Name: Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: למדו שיטת MALDI-TOF לזיהוי בו-זמני של תכונות מפתח ביתושי מלריה, כולל עמידות לחומרי הדברה וזיהוי מין. שיטה זו משפרת את הבנת הדינמיקה של העברת המחלה ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות בקרה יעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. אנתוני קורנל ולורה נוריס בUC Davis וד&quot;ר Katharina Kreppel באוניברסיטת גלזגו למתן דגימות יתושים מטנזניה. אנו מודים לגב &#39;Smita Das וד&quot;ר דאגלס נוריס מבית הספר לג&#39;ונס הופקינס לבריאות הציבור לשיתוף דגימות יתושים מזמביה. כמו כן, אנו מודים למר לי V. millon במעבדה לגנטיקה וטרינריים להכשרה בעיצוב assay. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק R01AI 078,183 וR21AI062929.

1. PCR הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל צבעי יסוד PCR (ראה טבלת S1 המשלים) בmicrotube 1.5ml. לכל אחד יש שני SNP פריימרים (קדימה ואחורה). ודא שהמניה הריכוז של כל צבע יסוד PCR נשמר ב 100 מיקרומטר. לעשות מספיק תערובת פריימר ל500-1,000 תגובות להפחית pipetting שגיאה וזמן על הספסל (ראה טבלת S2 המשלים). אם תרצה, להכין aliquots ל100-200 תגובות לכל צינור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קוקטייל PCR, כמתואר בפרוטוקול של היצרן (טבלת 1). הנפח 96 תגובות כולל הסככה של 20%. מערבולת הצינור המכיל קוקטייל PCR קל ו צנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 3 μl של קוקטייל PCR לבאר כל הלא עקף 96 צלחת גם. פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של הדנ&quot;א הגנומי המתאים של יתושים בכל טוב. הערה: תהליך קבלת הדנ&quot;א הגנומי ממ &#39;<html> רקמות osquito (ראש / חזה, בטן או כל גוף) מתוארות בספרויות אחרות 29-32. בחר פרוטוקול מיצוי DNA מתאים כדי לבדל את אלה עם Plasmodium בדם (הבטן) מיתושים מזהמים (Plasmodium בראש / החזה). אנחנו בדרך כלל להשתמש ב- DNA שחולץ מחלקי גוף (ראש / חזה או בבטן) של יתושים, כך ריכוז ה- DNA משתנה מ0.05-2ng / μl. למרות שסכתי תשומת DNA היא נמוכה מהמלצת היצרן (5-10ng / rxn), אנחנו בדרך כלל מקבלים SNP חזק קורא מ -98% מהדגימות DNA בלי ההגברה הגנום כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משתמש בפרוטוקול thermocycler הבא כדי לבצע PCR הגברה: (1) 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, (2) 94 ° C למשך 30 שניות, (3) 56 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, (4) 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 , (5) חזרו על שלב (2) - (4) במשך 45 מחזורים, (6) 72 מעלות צלזיוס במשך דקות 1, ו -4 אחיזת מעלות צלזיוס. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. SAP טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון אנזים SAP בצלחת גם 96 (ראה טבלה 2). לעבד 96 דגימות בצלחת. הנפח 96 תגובות כולל הסככה של 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הצינור של פתרון SAP אנזים קל ו צנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x. לוותר על 2 μl של פתרון אנזים SAP לכל אחד. שוב, פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם. דגירה את הצלחת באופן הבא: (1) 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות, (2) 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית את האנזים, (3) אחיזת C 4 מעלות. בסיום שלב זה, לאחסן את הצלחת ב -20 ° C לפני שתמשיך. לעבד את הצלחת מאוחסנת בתוך 2 שבועות. </li></ol> 3. SNP Extension <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צלחת המדגם היא קפוא לאחר טיפול SAP, לאפשר לו להפשיר לRT לפני שנמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת פריימר הארכה (נוסף הטבלה S2). לכל אחד יש SNP exte אחדפריימר nsion. שמור את מניית הריכוז של כל צבע יסוד הארכה ב -500 מיקרומטר. לחלופין, aliquot ל100-200 תגובות לכל צינור ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת הארכה כמפורט בטבלה 3. 