Name: ניסוי הגלאוקומה נגרמת על ידי הזרקת Ocular של מיקרוסכמות מגנטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: חקור מודל גלאוקומה בחולדות באמצעות הזרקת מיקרוספירות מגנטיות לחדר העין הקדמי. שיטה זו מייצרת עלייה מתמשכת בלחץ תוך-עיני ומאפשרת מחקר ממושך של נזק לתאי גנגליון רטינליים וניוון עצב הראייה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לדוקטור פיטר מונרו על עזרתו בחתך עצב הראייה. מחקר זה נתמך על ידי המועצה למחקר רפואי (G0901303), ובחלקו על ידי פרס דורותי הודג'קין לתואר שני/מועצת המחקר הרפואי, קרן הלן המלין, Fight for Sight ו-Moorfields Special Trustess.

הצהרת אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים שנערכו בהתאם לועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC), ואושרו בהסכם עם הנחיות משרד פן בריטניה <a href="http://goo.gl/FLkirW" target="_blank">(http://goo.gl/FLkirW,</a> גישה 10 ביוני האחרון , 2014) והצהרת Arvo לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר Vision <a href="http://goo.gl/4LFOjD" target="_blank">(http://goo.gl/4LFOjD,</a> הגישה האחרונה 10 ביוני, 2014). 1. Ocular Hypertension אינדוקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לגלאוקומה ניסיונית על ידי הרמת לחץ התוך עיני (IOP) באמצעות הזרקה חד-צדדית של microspheres פאראמגנטיים לתוך התא הקדמי של חולדות בראון נורבגיה, המבוסס על השיטה של et al Samsel. 3 חולדות פיגמנט אחרות עשויות להיות מתאימות, אם כי אלה היו צריכים להיות מאומתים ראשון על ידי המשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבת g 250-300 הביתחולדות לשעבר מגדל בראון נורבגיה במתמדת תאורה נמוכה סביבה (40-60 סוויטה דה לוקס) כדי למזער את התנודות יומי בלחץ התוך העיני 7, עם גישה כלרצונך מזון ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקחת מידות IOP בסיסיות בבעלי חיים ער 8 לפני ההרדמה והזרקת חרוז, באמצעות tonometer ריבאונד מכויל לשימוש בעיני העכברוש 9. IOP הוא נלקח כממוצע של חמש קריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש חולדות עם 37.5 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין, ו0.25 מ&quot;ג / קילוגרם medetomidine hydrochloride נמסר intraperitoneally. לאשר עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקסים הרגל האחורית של החיה, לפני Povidone יישום יוד (ראה שלב 1.5), והזרקת חרוז (ראה שלב 1.8). לנהל 0.5% hydrochloride proparacaine לשיכוך כאבים. הערה: אל להרחיב את התלמיד בכל שלב. זה יעזור לי חרוזים להתיישב טובים יותר לזווית iridocorneal, ולמנוע מחייבים את העדשה. החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של קרנית בעין הנגדית המופעל un. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Wאפר עין האופרטיבית עם 5% יוד povidone במים 10 דקות 5 לפני הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות, פתיל יוד povidone את השימוש בגזה סטרילית, ולשטוף את העיניים עם 0.9% תמיסת מלח סטרילית. שמור את העיניים לחות במהלך הרדמה עם יישום רגיל של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מגנט טבעתי סביב העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 25 μl של תמיסה המכילה 30 מ&quot;ג / מיליליטר של גמא-הקרנה מעוקרת 8 מיקרומטר microspheres המגנטי בתמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ללשכה הקדמית, באמצעות מחט משופעת 33 G. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין חרוזים, לשטוף מחדש על ידי מתלים, אז צנטריפוגה 3 פעמים ב10,000 XG למשך 5 דקות עם 1 מיליליטר HBSS, לפני קבלת 30 מ&quot;ג / מיליליטר הפתרון הסופי. לשמור על תנאים סטריליים לאורך כל דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקה, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת המחט לאיריס, כדי למזער את הסיכון של טראומת קשתית. זה ניתן למנוע על ידי orientating המחט משיקה למשטח קרני, כמקביל לאיריס ככל האפשר. זה גם יעזור לי כדי להקטין את איבוד חרוז מאתר ההזרקה. הערה: הזרק חרוזים בקצב מהיר כדי להבטיח חלוקה שווה סביב זווית iridocorneal, שהוא קריטי להעלאת לחץ תוך עיני. בנוסף, חרוזים חנות, מחטים וטבעות מגנטיות בנפרד, כך שהחרוזים לא יוצרים אשכולות, מה שהופך אותם קשה לטעון לתוך המזרק ולהזריק, והמחט אינה הופכת להיות ממוגנטת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המחט במקום 1 דקות לאחר הזרקה על מנת להבטיח כי חרוזים להתיישב לתוך זווית iridocorneal לעכב ניקוז המימי מmeshwork trabecular. מעט זווית המחט לאחר חרוזים יש בתחילה התיישבה כדי לאפשר זליגה מסוימת של מימית, כדי למזער את העלייה חולפת בלחץ התוך עיני. בסופו של הניתוח לשטוף את המחט דרך עם פוספט הראשון שנאגרו (PBS), ולאחר מכן 70% אתנול, ואחריו מים מזוקקים, על מנת להבטיח את משך שימוש