Name: בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: חקור בידול של תאי גזע עצביים אנושיים בשלוש תרבות ממדים באמצעות ניתוח חישובי של microRNA ואימות יעדי mRNA באמצעות שיטת dual luciferase assay.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים ג&#39;ולי Heward על עזרה בהכנת hNSCs, וLavaniya Thanabalasundaram לתמיכה הטכנית שלה עם culturing הלה וtransfection.

1. בידול HNSC על שלוש תרבות ממדי (3D) הערה: לבודד ולהפיק hNSCs, מרקמה אתית אושרה, שתוארה בפרסום קודם 2. אנא פעל על פי הנחיות האתיות ומוסדיות בעת ביצוע הליך זה. 1.1) 3D תרבות שימוש בצלחת 12 גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקת aseptic לאורך כל ההליך. בארון בטיחות ביולוגי, פיגומים מחדש מימה על ידי הוספת 2 מיליליטר / גם של 70% אתנול הוכנו באמצעות מים להשקיה (WFIr). הימנע מלגעת בפיגומים על ידי מחלק אתנול 70% במורד הקיר של כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב אתנול 70% ולשטוף באופן מיידי את הפיגומים עם 2 מיליליטר / גם DMEM: F12 דקות 1. חזור על תהליך השטיפה פעמיים. בזהירות לשאוב DMEM: F12 לאחר השטיפה הסופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומי מעיל על ידי הוספת 2 מיליליטר / היטב laminin (10 מיקרוגרם / מיליליטר) בDMEM: F12. דגירה צלחת על 37 מעלות צלזיוס ב5% זמזום CO 2חממת idified עבור מינימום של 2 שעות. את צלחת יש לשטוף עם DMEM החם: F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע כל פיגום עם כ -500,000 hNSCs בהיקף של 150 μl של GFS RMM +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור humidified 5% כדי לאפשר לתאים להתיישב לפיגומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3.5 מיליליטר של RMM לכל טיפול גם לוקח לא כדי לסלק תאים מפיגומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת למשך 7 ימים; להחליף בינוני RMM (3.5 מיליליטר / טוב) לאחר יום 1 (האכלה ראשונה) ושוב לאחר 2-3 ימים מההאכלה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 7 ימים, להסיר בינוני ולתקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) עבור immunocytochemistry (ICC) או להוסיף 500 μl / טוב של מגיב תמוגה להפקת RNA כולל (צלחת חנות ב≤ -80 ° C או להמשיך לסך הפקת RNA) . </li></ol> 1.2) מדידת תולדה תהליך אקסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם PFA 4% קבועים hNSCs המובחן על פי פרוטוקול סטנדרטי ICC 20 β באמצעות3-טובולין נוגדן ראשוני זוהה עם נוגדנים משני מצומדות fluorochrome (TUBB3). גרעין תא Counterstain עם Hoechst (1 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות נציג של תאים מוכתמים β3 טובולין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי; לשמור תמונות כמו TIFF או JPEG. מדד של תולדת תהליך האקסון באמצעות כלי מדידת תוכנה (פלוס למשל-Pro תמונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה, אפשרות מדידות בחרו בסרגל הכלים, ובחר תכונת עקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל את העקבות, בחר את נקודת ההתחלה בתולדת האקסון על ידי לחיצה על לחצן העכבר. צייר קו לאורך כל אורכו של האקסון תולדה; לחץ על זכות לסיים כל עקבות. חזור למדוד כל outgrowthswith האקסון בשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגעה מדידות כפיקסלים או מיקרומטר (תלוי ועומד כיול להגדיר). מדידות אורך יצוא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים לדוגמא ניתוח השוואתי וסטטיסטי. </li></ol> 2. ביטוי מירנה שימוש בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים מערך מירנה PCR ממוקד 2.1) סך הפקת RNA מירנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חילוץ מירנה על פיגומים ודגימות 2D גדל (הבדיל ושליטה עברו התמיינות, hNSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיגומי הפשרה, הוכנסו בצלחת גם 12, אם נדרשו. לשלב תוכן תמוגה מגיב (500 μl) של 2 בארות באותו הצינור Eppendorf 1.5 מיליליטר, נפח סופי של 1 מיליליטר של מגיב תמוגה. תשמור על עצמך לעזוב את הפיגום בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות שנאספו בעבר כיבשה תא pelleted 2D גדל (תרבויות hNSC 2D מובחנות ושליטה עברו התמיינות) להוסיף 1 מיליליטר של מגיב תמוגה ולהעביר תכנים לתוך 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize כל דגימת בדיקה באמצעות מזרק 1 מיליליטר ומחט מד קצר 20 עד 25. להעביר את lysate דרך המחט באמצעות מזרק 1 מיליליטר עד 5 פעמים עד lysate הומוגנית מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של כלורופורם על צינור אחד Eppendorf וכובע בצורה מאובטחת. צינורות היפוך ומערבולתלערבב תוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל homogenate המכיל 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge במשך 15 דקות ב≥12,000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את השלב המימי העליון של כל דגימה (להימנע מהעברה כל נוזל צבעוני הביניים, ורוד) לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge טרי המכיל 750 μl של 100% אתנול. מערבבים היטב על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה עד 700 μl של כל מדגם בדיקה, כוללים כל משקע, לעמודת מיני בצינור איסוף 2 מיליליטר. סגור את המכסה וצנטריפוגות ב≥8,000 XG למשך כ -30 שניות בטמפרטורת חדר. מחק את הזרימה דרך. חזור על שלב זה באמצעות שאר המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תקציר DNA במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף RWT חיץ 700 μl לעמודה ו צנטריפוגות מיני לכ 30 שניות ב≥8,000 x ז. