הערכה של דנדריטים arborization ברכס המשונן של האזור בהיפוקמפוס של עכברים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את היקף הארבוריזציה הדנדריטית בהיפוקמפוס של מודל עכבר. זה מושג בשתי שיטות שונות. בשיטה הראשונה, הדנדריטים עוקבים באופן ידני בזמן אמת לאורך כל העובי של כל קטע.

לאחר המעקב, ניתן לשחזר ולנתח את כל העץ הדנדריטי . באמצעות דיאגרמת המאוורר ניתן להשתמש בניתוח דיאגרמות מאווררים שונות שמקורן בעכברים שונים כאמצעי אובייקטיבי להשוואה. השיטה השנייה היא לדמיין ארבוריזציה דנדריטית עם הדמיית עומק שדה מורחבת.

לבסוף, נעשה שימוש בשיטה פנורמית לתפירת מספר תמונות בהגדלה גבוהה יחד כדי להניב תמונה מרוכבת אחת ברזולוציה גבוהה להערכה איכותית וכמותית של דנדריטים בכל אזור העניין והדגמה של הליך זה תהיה GI mobi. מחקר AMI נובע מהמעבדה שלי. היתרון העיקרי של טכניקות אלו על פני מתכות קיימות הוא קלות השימוש ומהירות הרכישה ואיסוף הנתונים.

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון הערכת דנדריטיזציה באזורי מוח מושפעים, והערכת ההשפעות של טיפולים שונים על דנדריטים. בהליך זה, יום אחד לאחר שמוח העכבר התקבע ב-4% אלדהיד פרפורם, הניחו אותו בתמיסת סוכרוז להתייבשות למשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את המוחות מהסוכרוז והניח אותם ישירות על גושי נחושת המונחים על קרח יבש.

מלאו את הבלוק ב-OCT וסמנו את כיוון המוח באמצעות פקעת הריח כציון דרך. חותכים חלקים בעובי 70 מיקרון ב-20 מעלות צלזיוס שליליות באמצעות קריוסטט ומניחים אותם בתמיסת Cryoprotectant ושומרים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. דגרו את החלקים במי חמצן במתנול למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן חיממו אותם ב-37 מעלות צלזיוס ב-TBS למשך חצי שעה.

דגרו את החלקים עם 0.3% טריטון וסרום סוס רגיל למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר לפני הצביעה בנוגדני DCX למחרת. שטפו את החלקים שלוש פעמים ברציפות ב-TBS ודגרו על החלקים עם אנטיגו סוס ביוטיניל למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. שטפו את החלקים שלוש פעמים ברציפות ב-TBS למשך 10 דקות כל אחד ודגרו אותם באור B, C למשך 1.5 שעות.

בטמפרטורת החדר, הוסף מי חמצן לתמיסת ה-DAB ודגר את החלקים מיד בתמיסה זו למשך חמש דקות וסיים את התגובה על ידי שטיפתם שלוש פעמים עם TBS קר כקרח ואחריו אחת. יש לשטוף ב-TT BS בטמפרטורת החדר. יבש את החלקים באמצעות סדרה של תמיסות אתנול.

חמש דקות כל אחת, שקוף וקסילן, ולאחר מכן מכסה החלקה באמצעות DPX. לאחר ייבוש מלא של החלקים, נקה עודפי DPX על משטחי ההחלקה בעזרת להב חד והנח אותם על שלב הסריקה של המיקרוסקופ בזה אחר זה. מערכת ההדמיה מורכבת ממיקרוסקופ המצויד בג'ויסטיק שלב סריקה ומצלמה צבעונית של 12 סיביות.

לאחר מכן, התחל את תוכנית נוירו-לוסיטה ופתח קובץ נתונים חדש. הצב נקודת התייחסות על המסך על-ידי לחיצה בכל מקום עם מצביע העכבר כדי להפעיל את כל הסמלים מלוח הכלים של חלון התוכנית. לאחר מכן לחץ על הסמל החופשי של הג'ויסטיק בסרגל הכלים והשתמש בג'ויסטיק כדי לאתר את הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס.

בחלק הראשון בכרטיסיית הכלים של חלון התוכנית, בחר מנהל המקטעים הסדרתי. לחץ על סמל המקטע החדש בפינה השמאלית התחתונה של החלון כדי לפתוח את חלון ההגדרה של המקטע הטורי. לאחר מכן, בחר את חלון הגדרת המקטע הטורי והזן את המספר הכולל של המקטעים המכילים אזורי היפוקמפוס.

לאחר מכן בחר את מרווח ההערכה והזן את עובי הקטע. התחל לעקוב אחר אזור הפיתול המשונן על ידי לחיצה על סמל ציור קווי המתאר ביד חופשית בסרגל הכלים. לאחר מכן מתאר את שכבת התאים הגרגירית המשוננת.

בחר 100 x מתפריט ההגדלה. לאחר מכן הוסף טיפה של שמן טבילה על החלק והחלף את המטרה ל-100 x. אתר את גופי תאי הגרגיר המשוננים והדנדריטים תחת מטרה זו.