במחט בהליכים נפרדים. לחלופין, אפשר להשתמש במחטים חד פעמיות אם שילוב מד והמזרק הנכון זמין. אופציונליות: מחטים עשויות להיות מחודדות באמצעות beveller להאריך את השימוש בם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה במידת צורך, להסיר את המגנט, ולהשתמש בו כדי לצייר חרוזים לתחומי כיסוי חלקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המגנט במקום סביב העין ללאחר הזרקה 10 דקות נוספת כדי להבטיח חרוזים להתיישב גם לזווית iridocorneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדמה הפוכה באמצעות 0.25 מ&quot;ג / קילוגרם hydrochloride atipemezole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל כלורמפניקול, או משחה אנטיביוטית אחרת, למשל gentamycin או טרמיצין topically כדי למנוע זיהום, ושל 0.5% hydrochloride proparacaine לשיכוך כאבים. השאר בעלי חיים להתאושש על מחצלת חום עד שהן חוזרים לתנועה, ולאחר מכן להעביר לתיבה חמה ואספקה ​​עם תזונה נוספת, כגון תוסף מזון או דיאטה רגילה טבולה עד להחלמה מלאה. שיכוך כאבים מערכתיים או מקומיים יש לתת לבעלי חיים בו מוצגות סימנים של כאב 24 שעות לאחר ניתוח. אם thesסימפטומים דואר להתמיד למרות טיפול, בעלי החיים צריכים להיות שלוקטו בצורה אנושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעין הנגדית כשליטת unoperated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מדידות לחצו תוך עיניות כל 2-3 ימים לאחר מתן חרוז, וכל 2-3 ימים לאחר מכן באמצעות tonometer ריבאונד מכויל לשימוש בעיני העכברוש 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקריטריונים להכללת עיניים בלימודים יכולים להיות: אם 1) IOP מוגבה מעל הלחץ הנגדי על ידי שליטת 5 מ&quot;מ כספית, ו -2) לא יעלו על 60 מ&quot;מ כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיניים שבו חוזר לנקודת התחלת הלחץ (בדרך כלל על ידי לאחר הזרקת שבוע 1) לא צריך להיות כלולה בלימודים, אך זה אפשרי חרוזים מחדש להזריק בעיניים שאינם מצליחים לפתח גבוה IOP אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידי CO 2 מחנק בסוף הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העיניים ועצבי ראייה, ולתקן בparaformaldehyde 4% (PFA) לילה לניתוח היסטולוגית נוסף. </li></ol> 2. הערכת נזק לרשתית Neuron שימוש TUNEL Staining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת תאים אפופטוטיים בהר שלם retinasuse assay dUTP ניק תיוג בתיווך transferase deoxynucleotidyl המסוף (TUNEL), על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הרשתית מכוס עין, לשטוף 3 x 5 דקות בשיעור של 0.3% Triton X-100 בפוספט שנאגרו מלוח (T-PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize הרקמה ב 3% T-PBS עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לאזן רשתית באיזון הצפת למשך 10 דקות, לפני הדגירה בפתרון תגובת TUNEL עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה למשך 3 x 5 דקות בשיעור של 0.3% T-PBS, לשטוף בשיעור של 0.3% T-PBS המכיל 5 מיקרומטר DAPI, ושטוח הר בתקשורת הרכבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת גרעינים חיוביים TUNEL להשתמש מיקרוסקופ confocal לקחת 10 מיקרומטר Z- ערימות דרך שכבת תא גנגליון בהגדלה 20X. קח 3 תמונות בכל אחד 4 עלי הכותרת, באתרים קרובים לעצב הראייה, באמצע הפריפריה-, ובפריפריה הרחוקה של הרשתית, נותן סך של 12 תמונות לכל mount, דגימה כ -7,000 תאים. קריטריונים מורפולוגיים מופלים שאינו עצבי (אנדותל וגליה) תאים מהתאים עצביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורי בחירה להדמיה באמצעות רק ערוץ DAPI, וחוקרי מסכה לקבוצות טיפול. </li></ol> 3. הערכת נזק לעצב הראייה באמצעות toluidine הכחול מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את עצבי ראייה הלילה בפתרון של Karnovsky ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הדגימות עבור שעה 2 ב 1% (w / v) tetroxide אוסמיום ולאחר מכן ליבש באתנול 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עצבי ראייה בפרופילן אוקסיד למשך 30 דקות, ואת המקום בתערובת 50:50 של פרופילן אוקסיד: לילה araldite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את הפתרון הזה ל -100 araldite%, ואחריו דגירה הלילה בשעה 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קטעי Cut semithin (0.75 מ&quot;מ עובי) וכתם עם toluidine 1% כחולים / בורקס (TB) ב 50% אתנול לפני הבדיקה על ידי מיקרוסקופ אור. </li></ol> 4. ניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ana הסטטיסטיlyses באמצעות חבילת תוכנת סטטיסטיקה מתאימה. דו כיוונית ANOVA עם מבחן פוסט הוק-של ניומן-קאול ניתן להשתמש כדי לחשב מובהקות סטטיסטיות לIOP משתנה על פני זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערך p של פחות מ 0.05 עשוי להיחשב משמעותי. </li></ol>