96 תגובת כרך כולל הסככה של 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הצינור של קוקטייל סיומת קלה וצנטריפוגות במשך 30 שניות ב2,000 g x. לוותר על 2 μl של קוקטייל הארכה לכל אחד. שוב, פיפטה מהדר יכולה לחסוך זמן לתהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת, לערבב בעדינות או מערבולת, ו צנטריפוגות 1 דקות ב370 x גרם. Thermocycle הצלחת כפי שמוצג באיור 1. בשלב זה, להמשיך לספקטרומטר מסה או לאחסן את הצלחת ב -20 ° C עד 2 שבועות. </li></ol> 4. אוויר המוצרים הרחבה SNP לייעל ניתוח ספקטרומטריית המסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צלחת המדגם היא קפוא לאחר הארכה SNP, לאפשר לו להפשיר לRT לפני שנמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 15mg של שרף מcontainer לצלחת הגומה באמצעות כף מוארכת. השתמש במגרד להפיץ שרף לתוך הבארות של צלחת הגומה. לטאטא את המגרד מצד לצד פני צלחת הגומה כדי להפיץ את השרף. ודא שיש שרף בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד שרף עודף מצלחת הגומה באמצעות המגרד. בואו השרף עומד בצלחת הגומה לפחות 20 דקות. בעת נותנת השרף עומד בצלחת הגומה, להוסיף 41 μl מים כיתה HPLC היטב בכל צלחת המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח בעדינות את צלחת מדגם הפוכה, לצלחת הגומה. ודא המדגם מתאפס צלחת נגד הפוסט הקטן המעוגל של צלחת הגומה, שמיישר את הבארות בצלחת המדגם עם הבארות בצלחת הגומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק צלחת המדגם וצלחת הגומה יחד, בעדינות להעיף אותם מעל כל כך השרף נופל מצלחת הגומה לתוך הבארות של צלחת המדגם. הקש על צלחת הגומה כך השרף נופל לתוך צלחת המדגם. ודא שכל השרף בdi<html> צלחת mple נופלת לתוך בארות צלחת מדגם. צנטריפוגה את הצלחת ב3,200 XG למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צלחת המדגם על הכתף במשך 5 דקות בRT. Rotator חייב לסובב את צלחת המדגם של 360 מעלות על ציר הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחת המדגם ב3,200 XG במשך 5 דקות. לאחר שלב זה, לאחסן את צלחת המדגם ב -20 ° C עד 2 שבועות לפני שתמשיך לשלב הבא. </li></ol> 5. MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מוצר הארכת SNP המותנה על bioarray כגון SpectroCHIP לפי הוראות יצרן. אנו משתמשים בMassArray Nanodispenser לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שההעברה תסתיים, להגדיר כיצד מבחני וצלחות שיוקמו באתר assay. שם assay וצלחות כאלה שיש לכל צלחת מזהה ייחודי שמקשר לעיצוב assay הספציפי (משלימה לוח S3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר assay והצלחת הוגדרו, לרכוש ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מסה. </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת פרשנות נתונים בזמן אמת ניתוח PCR כמו Typer Analyzer או TyperViewer (Sequenom). לקבל נתונים ב.xml פורמט המכיל את פריסת המדגם, ספקטרוגרמה המונית לכל טוב, מידע הסמן כוללים שם, המוני צפוי לכל גרסה של SNP המקביל, וכל טעות או הודעות אזהרה הקשורים לכל תגובה. ראה איור 2 לספקטרוגרמה מסה וכתוצאה מכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח אשכולות גנוטיפ SNP על ידי קביעת סף הגילוי (גודל או יחס אות לרעש) וסובלנות / שונות אפשר לכל גנוטיפ. איור 3 מציג דוגמא של 04,707 #-KDR 2 אשכולות גנוטיפ SNP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את שיחות גנוטיפ SNP וכתוצאה מכך לתכנית גיליון אלקטרוני. </li></ol>