לאחר מכן, התמקדו בתא עצב נבחר, ולחצו על סמל מעקב הנוירונים. בסרגל הכלים, עקוב אחר היקף גוף תא הגרגיר המשונן. בסיום המעקב, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור בגוף התא הסופי.

כעת התחל לעקוב אחר הדנדריטים באופן ידני וכיווני X, Y ו-Z, ועקוב אחר כל ענף באמצעות הג'ויסטיק וכפתור המנוע Z בצומת התפצלות או טריפורקציה, בחר באפשרות המתאימה. מהתפריט הנפתח, עקוב אחר כל אחד מהענפים הנובעים מהצמתים הללו בסוף כל ענף. לחץ לחיצה ימנית ובחר סיום מהתפריט הנפתח.

שימוש בסמלי מקשי החצים בחלון התוכנה. בחר באופן אקראי תא גרגיר משונן, וחזור על הליך המעקב כפי שהודגם זה עתה. שמור את כל המעקב.

עכשיו התחל את Neuro lucita Explorer לניתוח נוירונים. פתח את קובץ הנתונים הראשון של NRX מהעכבר הראשון של קבוצת הניסוי. צרף את קובץ ה-NRX של העכבר השני של קבוצת הניסוי והמשך עד שכל קבצי ה-NRX מקבוצה זו יצורפו.

תחת לשונית הניתוח, בחר מאוורר בדיאגרמה כדי לפתוח את המאוורר בחלון הניתוח, סמן דנדריטים ולחץ על תצוגה עבור הקישורים ודפוסי ההסתעפות של דנדריטים עבור קבוצת עכברים זו. בהליך זה, חבר את המיקרוסקופ למצלמה דיגיטלית. הנח קטע על שלב הסריקה המחובר למיקרוסקופ ועבור למטרה של פי 10.

לאחר מכן, העבירו את הבמה לאזור העניין. הפעל תוכנית לכידת וידאו ולחץ על כפתור ההקלטה. ברגע שלוחצים על כפתור ההקלטה, השתמש בכפתור מיקוד המאקרו כדי לעבור מהחלק העליון לתחתית הקטע למשך ארבע שניות בסך הכל לפני שמירת קובץ הווידאו שהתקבל, השתמש כעת בתוכנה חופשית של Image J כדי להמיר את קבצי הווידאו A VI לפורמט לא דחוס.

הפעל תוכנית ניתוח תמונות ופתח את קובץ VI. עבור לתפריט התהליך ולחץ על עומק שדה מורחב. בחר את קובץ הווידאו המתאים באפשרויות הפלט.

בחר צור תמונה מורכבת עם המיקוד הטוב ביותר באפשרויות ניתוח המיקוד. בחר אפשרויות תאורה מנורמלת וניגודיות מקומית מרבית. לאחר מכן לחץ על Create כדי ליצור תמונה שמייצגת את כל הפיקסלים הממוקדים לאורך ציר Z.

לאחר מכן, שמור את התמונה שהתקבלה. בשלב זה, הנח קטע על שלב הסריקה המחובר למיקרוסקופ. העבר את הבמה לאזור העניין.

לאחר מכן התחל את תוכנית רכישת התמונות באמצעות מטרה של פי 10, רכוש ושמור תמונות ברזולוציה גבוהה מאזור העניין, וודא שיש לפחות 10% חפיפה בין התמונות. לאחר מכן הפעל את עורך התמונות המורכבות כדי לתפור את התמונות לאחר מכן. עבור לתפריט קובץ ולחץ על פנורמה חדשה.

בחר בתיקייה שבה מאוחסנות התמונות. לאחר מכן, בחר את התמונות השייכות לאותו אזור ולחץ על אישור. לחץ על כפתור ייצוא לדיסק ושמור את התמונה.

תמונה זו מייצגת תמונה ברזולוציה גבוהה במיוחד של אזור העניין שיכול לשמש לניתוח. איור זה מציג את ההדמיה של ארבוריזציה דנדריטית עם ובלי שיטות EDFI. השיטה המסורתית למציאת מישור המיקוד הטוב ביותר הושוותה ל-EDFI וערכים גבוהים משמעותית של שטח דנדריטי.

בשיטת EDFI נמצאו. כימות האורך והנפח שתופסים דנדריטים בסדרי הסתעפות שונים מוצג כאן. האורך והנפח המקסימליים הושגו בהזמנה הראשונה.

להלן היסטוגרמה של האורך הדנדריטי של תאי גרגיר משוננים. רוב הקטעים הדנדריטיים של כתמי DCX DDRs היו באורך של 13 עד 26. קו מקווקו אדום זה מתאר התפלגות נורמלית של הנתונים המוצגים בעקבות הליך זה.

שיטות קלאסיות אחרות כמו נוירו-לוסיד יכולות לשמש כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לנפח ולשטח שתופסים הדנדריטים. הטכניקה הזו שהראינו לכם כאן תסייע מאוד לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לא רק להעריך את המבנה העצבי, אלא גם להעריך מבנים קטנים שאינם עצביים כמו מיקרוגליה במקטעי מוח עבים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את היקף ההקרנות העצביות בפרק זמן קצר יחסית.