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Weinreb, R. N., Aung, T., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiology+and+treatment+of+glaucoma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The pathophysiology and treatment of glaucoma: a review.</a> JAMA. 311 (18), 1901-1911 (2014).</li>
<li>Samsel, P. A., Kisiswa, L., Erichsen, J. T., Cross, S. D., Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+induction+of+experimental+glaucoma+using+magnetic+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (3), 1671-1675 (2011).</li>
<li>Libby, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+glaucoma+in+DBA%2F2J+mice%3A+pertinent+disease+features+for+studying+the+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inherited glaucoma in DBA/2J mice: pertinent disease features for studying the neurodegeneration.</a> Vis Neurosci. 22 (5), 637-648 (1017).</li>
<li>Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+intraocular+pressure+and+optic+nerve+injury+models+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Elevated intraocular pressure and optic nerve injury models in the rat.</a> J Glaucoma. 14 (4), 315-317 (2005).</li>
<li>Levkovitch-Verbin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translimbal+laser+photocoagulation+to+the+trabecular+meshwork+as+a+model+of+glaucoma+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43 (2), 402-410 (2002).</li>
<li>Moore, C. G., Johnson, E. C., Morrison, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+intraocular+pressure+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of intraocular pressure in the rat.</a> Curr Eye Res. 15 (2), 185-191 (1996).</li>
<li>Morrison, J. C., Jia, L., Cepurna, W., Guo, Y., Johnson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+and+sensitivity+of+the+TonoLab+rebound+tonometer+in+awake+Brown+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Reliability and sensitivity of the TonoLab rebound tonometer in awake Brown Norway rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (6), 2802-2808 (2009).</li>
<li>Wang, W. H., Millar, J. C., Pang, I. H., Wax, M. B., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+rodent+intraocular+pressure+with+a+rebound+tonometer%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of rodent intraocular pressure with a rebound tonometer.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (12), 4617-4621 (2005).</li>
<li>Isenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+application+of+povidone-iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health%22%5BJournal%5D)">The ocular application of povidone-iodine.</a> Community Eye Health. 16 (46), 30-31 (2003).</li>
<li>Morrison, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+chronic+pressure-induced+optic+nerve+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage.</a> Exp Eye Res. 64 (1), 85-96 (1997).</li>
<li>Foxton, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+is+necessary+and+sufficient+for+retinal+neuroprotection+in+models+of+experimental+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A is necessary and sufficient for retinal neuroprotection in models of experimental glaucoma.</a> Am J Pathol. 182 (4), 1379-1390 (2013).</li>
</ol>

דיוויד ט. שימה הוא עובד של הופמן-לה רוש, שוויץ. המחברים הנותרים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן אנו מדגימים שיטה לגרימת IOP הגבוה בחולדה, על ידי הזרקת microspheres המגנטי לתוך התא הקדמי של העין. שיטה זו היא פשוטה לביצוע, ודורשת מומחיות כירורגית קטנה, או שעות של תרגול ועידון. יתר על כן, ההליך הוא אפקטיבי; לעתים רחוקות דורש יותר מאשר זריקה אחת של חרוזים כדי לגרום לעלייה חזקה, חזקה בלחץ (reinjection שיעור של כ -10%). זה עשוי לספק יתרון על פני שיטות מושרה קיימות, כגון וריד episceral המאתגר מבחינה טכנית טרשת נפוצה מודל 11, או פרוטוקול photocoagulation לייזר 6, אשר יכול לדרוש הליכים מרובים כדי לשמור העלו IOP. על מנת שהשיטה כדי להצליח עם זאת, יש כמה קריטי צעדים קטנים שיש לנקוט. ראשית כדאי להשתמש במגנט בצורה טבעתי לצייר חרוזים לזווית iridocorneal. צעד זה הוא שינוי של הפרוטוקול המקורי, wherדואר חרוזים הוזרקו לתוך התא הקדמי, ולאחר מכן עברו ביד חופשית סביב העין 3. באמצעות מגנט טבעתי אומר שmicrospheres צריך להתיישב באופן שווה סביב הזווית, הדורש חלוקה מחדש ידנית מינימאלית. שנית, שיעור ההזרקה צריך להיות מהיר - איטי מדי והחרוזים בעיקר יצטברו בצד אחד של הזווית, שהובילו לכיסוי חלקי, ובאופן פוטנציאלי אין עלייה בלחץ. באופן כללי אם כי, השיטה היא פשוטה מספיק שהמשתמש יכול בקלות לבצע שינויים בפרוטוקול, כגון שינוי הגודל או הנפח של חלקיקי microsphere, אולי כדי לנסות לשנות את מידת גובה IOP. עם זאת, חסרון פוטנציאלי אחד של השיטה הוא שיש אחד מעט שליטה על היקף יתר לחץ דם, אשר בכ 5-10% מהמקרים שצפינו עלה מעל 60 מ&quot;מ כספית. עלייה מוגזמת בIOP יכולה להיות מאוד הרסנית לרקמת רשתית, ועלולה להפוך את חקר המנגנונים ויומשעמם של מוות של תאים מאתגרים. עם זאת, השיטה מייצרת פתולוגיה עצבית עקבית, הן בעצב הרשתית ואופטי, שניתן להשפיע פרמקולוגית 12. זה עלול להפוך את המודל אטרקטיבי לפיתוח תרופות חדשניות לטיפול בגלאוקומה. בנוסף, מאחר שהחרוזים מופנים לזווית iridocorneal, זה משאיר חזותי הציר חופשי להדמית חיה של דיסק הרשתית או אופטי. אנו צופים כי מודל זה יותאם ומשמש ליישומים עתידיים במינים אחרים, כוללים עכבר.