<ol><li>Ayala, F. J., Coluzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+speciation%3A+humans%2C+Drosophila%2C+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).</li>
<li>Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+African+malaria+mosquitoes+belonging+to+the+Anopheles+gambiae+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex.</a> Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).</li>
<li>Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+ribosomal+DNA+polymorphisms+discriminating+among+chromosomal+forms+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).</li>
<li>Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+identification+of+species+and+molecular+forms+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+PCR-RFLP%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Vet+Entomol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP.</a> Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+reveal+discrepancies+among+results+of+commonly+used+methods+for+Anopheles+gambiae+molecular+form+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification.</a> Malar J. 10, 215(2011).</li>
<li>Santolamazza, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+polymorphisms+of+SINE200+retrotransposons+within+speciation+islands+of+Anopheles+gambiae+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms.</a> Malar J. 7, 163(2008).</li>
<li>Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+report%3A+A+new+polymerase+chain+reaction-restriction+fragment+length+polymorphism+method+to+identify+Anopheles+arabiensis+from+An.+gambiae+and+its+two+molecular+forms+from+degraded+DNA+templates+or+museum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples.</a> Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. , (2013).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction.</a> Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+of+physically+unlinked+islands+of+genomic+divergence+in+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).</li>
<li>Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+biased+co-transmission+of+speciation+islands+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).</li>
<li>Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+multiplex+SNP+genotyping+assay+for+detecting+hybridization+and+introgression+between+the+M+and+S+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).</li>
<li>Reimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+kdr+mutation+and+resistance+to+pyrethroid+and+DDT+insecticides+in+natural+populations+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).</li>
<li>Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kdr+mutation+occurs+in+the+Mopti+form+of+Anopheles+gambiae+s.s.+through+introgression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression.</a> Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).</li>
<li>Tripet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+survey+of+knockdown+resistance+to+pyrethroid+%28kdr%29+in+Mali%2C+West+Africa%2C+and+evidence+of+its+emergence+in+the+Bamako+form+of+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s.</a> Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).</li>
<li>Martinez-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+pyrethroid+knockdown+resistance+%28kdr%29+in+the+major+malaria+vector+Anopheles+gambiae+s.s%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s.</a> Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).</li>
<li>Diabate, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDR+mutation%2C+a+genetic+marker+to+assess+events+of+introgression+between+the+molecular+M+and+S+forms+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+the+tropical+savannah+area+of+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa.</a> J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).</li>
<li>Chandre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+distribution+of+a+pyrethroid+resistance+gene+%28kdr%29+in+Anopheles+gambiae+complex+from+west+Africa+and+further+evidence+for+reproductive+isolation+of+the+Mopti+form%5BTitle%5D)+AND+%22Parassitologia%22%5BJournal%5D)">Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form.</a> Parassitologia. 41, 319-322 (1999).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+anthropophily+in+the+potential+secondary+malaria+vectors+Anopheles+coustani+s.l.+and+Anopheles+squamosus+in+Macha%2C+Zambia%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).</li>
<li>Snounou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+of+detection+of+human+malaria+parasites+by+the+use+of+nested+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+biochemical+parasitology%22%5BJournal%5D)">High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction.</a> Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).</li>
<li>Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genus-+and+species-specific+nested+polymerase+chain+reaction+malaria+detection+assay+for+epidemiologic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies.</a> Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).</li>
<li>Oyedeji, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR-based+detection+of+Plasmodium+falciparum+infections+based+on+single+and+multicopy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes.</a> Malar J. 6, 112(2007).</li>
<li>Gama, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+versus+conventional+PCR+for+malaria+parasite+detection+in+low-grade+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+parasitology%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia.</a> Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22B.+Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome.</a> B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Fornadel, C. M., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+endophily+by+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis+in+southern+Zambia+and+identification+of+digested+blood+meals%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals.</a> Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).</li>
<li>Teeter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+genomic+architecture+of+isolation+between+hybridizing+species+of+house+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice.</a> Evolution. 64, 472-485 (2010).</li>
<li>Han, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+survival+in+small-cell+lung+cancer+patients+treated+with+irinotecan+plus+cisplatin+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+pharmacogenomics+journal%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy.</a> The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).</li>
<li>Chakraborti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+polyethyleneimine-functionalized+ZnO+nanoparticles+with+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).</li>
<li>Marsden, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+differentiation%2C+and+linkage+disequilibrium%3A+prospects+for+association+mapping+in+the+malaria+vector+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis.</a> G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).</li>
<li>Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from:
 <a target="_blank" href="
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx">
 http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx</a> 1725-1732 (2010).</li>
<li>Tripet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+analysis+of+transferred+sperm+reveals+significant+levels+of+gene+flow+between+molecular+forms+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).</li>
<li>Slotman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+subdivision+within+the+M+molecular+form+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae.</a> Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).</li>
<li>Basu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+Spectrometry+is+More+Sensitive+Than+PreTect+HPV-Proofer+and+Consensus+PCR+for+Type-Specific+Detection+of+High-Risk+Oncogenic+HPV+Genotypes+in+Cervical+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer.</a> J Clin Microbiol. , (2011).</li>
<li>Fu, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassARRAY+assay%3A+a+more+accurate+method+for+JAK2V617F+mutation+detection+in+Chinese+patients+with+myeloproliferative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders.</a> Leukemia. 22, 660-663 (2008).</li>
<li>Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+using+the+Sequenom+MassARRAY+iPLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform.</a> Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).</li>
<li>Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+MassARRAY+technology+for+high+throughput+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).</li>
<li>Wright, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+MassARRAY+spectrometry+%28iPLEX%29+produces+a+fast+and+economical+test+for+56+familial+hypercholesterolaemia-causing+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations.</a> Clin Genet. 74, 463-468 (2008).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+islands+of+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae.</a> PLoS Biol. 3, e285(2005).</li>
<li>Turner, T. L., Hahn, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-population-specific+selection+and+differentiation+between+incipient+species+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae.</a> Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).</li>
<li>Stump, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-proximal+differentiation+and+speciation+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+for+high-throughput+genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa.</a> J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).</li>
<li>Holt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Science. 298, 129-149 (2002).</li>
<li>Lawniczak, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+divergence+between+incipient+Anopheles+gambiae+species+revealed+by+whole+genome+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences.</a> Science. 330, 512-514 (2010).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מד&quot;א מורכב מחמישה שלבים עיקריים: הגברה PCR, תגובת phosphatase אלקליין השרימפס (SAP), הארכת SNP, מוצר הארכת אוויר, וdesorption / יינון לייזר בסיוע מטריקס - זמן טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסת 33-37. צעד ההגברה PCR הראשון מגביר DNA איגוף כל SNP כך שתבנית ה- DNA מספיק יהיה זמין בשלב הארכת SNP. תגובת SAP מנטרלת dNTPs שאינו בשימוש אשר יכול להפריע לצעד הארכת SNP הבא. הארכת SNP כרוכה פריימר ארכה אחת למוקד SNP ונוקלאוטידים שליחות קטלנית-שונה המוניות. נוקלאוטידים שונה 3&#...

