot;Freehand Contour הציור&quot; בסרגל הכלים. להתוות את שכבת תאים הגרעינית משוננת. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;100X&quot; מתפריט &quot;הגדלה&quot;. להוסיף טיפה של שמן טבילה בסעיף ולעבור למטרת 100X. אתר את הגופים המשונן תא גרגיר ודנדריטים תחת מטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד בנוירון שנבחר ולחץ על הסמל &quot;Neuron Tracing&quot; בסרגל הכלים. עקוב אחר ההיקף של גוף תא גרגיר המשונן. בסיום מעקב, לחץ לחיצה ימנית כדי לבחור &quot;תא בגוף סיום&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל מעקב דנדריטים ידני בx, y, z וכיוונים ועיקבו אחרי כל ענף באמצעות כפתור הג&#39;ויסטיק וz-מוטורי. בצומת הסתעפות או trifurcation, בחר את האפשרות המתאימה מהתפריט הנפתח על הלחצן ימני של העכבר. עקוב אחר כל אחד מהענפים הנובעים מבלוטות אלה. בסופו של כל סניף קליק ימני ובחר &quot;סיום&quot; מהתפריט הנפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסמלי מקש החץ בחלון התוכנה יבחר באופן אקראי תא אחר גרגיר המשונן ובצע את אותו הנוהל כמו described בשלב 3.9-3.10. שמור את כל המעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת מעקב העצבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ נתוני NRX הראשון מהעכבר הראשון של קבוצת הניסוי. צרף את קובץ NRX של העכבר השני של קבוצת הניסוי. המשך עד שכל קבצי NRX מקבוצה זו יתווספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת לשונית ניתוח, בחר &quot;מאוורר ב- תרשים&quot;. פעולה זו פותחת את החלון ב- ניתוח המאוורר. בדוק &quot;דנדריטים&quot; סימן ולחץ על תצוגה, המתארת ​​את האורכים ודפוסי הסתעפות של הדנדריטים עבור קבוצה זו של עכברים (איור 1). </li></ol> 4. EDFI הערה: שיטה זו מאפשרת למשתמש להקליט במהירות מספר רב של תמונות דרך Z- הציר של כל שדה וליצור תמונת 2D המכילה את כל הפיקסלים ממוקדים לאורך ציר z. התוצאה תהיה תמונה מורכבת המכילה את כל הפיקסלים ממוקדים מתמונות שנאספו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המיקרוסקופ למצלמת דיגיטליתעידן. מניחים את החלקים הראשונים על הבמה הסריקה המחוברת למיקרוסקופ ולאחר מכן לעבור למטרת 10X. הזז את הבמה לאזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל תכנית לכידת וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור ההקלטה. ברגע שכפתור ההקלטה נלחץ, השתמש בכפתור מאקרו הפוקוס כדי לעבור מהחלק העליון לחלק התחתון של הסעיף עבור הסכום כולל של 4 שניות. שמור את קובץ וידאו וכתוצאה מכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה חופשית ImageJ להמיר קבצי וידאו מסוג AVI לפורמט דחוס על ידי פתיחת הקובץ ולשמור אותם בפורמט קובץ דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תכנית ניתוח תמונה ולפתוח את קובץ AVI. עבור לתפריט &quot;תהליך&quot; ולחץ על &quot;עומק שדה מורחב&quot;. בחר את קובץ וידאו המתאים. באפשרויות &quot;פלט&quot;, בחר &quot;צור תמונה הטובה ביותר-פוקוס Composite&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באפשרויות &quot;פוקוס ניתוח&quot;, בחר &quot;מנורמלת תאורה&quot; ואפשרויות &quot;ניגודיות המקומית מקס&quot;. לאחר מכן, בחר &quot;Creאכל &quot;. התמונה המתקבלת מייצגת את כל הפיקסלים ממוקדים לאורך ציר z (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונה וכתוצאה מכך. </li></ol> 5. יצירת תמונות ברזולוציה מאוד גבוהות הערה: שיטה זו מאפשרת למשתמש ליצור באופן אוטומטי בהגדלה נמוכה ומאוד תמונות ברזולוציה גבוהה מתמונות ברזולוציה גבוהה בהגדלה גבוהה באופנת automatized. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החלקים הראשונים על הבמה הסריקה המחוברת למיקרוסקופ. מיקרוסקופ מחובר למצלמה דיגיטלית. הזז את הבמה לאזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תכנית רכישת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במטרת 10X ולרכוש ולשמור ברזולוציה גבוהה (4076 x 3116) תמונות מהאזור של עניין ולוודא שיש לפחות 10% חפיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה לרוץ Composite עורך לתפור תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אל תפריט קובץ, ולחץ על &quot;ניו פנורמה&quot;. בחר את התיקייה שבה התמונות הן stכבדתי. בחר את התמונות ששייכים לאותו האזור ולחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן &quot;יצוא לדיסק&quot; ולשמור את התמונה. תמונה זו מייצגת תמונה ברזולוציה גבוהה מאוד של תחומי עניין של שיכול לשמש לניתוח ו / או הפגנה (איור 3). </li></ol>