גלאוקומה ראשונית היא מחלה הרסנית עין משפיעה על 60.5 מיליון אנשים מוערכים ברחבי העולם 1, מה שעלול להוביל לאובדן ראיית חי שינוי ועיוורון 2. מחקר על מנגנוני המחלה, ופיתוח תרופות חדשניות לגלאוקומה, תלויים בדגמים טובים של המחלה אשר לשחזר כמה מסימני ההיכר של פתולוגיה. אנו מציגים כאן מודל גלאוקומה עכברוש על פי השיטה של et al Samsel. 3 המטרה הכוללת של שיטה זו היא להגביר את לחץ התוך עיני (IOP) בעיניים על ידי הזרקת microspheres המגנטי ללשכה הקדמית, ומשתמש בטבעת מגנטית, ישיר אותם לזווית iridocorneal. זה פוגע ביצוא ימי, אשר מגדיל את לחץ התוך עיני, שהוביל לניזק עצבי ואובדן תא. הפרוטוקול פותח כדי לנסות לספק מודל פשוט, מושרה של גלאוקומה. פרוטוקול זה יכול להיות כמה יתרונותעל טכניקות קיימות. מודלים עכבר גנטיים כגון DBA / י 2 זמינים, שאינו דורשים הליכים ליזום; עם זאת אלה עשויים להיות תחילתה צפויה של התקדמות המחלה 4. בניגוד לכך, מודלים מושרה, שרובם מסתמכים על ניתוח הרמת IOP במכרסמים, יש את היתרון שייזום יכול להיות נשלט על ידי המשתמש. חלק מהשיטות הללו יכול להיות חסרונות משלהם לעומת זאת, כולל להיות מאתגרים מבחינה טכנית 5, ויכול לדרוש הליכים מרובים כדי לשמור על לחץ תוך עיני מוגבר 6. בניגוד לכך, השיטה מושרה המפורטת בכתב היד הזה היא טכניקה פשוטה, יעילה, ושחזור שמייצרת עליות יציבים, חזקות בלחץ, עם צורך מינימאלי לreinjection. בנוסף, הוא אינו כרוך בציוד יקר, ורק דורש מיומנויות כירורגיות בסיסיות לביצוע. פרוטוקול זה יכול להיות מתאים לקוראים שמחפשים להגדיר פחות תובעני מבחינה טכנית מושרהמודל גלאוקומה במעבדה שלהם.

<table><tbody><tr><td>250 - 300 גרם נקבה חומה נורווגיה חולדות מגדל לשעבר</td><td>הרלן בריטניה</td><td>203</td><td></td></tr><tr><td>טונומטר ריבאונד Tonolab</td><td>Tiolat</td><td>TV02</td><td></td></tr><tr><td>Ketaset (קטמין)</td><td>פורט דודג' בריאות בעלי חיים</td><td>BN1000118</td><td>37.5 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>דומיטור (מדטומידין הידרוכלוריד)</td><td>אוריון פארמה</td><td>140-999</td><td>0.25 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>פובידון יוד</td><td>Ecolab</td><td>BN4369LE10</td><td>5% בתמיסת מלח H2O</td></tr> של <tr><td>Minim</td><td>Bausch and Lomb</td><td>PL00033/5017</td><td></td></tr><tr><td>מגנט טורואידלי</td><td>סופר-מגנט</td><td>R-10-07-03-N</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוספירות מגנטיות</td><td>Bangs Laboratories</td><td>UMC4N/9692</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>33 G מחט משופעת</td><td>המילטון</td><td>7747-01</td><td>מחט מותאמת אישית</td></tr><tr><td>Luer tip מזרק</td><td>המילטון</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan (atipemezole hydrochloride)</td> <td>Orion Pharma</td><td>141-003</td><td>0.25 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>משחת כלורמפניקול</td><td>Medicom</td><td>18956-0005</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעה TUNEL</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield מדיית הרכבה</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