arabiensis אנופלס, coluzzii אנופלס ואנופלס gambiae הם הווקטורים העיקריים האחראים להעברת מלריה באפריקה 1. שלושת מינים אלה הם מורפולוגית נבדלו 2 וניתן להבחין רק במבחנים מולקולריים 3-9. בנוסף, יש מבחני במורד הזרם רבים שנערכו באופן שגרתי כדי לסייע מחקרים אפידמיולוגיים וגנטיקת אוכלוסייה. אלה כוללים (1) assay genotyping לאיי התפצלות 10-12, (2) assay genotyping הכרת SNPs שאינו שם נרדף ב1,014 ה עמדת חומצת אמינו קודון של גן para (ההתנגדות לדפוק למטה, או kdr, SNP) 13 -18, (3) גילוי טפיל PCR 19-23, ו- (4) להקרנת DNA מארח ספציפי בmidguts יתוש 24,25. פיתחנו assay רב-זיהוי (מד&quot;א) שמשלב את כל מבחני הללו לתגובה זמנית בודדת במטרהalyzing מאפיינים חשובים אפידמיולוגיה של מלריה באפריקה. Assay מד&quot;א כולל סמנים מרובים לאיתור (1) מין (arabiensis א, א gambiae, coluzzii א, או אחר (אף אחד משלוש)), (2) התנגדות החרקים המיוצגות בkdr SNPs (שני L1014F וL1014S) , (3) נוכחות של שני טפילי מלריה עיקריים, Plasmodium falciparum וP. vivax, ו- (4) מקור דם מעופות אחד ושישה מארחי יונקים. באופן מסורתי, אלה מבחני נערכו בתגובות נפרדות שרשרת של פולימראז. כאשר כל אלה מבחני נעשים באמצעות פלטפורמת PCR קונבנציונלית, זה מחייב ביצוע 8-10 מבחני תגובת PCR ומלווה את צעדי ג&#39;ל אלקטרופורזה. כל תגובת PCR בודדת מהכנה לתוצאות תיעוד לוקחת 4-5 שעות, ואילו שיטת מד&quot;א שהוצגה כאן לוקחת בערך 5 שעות במכלול. זה שווה חיסכון של 90% בעלויות עבודה לבד. מד&quot;א שהוצג כאן עולה 5 $לדגימה לגנוטיפ כל 33 SNPs. זה הרבה פחות יקר מאשר מבחני בודדים agarose מבוסס ג&#39;ל, שעולים כ $ 1.50 לכל מדגם. מבחני איתור כל המאפיינים מכוסים על ידי מד&quot;א ידרשו מינימום של 8-10 מבחני מבוססי ג&#39;ל agarose נפרדים במחיר של 12-15 דולרים למדגם. יתר על כן, מד&quot;א מקטין באופן משמעותי את הסיכוי ליצירת שקר חיובי או שלילי על ידי שימוש בלפחות שלושה סמנים לכל גילוי טפיל או מקור מארח. הפלטפורמה שנוצלנו אינה מוגבלת למלריה, אבל ניתן להשתמש במגוון רחב של יישומים, כגון רפואה, רפואת וטרינרית, וביולוגיה בסיסית 26-28. במחקרים מעמיקים עמותה או גנטיקה של אוכלוסיות המחקרים שכללו מספר רב (לפי סדר 100s) של דגימות דורשים הקרנת מבחני עלות-תועלת לסמנים מרובים בו זמנית. רוב המחקרים שעושים שימוש בשניים או יותר מבחני PCR נפרדים יכולים ליישם את מד&quot;א לתוצאות מהר יותר בעלות נמוכה יותר. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>MassARRAY Analyzer Compact</td><td>Sequenom</td><td>MT9</td><td>MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה ליישומים גנומיים לניתוח חומצות גרעין.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodispenser</td><td>Sequenom</td><td>RS1000</td><td>מעביר מוצרי תגובת iPLEX שהושלמו ל-SpectroCHIP</td></tr><tr><td>iPLEX Gold Genotyping Reagent</td><td>Set Sequenom</td><td>10158</td><td>Reagent המשמש לבדיקת iPLEX כולל ערכת SAP.</td></tr></tbody></table>