<ol><li>Bosch, M., Hayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).</li>
<li>Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synapse%3A+center+stage+for+many+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The synapse: center stage for many brain diseases.</a> The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).</li>
<li>Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapses+and+Alzheimer%E2%80%99s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synapses and Alzheimer’s disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777(2012).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).</li>
<li>Huttenlocher, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+development+in+neocortex+of+children+with+mental+defect+and+infantile+spasms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms.</a> Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+origin+of+the+pericellular+baskets+of+the+pyramidal+cells+of+the+human+motor+cortex%3A+a+Golgi+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study.</a> Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).</li>
<li>Dang, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formoterol%2C+a+long-acting+%CE%B22+adrenergic+agonist%2C+improves+cognitive+function+and+promotes+dendritic+complexity+in+a+mouse+model+of+Down+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome.</a> Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).</li>
<li>Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+and+spine+density+is+not+altered+in+motor+cortex+and+dentate+granular+cells+in+mice+lacking+the+ganglioside+biosynthetic+gene+B4galnt1+A+quantitative+Golgi+cox+study%5BTitle%5D)+AND+%22Coll+Antropol%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study.</a> Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).</li>
<li>Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublecortin+gene+family+and+disorders+of+neuronal+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Nerv+Syst+Agents+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure.</a> Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).</li>
<li>Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis.</a> Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).</li>
<li>Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+of+notch+signaling+in+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Golgi-Cox+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Juraska, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+developmental+plasticity+in+the+visual+cortex+and+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus.</a> Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).</li>
<li>Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate+traumatic+brain+injury+causes+acute+dendritic+and+synaptic+degeneration+in+the+hippocampal+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus.</a> PLoS One. 6 (9), e24566(2011).</li>
<li>Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+CA+field+neurogenesis+after+pilocarpine+insult%3A+The+hippocampal+fissure+as+a+neurogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche.</a> J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).</li>
<li>Merz, K., Lie, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+Doublecortin+is+dispensable+for+the+development+of+adult+born+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice.</a> PLoS One. 8 (5), e62693(2013).</li>
<li>Hussaini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
</ol>

עמלות פרסום לכתבה זו ממומנות על ידי MBF Bioscience.

כאן, שתי שיטות שתוארו לכמת את היקף arborization הדנדריטים בתאים בוגרים וזה עתה נולד בשיטות צביעה קונבנציונליות בשיתוף עם RTI וEDFI. הרכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של תאי עצב מספקת שיטה מאוד שימושית לבדיקת ההשפעות המזיקות של הפרעות ניווניות ו, בתורו, מספקת אמצעי להערכת אסטרטגיות טיפוליות המתמקדות בתאי עצב בהיפוקמפוס. בעוד שיטת RTI נוצלה כדי ללכוד את הנתונים לעומק הנוגעים להיקף arborization וטופוגרפיה, שיטת EDFI ...