ניסוי הגלאוקומה נגרמת על ידי הזרקת ocular של מיקרוסכמות מגנטית

Experimental Glaucoma Induced by Ocular Injection of Magnetic Microspheres

ההתקדמות בהבנת הפתופיזיולוגיה, ומתן טיפולים חדשים לגלאוקומה תלויה במודלים טובים של המחלה בבעלי חיים. אנו מציגים כאן פרוטוקול להעלאת הלחץ התוך עיני (IOP) בחולדה, על ידי הזרקת מיקרוספירות מגנטיות לחדר הקדמי של העין. השימוש בחלקיקים מגנטיים מאפשר למשתמש לתפעל את החרוזים לזווית האירידו-קרנית, ובכך לספק חסימה יעילה מאוד של זרימת נוזלים מהרשת הטרבקולרית. זה מוביל לעלייה ארוכת טווח ב-IOP, ובסופו של דבר למוות עצבי בשכבת תאי הגנגליון (GCL) כמו גם לפתולוגיה של עצב הראייה, כפי שניתן לראות בחולים עם המחלה. שיטה זו פשוטה לביצוע, מכיוון שהיא אינה דורשת מכונות, מיומנויות כירורגיות מומחים או שעות רבות של תרגול כדי לשכלל אותה. יתר על כן, עליות הלחץ חזקות מאוד, ובדרך כלל אין צורך בהזרקה חוזרת של המיקרוספירות המגנטיות בניגוד לכמה דגמים אחרים המשתמשים בחרוזי פלסטיק. בנוסף, אנו מאמינים ששיטה זו מתאימה להתאמה לעין העכבר.

הזרקה של חרוזים מגנטיים לזווית iridocorneal מושרה באופן עקבי עלייה ממושכת ויציבה בלחץ (איור 1), שהייתה לצפות בקלות בנקודת הזמן הראשונה, 3 ימים לאחר ההזרקה. יתר על כן, העלייה בלחץ נשמרה לאורך תקופת הניסוי, ועל אף שכמובן הזמן שלנו סיימו בגיל 18 ימים לאחר הזרקה, אחרים דיווחו כי לחץ נמשך לטווח ארוך 3. IOP הממוצע בממוצע לכל אורכו של הניסוי לשליטה, עיניים הזריקו-לא-חרוז הייתה 19.7 ± 0.3 מ&quot;מ כספית, לעומת 40.5 ± 2.8 מ&quot;מ כספית לעיניים-הזריק חרוז (P &lt;0.001). בנוסף, שיא לחץ תוך עיני מוגבר מ22.8 ± 0.3 מ&quot;מ כספית ל49.9 ± 2.3 מ&quot;מ כספית. כדי לקבוע אם ההעלאה בIOP מובילה למוות של תאי הגנגליון ברשתית, ביצענו צביעת TUNEL על רשתית, והיסטולוגיה על סעיפי עצב ראייה רוחביים (איור 2). ברשתית<html> צפינו עלייה בצביעת TUNEL (איור 2 א) בעיניים מוזרק חרוז עם IOP הגבוה. מספר הגרעינים אפופטוטיים עלה כ -15 מתקפלים, מ -1.6 ± 0.5 תאים בבקרה הנגדית, ל24.5 ± 0.5 תאים ברשתית עם יתר לחץ דם (איור 2; P &lt;0.05). יתר על כן, בעיניים שבחרוזים מגנטיים הוזרקו אבל לחץ לא גדל (כנראה עקב חסימה חלקית של זווית iridocorneal), מספרם של תאי TUNEL חיוביים לא היו שונה באופן משמעותי מאלה של בקרות uninjected (P&gt; 0.05). הדבר מצביע על כך המוות של תאים היה קשור לעלייה בלחץ, לא בשל רעילות ישירה של microspheres המגנטי. לבסוף, חקרנו פתולוגיה עצב ראייה במודל הגלאוקומה, וראיתי הצטברות של toluidine כחול ברבים מהאקסונים, המצביעים על ניוון של תהליכים אלה סלולריים (איור 2 ג). &quot;Src =&quot; יור 1 &quot;/&gt; / קבצים / ftp_upload / 52,400 / 52400fig1highres.jpg איור 1. העלאת לחץ התוך עיני באמצעות microspheres המגנטי. הזרקה של microspheres המגנטי ללשכה הקדמית מושרה עלייה חזקה, משמעותית בלחץ התוך עיני (IOP) בהשוואה לשליטה הנגדית, עיניים-מוזרק אינם. יחידות ציר Y = מילימטר כספית (ממ&quot;כ). = נתונים ממוצע ± SEM. * = P &lt;0.001; = 12. דמות N זה שונה מFoxton et al, Am.. J. Pathol 182 (4):. 1,379-1,390. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52400/52400fig2highres.jpg" /> איור 2. העלאת IOP על ידי הזרקה של microspheres המגנטי לזווית iridocorneal, הנגרמת מוות עצבי בשכבת תא גנגליון (GCL). (א) נציג תמונות של רשתית משליטה (משמאל) וגלאוקומה (מימין) העיניים מוכתמות לגרעינים אפופטוטיים ידי TUNEL (ירוק;חצים לבנים) וDAPI (כחול), המציינים את מספר הגרעינים אפופטוטיים מוגבר כIOP עלה. (ב) כימות של תאים חיוביים TUNEL בGCL, מראים כי עיניים עם IOP הגבוה (באמצע), היו תאים באופן משמעותי יותר אפופטוטיים בהשוואה ל שליטה (משמאל). בניגוד לכך, בעיניים מוזרק חרוז שבו לחץ לא עלה (מימין), ללא גידול משמעותי בהכתמת TUNEL נצפה. = נתונים ממוצע ± SEM. * = P &lt;0.05; N = 7 - 8 (ג) נציג תמונות של צביעת עצב ראייה, דגי עלייה בהצטברות כחולה toluidine (חיצים שחורים) באקסונים פגועים מהגלאוקומה (מימין), אבל עיניים לא שולטות (משמאל).. ברים סולם = 50 מיקרומטר. נתון זה שונה מאל Foxton et., Am. J. Pathol 182 (4):. 1,379-1,390.