assay multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

מתחם מיני אנופלס gambiae כולל המלריה העיקרית העברת יתושים באפריקה. כי מינים אלה הם בעלי חשיבות רפואית כגון, כמה תכונות הן בדרך כלל מאופיינות באמצעות מבחני מולקולריים לסיוע במחקרים אפידמיולוגיים. תכונות אלה כוללות זיהוי מינים, התנגדות חרקים, מצב זיהום טפיל, והעדפת מארח. מאז אוכלוסיות של מתחם אנופלס gambiae הן מורפולוגית נבדלו, תגובת שרשרת של פולימראז (PCR) משמשת באופן מסורתי לזיהוי מינים. ברגע שהמינים ידוע, כמה מבחני במורד הזרם מבוצעים באופן שיגרתי על מנת להבהיר מאפיינים נוספים. למשל, מוטציות הידועות כKDR בגן para להקנות עמידות נגד DDT וחומרי הדברה pyrethroid. בנוסף, מבחני צמודי אנזים immunosorbent (ELISAs) או מבחני PCR לגילוי DNA הטפיל Plasmodium המשמשים לאיתור טפילים הנמצאים ברקמות יתושים. לבסוף, combination של PCR ומעכל אנזים הגבלה ניתן להשתמש כדי להבהיר העדפת מארח (למשל, אדם לעומת דם בעלי חיים) על ידי הקרנת bloodmeal היתושים לDNA מארח ספציפי. פיתחנו assay רב-זיהוי (מד&quot;א) שמשלב את כל מבחני הנ&quot;ל ל33SNPs genotyping התגובה זמנית יחיד עבור 96 או 384 דגימות בכל פעם. בגלל מד&quot;א כולל סמנים מרובים עבור מינים, זיהוי Plasmodium, וזיהוי דם מארח, הסבירות ליצירת תוצאות חיוביות או שליליים שגויות מופחתת במידה ניכרת ממבחנים קודמים הכוללים סמן אחת בלבד לכל תכונה. assay חזק וזה פשוט יכול לזהות תכונות יתוש מפתח אלה חסכוניים ובשבריר של הזמן של מבחני קיימים.

זיהוי מינים: 5 SNPs הבא ביחד לזהות שלושה מינים (arabiensis א, א coluzzii וא gambiae) (לוח 4). אם מדגם הוא לא אחד משלושת המינים, שלושה SNPs (01,073-213, 04,679-157 ו10313 -052) לא מצליחים להגביר. גנוטיפ kdr כדי להסיק מסקנת התנגדות קוטל חרקים: <p class="jove_content" style=";text-align:right...