שינויים דינמיים במספר ובמבנה של סינפסות הם מסימני היכר של פיתוח, הזדקנות, והפרעות ניווניות רבות 1-3. היכולת של נוירונים לקבל ולשלב מידע הסינפטי תלויה מורפולוגיה הדנדריטים ושינויים דינמיים בקשרים סינפטיים. ואכן, נמצא מתאם חיובי בין עמוד השדרה הדנדריטים ומספר סינפסה, ששניהם משפיעים על תפקוד הקוגניטיבי 4. לפיכך, אין זה מפתיע שdecrements במספר עמוד השדרה דנדריטים נקשר עם תפקוד קוגניטיבי לקוי במספר הפרעות נוירולוגיות 5-7, מה שגרם עניין רב בכימות עמוד השדרה הדנדריטים. אף על פי כן, כימות של צפיפות עמוד השדרה נשארה זמן רב ומשימה מייגעת שלא מצליח לייצר מידע שימושי בנוגע לטופוגרפיה וההפצה של סינפסות על פני העץ הדנדריטי. למרבה המזל, בשיטות צביעה (למשל, Golgi-קוקס וdoublecortin (DCX)) בשיתוףבעזרת שיטות הדמיה מתוחכמות יכול להיות מנוצל כדי להתגבר על מחסומים הנוכחיים ולהפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של arborization הדנדריטים באופן אמין ומהיר. בעוד ששיטת צביעת Golgi-קוקס ניתן לפרוס על מנת להעריך את המצב של arborization הדנדריטים בכל הנוירונים 8, ניתן לפרוס DCX לתייג נוירונים שזה עתה נולד במיוחד ברכס המשונן ואזור subventricular 9, שיקול חשוב בהתחשב בכך שneurogenesis מתרחשת בשני אזורים אלה בתוחלת החיים 10,11. בעקבות צביעה, שתי שיטות הדמיה נפרסו להעריך מאפיינים דנדריטים: i) הדמיה בזמן אמת (RTI) ו- II) עומק מורחב של הדמיה שדה (EDFI). טכניקת RTI מספקת בממוצע לאתר ולכמת את האורך וסדר arborization לאורך המקטעים דנדריטים הפרט וסניפים. כך שהוא מאפשר לאמוד את השטח ונפח שנכבש על ידי כל עץ הדנדריטי הכולל. עוד specifically, בשיטת RTI המשתמש ברציפות מזהה את הקטעים והפניה מחודש איטרטיבי כנוירון התחקות תוכנה אוסף את x, y, z וקואורדינטות של המבנה הדנדריטי ומשחזר את מסלולו של המבנה הדנדריטי ב3D. יחסית, שיטת EDFI מספקת אמצעי פשוט למדי ומזורז להערכת צפיפות דנדריטים בדגימות רקמה עבות למדי על ידי יצירת תמונה מורכבת, מתן מידע על Z- הציר כולו. לשם כך, המשתמש רשומות קבצי וידאו בחדות גבוה בכל העובי של הסעיף ולאחר מכן משתמש בתוכנה כדי לחפש מסגרות וידאו לזהות נקודות בי פיקסל הוא לגמרי בפוקוס. בהמשך לכך, פיקסלים ממוקדים מתמזגים ומשתלבים ברזולוציה גבוהה, תמונת 2D מורכבת. תמונה מורכבת זה מכילה את כל הפיקסלים שהיו בפוקוס, ללא קשר למיקום שלהם בציר z. ניתוח איכותי וכמותי של תמונות 2D אלה יכול לשמש לאחר מכן כדי לקבוע את הצפיפותשל הדנדריטים הסתעפות בכל תחום. לבסוף, אנו מציגים שיטת פנורמי ליצירת מאוד תמונות ברזולוציה גבוהה לניתוח וההערכה של דנדריטים באזור כולו של עניין. טכניקה זו ניתן לפרוס כדי להתגבר על חוסר הנגישות לרזולוציה גבוהה מאוד ומצלמות דיגיטליות יקרות. באמצעות שיטה זו, אחד לוכד תמונות סידורי במקומות שונים לאורך הקואורדינטות x ו- y צירים ולאחר מכן באופן אוטומטי תפרים אותם יחד באמצעות תוכנה חופשית (למשל, תמונה מורכבת עורך). יש לציין, שיטה זו יכולה לשמש להערכה איכותית וכמותית של arborization הדנדריטים באזור רחב למדי.