אנו מציגים שיטה להשראת לחץ תוך עיני מוגבר (IOP), על ידי הזרקת מיקרוספירות מגנטיות לעין העכברוש, כדי ליצור מודל של גלאוקומה. זה מוביל לעליית לחץ חזקה, ולמוות עצבי נרחב. פרוטוקול זה קל לביצוע, אינו דורש זריקות חוזרות ומייצר עליות IOP יציבות לאורך זמן.

ניסוי הגלאוקומה נגרמת על ידי הזרקת Ocular של מיקרוסכמות מגנטית

Progress in understanding the pathophysiology, and providing novel treatments for glaucoma is dependent on good animal models of the disease. We present ...

מטרת הליך זה היא להשרות לחץ תוך-עיני מוגבר בחולדה באמצעות הזרקת מיקרוספירות פאראמגנטיות לתא הקדמי של העין. ראשית, מקמי טבעת מגנטית סביב עינה של חיה המורדמת, שטפי את המיקרוספירות המגנטיות, השעי אותן מחדש בתמיסה, ולאחר מכן טעני אותן למזרק. לאחר מכן, הזריקי את המיקרוספירות המגנטיות לתא הקדמי של העין.הסר את הטבעת המגנטית במהלך השחזור. ניתן למדוד את מות תאי הגנגליון ברשתית, הנובע מעלייה בלחץ התוך-עיני, באמצעות נתוני תהליך המתקבלים מניתוחים היסטולוגים כגון צביעת מנהרות (tunnel staining) או צביעת העצב האופטי. שטוף את חרוזי המיקרוספירות המגנטיות הסטריליים בגודל שמונה מיקרון שלוש פעמים במילליטר אחד של תמיסת Hank's buffered saline, באמצעות רספנסיה, סספנסיון וצנטריפוגה במהירות של 10,000 ×g למשך חמש דקות.לאחר מכן, השביו אותם שוב ב-0.5 milliliters של HBSS לקבלת תמיסה בריכוז של 30 milligrams per milliliter. כעת, באמצעות סונומטר rebound המכויל לשימוש בעין של חולדה, ביצעו חמש מדידות בסיס של IOP בבעלי החיים כשהם ערים. לאחר הרדמת החולדות, מרחו פומדת עינית בעין הנגדית שאינה מטופלת כדי לשמור עליה לחה.במהלך ההרדמה, יש להחיל propofol hydrochloride בריכוז 0.5%, חומר אלחוש מקומי, על העין המנותחת. לאחר מכן, יש לשטוף עין זו ב-povidone iodine בריכוז 5% במים. לאחר חמש דקות, יש להסיר את ה-povidone iodine ולשטוף את העין בתמיסת סליין סטרילית בריכוז 0.9%.שמרו על העין לחה במהלך ההרדמה באמצעות יישום קבוע של תמיסת סליין סטרילית. כעת, הניחו מגנט סטרואידי סביב העין כדי להפחית את הסיכון לפגיעה בקשתית ולמזער את אובדן החריזה. כוונו את המחט כך שתהיה משיקית לפני השטח של הקרנייה ובמקביל לקשתית ככל האפשר.המשיכו להזריק 25 µL של מיקרוספירות מגנטיות בהקרנת גמא בריכוז 30 mg/mL אל תוך התא הקדמי. השאירו את המחט במקומה למשך דקה אחת לאחר ההזרקה כדי להבטיח שהחרוזים ישקעו בזווית הקרניית של ה-IOC כדי לעכב את ניקוז הנוזל מהרשת הטרבכולרית. מספר שניות לאחר שהחרוזים שקעו בתחילה, הטו מעט את המחט כדי לאפשר דליפה מסוימת של הנוזל ולמזער עליות חולפות בלחץ התוך-עיני.כדי להבטיח שימוש חוזר במחט בפרוצדורות נפרדות, שטפו את המחט עם PBS. לאחר מכן השתמשו ב-70% ethanol, ולאחר מכן במים מזוקקים בשלב זה. במידת הצורך, הסירו את המגנט והשתמשו בו כדי למשוך חרוזיים לאזורים שבהם הכיסוי אינו מלא.