ליתושים המעבירים מלריה יש מספר מאפיינים חשובים מבחינה אפידמיולוגית שניתן לזהות רק באמצעות טכניקות מולקולריות. תוך שימוש בפלטפורמת גנוטיפ SNP מבוססת MALDI-TOF, פיתחנו בדיקה לזיהוי בו-זמנית של תכונות מפתח מרובות (מינים, עמידות לקוטלי חרקים, זיהום טפילים ובחירת מארח) של וקטורים למלריה.

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

a-multi-detection-assay-for-malaria-transmitting-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי...

פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

סרטון זה מדגים בדיקת האכלת דם כדי להעריך את התמותה והפוריות של תרכובות בדיקה עם דרכי פעולה חדשות על נקבות יתושים. טכניקה זו מסייעת בסינון סוגים חדשים של קוטלי חרקים כדי להרוג את האוכלוסייה העמידה של יתושים ולשלוט בהתפשטות מחלות.

בדיקת האכלת יתושים: שיטה להערכת השפעות תרכובת הבדיקה על תמותה וצואה של יתושים בוגרים

בעוד ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה מציע את היכולת להבחין בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד באוכלוסייה הטרוגנית, הטיה ההגברה אלל מוטנטי יכולה להגדיל את יכולתה לזהות אללים נוכחים באחוזים נמוכים יחסית בתוך מדגם. פרוטוקול זה מתאר שיפורים המשפרים את הרגישות של ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה.

שיטות כדי להגדיל את הרגישות של רזולוציה גבוהה התכה יחידה נוקלאוטיד פולימורפיזם Genotyping במלריה

בשל הדמיון הבולט של מחזור החיים ביולוגיה של טפילים מלריה מכרסמים לטפילים מלריה אדם, מודלים מלריה מכרסם הפכו חיוניים למחקר מלריה. בזאת, אנו מתוקננת כמה מן הטכניקות החשובות ביותר בשימוש בניתוח פנוטיפ של פראי סוג ומלריה מכרסם הטרנסגניים.

ניתוח פנוטימית של מלריה מכרסם טפיל מינית ושלבי דם מיניים ושלבי יתוש

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

פרוטוקול זה מספק את השלבים החל מיצוי DNA ועד לערך ניסיוני עבור PCR טיפה דיגיטלית (ddPCR), כולל ניתוח לזיהוי וכימות של אירועי הצטרפות קצה לא הומולוגיים (NHEJ) באתרי יעד לאחר מחשוף Cas9 המושרה על ידי gRNA ותיקון DNA. שימושים אחרים בשיטה זו כוללים יישומים כגון זיהוי פולימורפיזם ואימות וריאנט עריכת גנים.

PCR טיפה דיגיטלית כדי לזהות מוטציות indels באוכלוסיות יתושים אנופלין מהונדס גנטית

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

בדיקת הזנת הממברנה הסטנדרטית (SMFA) נחשבת לתקן הזהב להערכה וזיהוי של תרכובות פוטנציאליות נגד מלריה. מערכת האכלה מלאכותית זו משמשת להדבקת יתושים כדי להעריך עוד יותר את ההשפעות של תרכובות כאלה על העוצמה והשכיחות של טפיל פלסמודיום falciparum .

בדיקת הזנת ממברנה סטנדרטית לזיהוי זיהום פלסמודיום פלציפרום בווקטורים של יתושים אנופלס

בדיקות אימונולוגיות פלואורסצנטיות מרובות הופכות להתייחסות לבדיקות סרולוגיות. היישום שלהם, לעומת זאת, מוגבל על ידי המורכבות ותהליכי הצימוד הגוזלים זמן. דוח זה מציג פרוטוקול צימוד חרוזים מיקרוספירה מרובה אוטומטי למחצה הניתן לשחזור הניתן לשחזור הניתן לשחזור הניתן להשוואה לשיטה הסטנדרטית תוך קיצור משמעותי של זמן התוצאות.

בדיקה סרולוגית מולטיפלקס לאיתור תגובות נוגדנים לארבו-וירוסים

למדו שיטת MALDI-TOF לזיהוי בו-זמני של תכונות מפתח ביתושי מלריה, כולל עמידות לחומרי הדברה וזיהוי מין. שיטה זו משפרת את הבנת הדינמיקה של העברת המחלה ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות בקרה יעילות.

Assay Multi-זיהוי ליתושי מלריה העברה

גלה סרטונים נוספים