<table><tbody><tr><td>תמיסת צביעה גולגי-קוקס שונה&nbsp;</td>חנות <td>NA של המכללה הרפואית וייל קורנל</td><td></td><td>ב-4&deg; C עד לשימוש</td></tr><tr><td>1x פתרון פיתוח (מלאי 10x)</td> חנות <td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>ב-4&deg; C עד לשימוש 30</td></tr><tr><td>% סוכרוז,</td> <td>Sigma</td><td>CAS # 57-50-1</td><td>מכינים טרי &nbsp; ב ddH2O</td></tr><tr><td>0.3% ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>תמיסות אתנול מדורגות (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>קסילן</td><td>סיגמא</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX בינוני</td><td>EMS&nbsp;</td><td>#13510</td><td></td></tr><tr><td>NA Superfrost (+)</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td> לבנה <td>71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>Coverslip 22x50 מ"מ (VWR #48393-059)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#4811-703</td><td></td></tr><tr><td>NA DCX נוגדן</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-8066</td><td>4 C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>מספר CAS 91-95-2 &nbsp;</td><td>-20</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>מספר CAS 77-86-1 &nbsp;</td><td>נה</td></tr><tr><td>ABC Lite</td><td>וקטור</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת 12 סיביות&nbsp;</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida System</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Image Composite Editor</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

הוכח כי ארבוריזציה דנדריטית היא סמן אמין לבחינת שלמות מבנית ותפקודית של נוירונים. ואכן, המורכבות וההיקף של ארבוריזציה דנדריטית מתואמות היטב עם הפלסטיות הסינפטית בתאים אלה. יש צורך בשיטה אמינה להערכת ארבוריזציה דנדריטית כדי לאפיין את ההשפעות המזיקות של הפרעות נוירולוגיות על מבנים אלה ולקבוע את ההשפעות של התערבויות טיפוליות. עם זאת, כימות המבנים הללו הוכיח את עצמו כמשימה אדירה בהתחשב באופי המורכב והדינמי שלהם. למרבה המזל, ניתן לשלב טכניקות הדמיה מתוחכמות עם שיטות צביעה קונבנציונליות כדי להעריך את מצב הארבוריזציה הדנדריטית, ולספק אמצעי הערכה אמין ומהיר יותר. להלן דוגמה לאופן שבו טכניקות הדמיה אלה שולבו עם שיטות צביעה כדי לאפיין את העצבים הדנדריטיים בעכברים מסוג בר. ניתן להשתמש בשיטות הדמיה משלימות אלו כדי להעריך באופן איכותי וכמותי עצים דנדריטיים המשתרעים על שטח רחב למדי באזור ההיפוקמפוס.

של arborization הנובע מתאי גרגיר המשונן קיימים ושזה עתה נולדו המידה נותחה בעכברים מסוג בר או באמצעות Golgi-קוקס או הכתמת DCX (איור 1). מגזרי דנדריטים של תאי DCX-חיוביים נמצאו להיות ארוך 13-36 מיקרון. ההתפלגות הנורמלית של אורך דנדריטים נבדקה באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב (D = .1217, p &lt;0.01, p Liliefors &lt;0.001; איורים 4 ו -5). בניתוח האורך של מגזרים לכל הס...

אנו מתארים שתי שיטות להדמיה וכימות של ארבוריזציה דנדריטית בהיפוקמפוס של מודלים של עכברים: הדמיה בזמן אמת ועומק שדה מורחב. בעוד שהשיטה הראשונה מאפשרת מעקב טופוגרפי מתוחכם וכימות של היקף ההסתעפות, השנייה מאפשרת הדמיה מהירה של העץ הדנדריטי.