השאירו את המגנט במקומו סביב העין למשך 10 דקות נוספות לאחר ההזרקה, כדי להבטיח שחרוזי הניגוב ישקעו היטב בזווית הקרנית-קשתית. בטלו את ההרדמה באמצעות 0.25 milligrams per kilogram של ESOL hydrochloride.יש להכניס 0.5 propane hydrochloride לשיכוך כאבים ולמרוח משחת chloramphenicol באופן מקומי למניעת זיהום. יש להשאיר את בעלי החיים להתאושש על משטח חימום עד שיחזרו לתנועה. לאחר מכן, יש להעבירם לקופסה חמה.השתמשו בעין הנגדית כביקורת לא מדורגת. חזרו על מדידות ה-IOP מדי יומיים עד שלושה לאחר מתן החרוזים ומדי יומיים עד שלושה לאחר מכן. הגדירו את הקריטריונים להכללת עיניים במחקרים, כולל כך שה-IOP מוגבר מעל לחץ העין בביקורת הנגדית ב-5 millimeters of mercury, ושה-IOP אינו עולה על 60 millimeters of mercury. עיניים שבהן הלחץ חוזר לרמת הבסיס שבוע לאחר ההזרקה לא ייכללו במחקרים. עם זאת, ניתן להזריק שוב חרוזים בעיניים שבהן לא התפתח IOP גבוה, במידה ודרוש.קבעו את העיניים המופרדות ואת העצב האופטי ב-4%paraldehyde, והעריכו את הנזק לנוירוני הרשתית באמצעות צביעת tunnel ואת הנזק לעצב האופטי באמצעות צביעת toine blue. בניסוי זה, הזרקת חרוזי מגנט לזווית הקרנית-קשתית גרמה באופן עקבי לעלייה ממושכת וחזקה בלחץ. יתרה מכך, העלייה בלחץ נשמרה לאורך כל משך הניסוי.ממוצע ה-IOP לאורך כל הניסוי עבור עיניים של קבוצת ביקורת שלא הוזרקו חרוזיים היה 19.7 ± 0.3 millimeters of mercury, ועבור עיניים שהוזרקו חרוזיים הוא היה 40.5 ± 2.8 millimeters of mercury. בנוסף, שיא ה-IOP עלה מ-22.8 ± 0.3 millimeters of mercury ל-49.9 ± 2.3 millimeters of mercury כדי לקבוע האם עלייה ב-IOP מובילה למותם של תאי גנגליון ברשתית. צביעת Tunnel בוצעה ברשתית והיסטולוגיה בוצעה בחתכים רוחביים של העצב האופטי ברשתית.צפינו לעליה בצביעת מנהרות (tunnel staining) בעיניים שבהן הוזרקו חרוזים עם IOP מוגבר. מספר הגרעינים האפופטוטיים עלה פי 15 בקירוב בהשוואה לרשתית היפרטנסיונית של בקרה צדית; כפי שניתן היה לצפות, בעיניים שבהן הוזרקו חרוזים מגנטיים ללא הפעלת לחץ, מספר התאים החיוביים לצביעת מנהרות לא היה שונה באופן מובהק מזה של בקרה ללא הזרקה. בדיקה נוספת של הפתולוגיה בעצב הראייה במודל הגלאוקומה הראתה הצטברות של odine blue ברבים מהאקסונים, דבר המעיד על דגנרציה של תהליכים תאיים אלו.

experimental-glaucoma-induced-ocular-injection-magnetic

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים השראת גלאוקומה בחולדה מורדמת על ידי הזרקת מלח היפרטוני לווריד האפיסקלרלי. המלח נכנס לרשת הטרבקולרית דרך תעלת שלם, גורם לצלקות רקמות, החוסמות את זרימת ההומור המימית ומעלה את הלחץ התוך עיני. הלחץ הגבוה פוגע בתאי גנגליון ברשתית, מה שמוביל לגלאוקומה.

טכניקת הזרקת מי מלח היפרטוניים לגרימת גלאוקומה בחולדות

בסרטון זה, חולדה מורדמת עוברת הליך עיניים שבו מוזרקים חרוזים מגנטיים לתוך החדר הקדמי תחת שדה מגנטי כדי לחסום את הזווית האירידו-קרנית. חסימה זו חוסמת את הרשת הטרבקולרית, מונעת ניקוז הומור מימי ומובילה ללחץ תוך עיני מוגבר, הפוגע בתאי הגנגליון ברשתית ובעצב הראייה. זה מפתח מצב דמוי גלאוקומה.

אינדוקציה ניסיונית של גלאוקומה באמצעות חסימת זווית אירידו-קרנית במודל עכבר

מקור: בוסקו, א., .  In vivo דינמיקה של הפעלת מיקרוגליה ברשתית במהלך ניוון עצבי: הדמיה אופטלמוסקופית קונפוקלית ומורפומטריית תאים בגלאוקומה של עכברים. J. Vis. Exp. (2015)} סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה. עכבר טרנסגני עם מיקרוגליה ברשתית המבטאת חלבון פלואורסצנטי ממוקם מתחת לאופטלמוסקופ. תאורת אינפרא אדום משמשת לאיתור ראש עצב הראייה (ONH), ומישור המוקד נוצר באמצעות כלי דם ברשתית כציוני דרך. לאחר מכן משתמשים בהדמיה פלואורסצנטית כדי להמחיש את המיקרוגליה...

הדמיה in vivo של מיקרוגליה ברשתית במודל עכבר של גלאוקומה

לחץ תוך עיני מוגבר כרוני הנגרם באמצעות טיפול לייזר של meshwork trabecular בעיני עכבר. לחץ התוך עיני (IOP) הוא גבוה למשך מספר חודשים לאחר טיפול לייזר. הירידה של חדות ראייה ורגישות לקונטרסט של חיות ניסוי מנוטרת באמצעות בדיקת optomotor.

מודל עכבר לייזר המושרה של לחץ תוך עיני מוגבר כרוני לאפיון פגמים חזותיים

סרטון זה מדגים שיטה, באמצעות סורק T קליני 3, לMR הדמיה משופר לעומת זאת, של ההשלכה החזותית העכבר הנאיבית ובמחקרי vivo חוזר על עצמו ואורך של ניוון עצב ראייה קשור עם פציעה למחוץ עצב ראייה חריפה וניוון עצב ראייה כרוני ב עכברים עקום החוצה (p50 KO).

בהדמית vivo של יושרה סיבי עצב הראייה על ידי contrast-enhanced MRI בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגרום ליתר לחץ דם עינית בעין murine שתוצאתו אובדן תאי הגנגליון ברשתית כפי שנצפה גלאוקומה. microbeads המגנטי מוזרק לתוך החדר הקדמי ומשך לזווית iridocorneal שימוש במגנט כדי לחסום את היצוא של הומור מימי.

לחסימה Microbead מגנטי דגם כדי לגרום Ocular Hypertension-Dependent גלאוקומה עכברים

גלאוקומה מאופיינת בפגיעה בתאי גנגליון ברשתית. גרימת גלאוקומה במודלים של בעלי חיים יכולה לספק תובנה לגבי חקר מחלה זו. כאן, אנו מתארים הליך הגורם לאובדן RGCs במודל חולדה in vivo ומדגים את הכנת הרשתית השלמה לניתוח.

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

יתר לחץ דם כרוני עינית הנגרמת על-ידי החלת בתפר circumlimbal אצל חולדות ועכברים, שמוביל התדרדרות תפקודית ומבניים של תאי גנגליון עקבית עם גלאוקומה.

דגם של גלאוקומה המושרה על ידי תפרים Circumlimbal אצל חולדות ועכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום לחץ דם עינית וglaucomatous ניוון בעיני העכבר על ידי הזרקה תאיים של שמן סיליקון ואת ההליך להסרת שמן סיליקון מן החדר הקדמי כדי להחזיר את הלחץ התוך בעינית מוגבה ל נורמלי.

סיליקון הפיך שמן המושרה מודל יתר לחץ דם בעכברים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לגרימת דלקת אובאיטיס מיקובקטריאלית (PMU) בעכברים. שיטה זו מתארת את השלבים שיעזרו לייצר דלקת עיניים אמינה וחזקה במערכת מודל העכבר. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו עיניים אוביטיות ועיניים של עמיתים לא מודלקים מחיות בודדות לצורך הערכה נוספת עם מבחנים אימונולוגיים, תעתיקיים ופרוטאומיים.

דלקת אובאיטיס מיקובקטריאלית ראשונית (PMU) כמודל לאובאיטיס פוסט-זיהומית

מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

חקור מודל גלאוקומה בחולדות באמצעות הזרקת מיקרוספירות מגנטיות לחדר העין הקדמי. שיטה זו מייצרת עלייה מתמשכת בלחץ תוך-עיני ומאפשרת מחקר ממושך של נזק לתאי גנגליון רטינליים וניוון עצב הראייה.

ניסוי הגלאוקומה נגרמת על ידי הזרקת Ocular של מיקרוסכמות מגנטית

גלה סרטונים נוספים