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את מידת ההסתעפות הדנדריטית בהיפוקמפוס של מודל עכבר. מטרה זו מושגת באמצעות שתי שיטות שונות. בשיטה הראשונה, הדנדריטים מתוחקים ידנית בזמן אמת לאורך כל העובי של כל חתך.בעקבות העקיבה, ניתן לשחזר ולנתח את כל העץ הדנדריטי. ניתן להשתמש בניתוח תרשימי מניפה של תרשימי מניפה שונים שהופקו מעכברים שונים כאמצעי השוואה אובייקטיבי. השיטה השנייה היא הדמיה של הסממנים הדנדריטיים באמצעות הדמיה בעומק שדה מורחב.לבסוף, נעשה שימוש בשיטה פנורמית כדי לתפור מספר תמונות בהגדלה גבוהה יחד, במטרה להפיק תמונת מרוכבת אחת ברזולוציה גבוהה להערכה איכותית וכמותית של דנדריטים בכל אזור העניין. הדגמה של הליך זה תבוצע באמצעות GI mobi. AMI research flows מהמעבדה שלי. היתרון המרכזי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות הוא קלות השימוש ומהירות הרכישה ואיסוף הנתונים.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון הערכה של dendritic ization באזורי מוח מושפעים, ובחינת ההשפעות של טיפולים שונים על הדנדריטים. בהליך זה, יום אחד לאחר קיבוע מוח העכבר ב-4%Paraform aldehyde, יש להניחו בתמיסת סוכרוז לצורך דהידרטציה למשך 48 שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. יש להוציא את המוחות מהסוכרוז ולהניחם ישירות על גבי בלוקי נחושת המונחים על קרח יבש.מלאו את הבלוק ב-OCT וסמנו את כיוון המוח באמצעות הבצל האולפקטורי (olfactory bulb) כנקודת ייחוס. חתכו סדרה של חתכים בעובי 70 micron בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס באמצעות קריוסטט, העבירו אותם לתמיסת Cryoprotectant ושמרו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לשימוש. דגרו את החתכים במי חמצן (hydrogen peroxide) במתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חממו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-TBS למשך חצי שעה.דגרו את החתכים עם 0.3%Triton וסרום סוס נורמלי למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר לפני הצביעה בנוגדן DCX למחרת. שטפו את החתכים שלוש פעמים ברצף ב-TBS ודגרו את החתכים עם נוגדן משני מסוס ביוטינילציה למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. שטפו את החתכים שלוש פעמים ברצף ב-TBS למשך 10 דקות בכל פעם ודגרו אותם עם B, C light למשך 1.5 שעות.בטמפרטורת החדר, הוסיפו מי חמצן לתמיסת ה-DAB והדגירו את החתכים מיד בתמיסה זו למשך חמש דקות, והפסיקו את התגובה על ידי שטיפה שלושה פעמים ב-TBS קר מאוד, ולאחריהן שטיפה אחת ב-TBS בטמפרטורת החדר. ייבשו את החתכים באמצעות סדרת תמיסות אתנול.חמש דקות בכל שלב, ב-clear וב-xylene, ולאחר מכן כיסוי בעזרת זכוכית כיסוי ו-DPX. לאחר שהחתכים התייבשו לחלוטין, נקה שאריות DPX ממשטחי הפלטות באמצעות להב חד והנח אותן אחת אחת על במת הסריקה של המיקרוסקופ. מערכת הוויזואליזציה מורכבת ממיקרוסקופ המצויד בידית בקרה (joystick) לבמת הסריקה ובמצלמה צבעונית של 12 ביט.בשלב הבא, הפעל את תוכנת neuro lucita ופתח קובץ נתונים חדש. הגדר נקודת ייחוס על המסך על ידי לחיצה בכל מקום עם סמן העכבר כדי להפעיל את כל האייקונים מפנל הכלים של חלון התוכנה. לאחר מכן, לחץ על אייקון ה-joystick free בסרגל הכלים והשתמש בג'ויסטיק כדי לאתר את ה-dentate gyrus של ההיפוקמפוס.בסעיף הראשון בלשונית הכלים (tools) של חלון התוכנית, בחרו בניהול חתכים סדרתיים (serial section manager). לחצו על סמל החתך החדש בפינה השמאלית התחתונה של החלון כדי לפתוח את חלון הגדרת החתכים הסדרתיים. לאחר מכן, בחרו בחלון הגדרת החתכים הסדרתיים והזינו את המספר הכולל של החתכים המכילים אזורים של ההיפוקמפוס.לאחר מכן, בחרו את מרווח ההערכה והזינו את עובי החתך. התחילו בשרטוט של אזור ה-dentate gyrus על ידי לחיצה על סמל שרטוט הקו החופשי (free hand contour drawing) בסרגל הכלים. לאחר מכן, התחמו את שכבת התאי הגרנולריים של ה-dentate.בחר 100x בתפריט ההגדלה. לאחר מכן, הוסף טיפה של שמן אימרסיה על הסרט והעבר את העדשה לאובייקטיב 100x. אתר את גופי התאים והדנדריטים של תאי הגרנולות בחושק השן (dentate gyrus) תחת עדשה זו.כעת, התמקדו בנוירון נבחר, ולחצו על סמל מעקב הנוירונים. בסרגל הכלים, עקבו אחר היקף גוף התא של תא הגרנולה בסיבוב השן (dentate granule cell). עם סיום העקיבה, לחצו קליק ימני כדי לבחור ב-"finish cell body".כעת התחילו לבצע מעקב ידני אחר הדנדריטים בכיווני X, Y ו-Z, ועקבו אחר כל ענף באמצעות הג'ויסטיק וכפתור מנוע ה-Z. בנקודת ביפורקציה (פיצול לשניים) או טריפורקציה (פיצול לשלושה), בחרו באפשרות המתאימה. מתוך התפריט הנפתח, עקבו אחר כל אחד מהענפים שנוצרים מצמתים אלו. בסוף כל ענף, לחצו לחיצה ימנית ובחרו ב"סיום" (ending) מהתפריט הנפתח.השתמשו באייקוני מקשי החיצים בחלון התוכנה. בחרו באופן אקראי תא גרנולר נוסף ב-dentate gyrus וחזרו על הליך העקיבה כפי שהודגם כעת. שמרו את כל העקיבה.כעת הפעל את NeuroLucita Explorer לצורך ניתוח נוירונים. פתח את קובץ ה-NRX הראשון מהעכבר הראשון של קבוצת הניסוי. הוסף את קובץ ה-NRX של העכבר השני מקבוצת הניסוי והמשך עד שכל קובצי ה-NRX מקבוצה זו יתווספו.תחת לשונית הניתוח (analysis), בחרו ב-fan in diagram כדי לפתוח את חלון ה-fan in analysis, סמנו ב-V את ה-dendrites ולחצו על display כדי להציג את הקשרים ודפוסי ההסתעפות של הדנדריטים עבור קבוצת עכברים זו. בהליך זה, חברו את המיקרוסקופ למצלמה דיגיטלית. הניחו סרט רקמה על במת הסריקה המחוברת למיקרוסקופ ועברו לעדשה עם הגדלה של 10x.בשלב הבא, העבירו את השולחן לאזור המעניין. הפעילו תוכנה להקלטת וידאו ולחצו על כפתור ההקלטה. מיד עם הלחיצה על כפתור ההקלטה, השתמשו בבורר המיקוד הגס כדי לנוע מחלקו העליון לחלקו התחתון של החיתוך למשך ארבע שניות בסך הכל. לפני שמירת קובץ הווידאו שנוצר, השתמשו בתוכנה החינמית Image J כדי להמיר את קובצי ה-VI לפורמט לא דחוס.הפעל תוכנה לניתוח תמונות ופתח את קובץ ה-VI. עבור לתפריט process ולחץ על extended depth of field. בחר את קובץ הווידאו המתאים באפשרויות הפלט (output options).בתוך אפשרויות ניתוח המיקוד, בחרו ב-generate composite best focus image. בחרו באפשרויות normalized illumination ו-max local contrast. לאחר מכן, לחצו על create כדי להפיק תמונה תוצאית, המייצגת את כל הפיקסלים הממוקדים לאורך ציר ה-Z.לאחר מכן, שמור את התמונה שהתקבלה. בשלב זה, הנח סגמנט על במת הסריקה המחוברת למיקרוסקופ. הזז את הבמה אל האזור המבוקש.לאחר מכן, הפעילו את תוכנת רכישת התמונות באמצעות עדשה של 10x, רכשו ושמרו תמונות ברזולוציה גבוהה מאזור העניין, תוך הקפדה על חפיפה של לפחות 10% בין התמונות. לאחר מכן, הפעילו את עורך תצלומי הפסיפס (image composite editor) כדי לתפור את התמונות. עברו לתפריט קובץ (file) ולחצו על פנורמה חדשה (new panorama).בחר את התיקייה שבה מאוחסרות התמונות. לאחר מכן, בחר את התמונות השייכות לאותו אזור ולחץ על אישור. לחץ על כפתור הייצוא לדיסק ושמור את התמונה.תמונה זו מייצגת תמונה ברזולוציה גבוהה ביותר של אזור העניין שניתן להשתמש בה לצורך ניתוח. איור זה מציג את הוויזואליזציה של הסתעפות דנדריטית עם ובלי שימוש בשיטות EDFI. השיטה המסורתית למציאת מישור המיקוד המיטבי הושוותה ל-EDFI, ונמצאו ערכים גבוהים משמעותית של שטח דנדריטי.בשימוש בשיטת ה-EDFI נמצאו התוצאות. הכמות של האורך והנפח שתופסים הדנדריטים בסדרי הסתעפות שונים מוצגת כאן. האורך והנפח המקסימליים הושגו בסדר הראשון.להלן היסטוגרמה של אורך הדנדריטים של תאי גרנולה בגיבנת השיניים. רוב המקטעים הדנדריטיים של DDRs שנצבעו ב-DCX היו באורך של 13 עד 26. קו זה, המסומן בנקודות אדומות, מתאר התפלגות נורמלית של הנתונים המוצגים בעקבות פרוצדורה זו.ניתן להשתמש בשיטות קלאסיות אחרות, כגון NeuroLucid, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לנפח ולשטח occupied על ידי הדנדריטים. טכניקה זו, שהצגנו כאן, תסייע רבות לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לא רק להעריך את המבנים הנוירונליים, אלא גם להעריך מבנים קטנים שאינם נוירונליים, כגון מיקרוגליה, בחתכים עבים של המוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את היקף ההשלחות הנוירונליות בפרק זמן קצר יחסית.

assessment-dendritic-arborization-dentate-gyrus-hippocampal-region

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

טכניקה לנתיחה להסרת gyrus משוננת מהעכבר הבוגרת תחת stereomicroscope הודגם פרוטוקול וידאו מוקלט זה.

Dissection של gyrus משוננת בהיפוקמפוס מתוך עכבר למבוגרים

אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי

כאן אנו מציגים פרוטוקול Golgi-Cox בפירוט רב. זו שיטה אמינה רקמת כתם מאפשר הערכה איכותית גבוהה של cytoarchitecture בהיפוקמפוס, ובכל רחבי המוח כולו, עם פתרון מינימלי.

הערכת המורכבות בהיפוקמפוס דנדריטי בעכברים בגילאים בשיטת Golgi-Cox

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

פרוטוקול זה מראה כיצד להגדיר שיטה אמינה מערכת קבצים הירארכית בעכברים. נוירונים ברחבי הכישור משוננת בהיפוקמפוס הם גירוי חשמלית על-ידי מערכת קבצים הירארכית ישירות ובעקיפין בתוך vivo. פעילות. עצבית והאיתות מולקולרית נבדקים על ידי c-פוס Notch1 immunofluorescent מכתים, בהתאמה; נוירוג'נסיס לכמת על-ידי bromodeoxyuridine תיוג וזמינותו.

שיטה פולשני עבור ההפעלה של הכישור משוננת העכבר על ידי גירוי בתדירות גבוהה

שיטה זו מתארת הכנה כרונית המאפשרת גישה אופטית להיפוקמפוס של עכברים חיים. הכנה זו יכולה לשמש לביצוע הדמיה אופטית לאורך של הפלסטיות הקונסטרוקטיבית העצבית ופעילות-מעורר פלסטיות הסלולר במשך תקופה של מספר שבועות.

אורך שני-פוטון הדמיה של CA1 היפוקמאל בעכברים חיים

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

הפרוטוקול מתאר שינוי של שיטת גולגי המהירה, אשר ניתן להתאים לכל חלק של מערכת העצבים, עבור הכתמת נוירונים בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם מצחית המדיאלית של החולדה.

כתם גולגי מהיר להדמיית עמוד שדרה דנדריטי בהיפוקמפוס וקליפת המוח הקדם-מצחית

הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס מבצעת תפקידים חיוניים ומובחנים בלמידה ובזיכרון. פרוטוקול זה מתאר סדרה של הליכים חזקים ויעילים להדמיית סידן in vivo של תאי גרגירים בבליטה המשוננת בעכברים הנעים בחופשיות.

In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים 

למד שתי שיטות לניתוח arborization דנדריטי בהיפוקמפוס של עכברים: מעקב בזמן אמת ודימות עומק שדה מורחב. השיטות מאפשרות מיפוי טופוגרפי מפורט והערכה כמותית של מורכבות דנדריטית במחקר נוירוביולוגי.

הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

גלה סרטונים נוספים