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טור מיני-ידי הוספת הרשתית חיץ 500 μl וצנטריפוגה למשך כ -30 שניות ב≥8,000 x ז. מחק את הזרימה דרך. wash.Ce חזורntrifuge ב≥12,000 XG דקות 1 לייבש את הקרום נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute RNA הכולל בצינור Eppendorf 1.5 מיליליטר על ידי הוספת 40 μl מים RNase ללא לעמודת המיני וצנטריפוגה 1 דקות ב≥8,000 x ז. למדוד כולל ריכוז RNA בעזרת ספקטרופוטומטר מתאים. </li></ol> 2.2) מירנה cDNA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת מאסטר ההפוך-שעתוק. כל דגימה דורשת 4 μl של חיץ 5x miScript HiSpec, 2 μl של תמהיל 10x nucleics, 2 μl miScript להפוך תערובת transcriptase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> μl Aliquot 8 של תערובת השני בצינור PCR, להוסיף נפח הנדרש של רנ&quot;א הכל (250 ng), ולהוסיף מים RNase ללא לנפח סופי של 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 60 דקות ב 37 מעלות למשך 5 דקות C.Incubate על 95 מעלות צלזיוס כדי להשבית miScript ההפוך transcriptase Mix. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 מים RNase ללא μl לתגובת כל 20 μl הפוך שעתוק, חנות ב -20 ° C, או להמשיך עם אמת-tiשלי PCR באופן מיידי. </li></ol> 2.3) בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים ממוקדים מערך מירנה PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת רכיבי PCR בצינור 15 מיליליטר על ידי הוספת 1,375 μl של תערובת אמן הירוק 2x SYBR, 100 μl הכנת מירנה cDNA, 275 μl של 10x miScript יוניברסל פריימר, ו 1000 μl מים RNase ללא (סה&quot;כ נפח 2,750 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תערובת רכיבי PCR על מאגר טעינת PCR. מוציא בזהירות את מערך הצלחת PCR 96-היטב מהשקית האטום שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף תערובת רכיבי PCR 25 μl היטב בכל מערך ה- PCR באמצעות pipettor 8 ערוצים, או pipettor 12 ערוצים באמצעות רק 8 טיפים. לשנות טיפים pipet הבאים כל שלב pipetting, כדי למנוע זיהום צולב בין הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום את צלחת עם סרט דבק אופטי, ו צנטריפוגות 1 דקות XG ב 1000 בטמפרטורת חדר (15-25 ° C) כדי להסיר בועות. ראייה לבדוק את הצלחת מתחת כדי להבטיח שאין בועות נמצאות בבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מערך ה- PCR 96 צלחת גם באת Cycler בזמן אמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכנית Cycler בזמן אמת בהתאם: מחזור 1 ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ו -45 מחזורים במשך 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ודקות 1 ב 60 ° C להגדיר (איסוף נתוני הקרינה) בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את ערכי ה- CT לכל הבארות לגיליון אלקטרוני Excel ריק לשימוש עם מערך PCR ניתוח נתונים תבנית Excel ותוכנה מבוסס אינטרנט. הערה: תוכנה זמינה <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">בwww.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php.</a> </li></ol> 3. חישובית ניתוח לחיזוי יעד מירנה ותיקוף היעד mRNAs על ידי Reporter פלסמיד Transfection וDdual בלוציפראז Assay. 3.1) חישובית ניתוח לחיזוי מירנה יעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיון PicTar <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">(http://pictar.mdc-berlin.de/)</a> 21, אלגוריתם זמין באינטרנט לזיהוי miRNA למקד mRNAs תחזית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;לחץ כאן לקבלת תחזית PicTar על בעלי חוליות&quot;. דף חדש ייפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדף החדש, ממשק האינטרנט PicTar, לבחור מינים בתפריט הנפתח ולהכניס מירנה עניין בתיבת מירנה ID. לחץ על חיפוש עבור מטרות של מירנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב רשימה של mRNAs היעד מדורג על ידי ציון aPicTar. הערה: PicTar מחשב ציון המשקף את הסבירות שUTR נתון יהיה ממוקד על ידי מירנה נבחרה, ומבוסס על השלמת זרע, תרמודינמיקה וחיזוי קומבינטורית למטרות משותפות בקבוצות של miRNAs הביע שיתוף 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה לאחזר רשימה של mRNAs היעד באמצעות DIANA-LAB <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">(http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/)</a> 23, וTargetScan <a href="http://www.targetscan.org/">(http://www.targetscan.org/)</a> 24, על קו חלופי זמין אלגוריתמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל טבלה השוואתית של מטרiRNAs מבוסס על דירוג שהושג באמצעות כלי תוכנה שונים. PicTar מדרג על ידי ציון, DianaLab ידי דיוק (המבוסס על יחס אות לרעש וציון דיוק להערכת המשמעות של התוצאות הצפויות), וTargetScan ידי PCT המצרפי (המבוסס על השלמת זרע, אנרגיה חופשיה של מחייב, שימור על מינים שונים), ראו טבלה 1. </li></ol> 3.2) תיקוף היעד mRNAs על ידי Reporter פלסמיד Transfection וDual בלוציפראז Assay. הערה: 3 כתבי לוציפראז UTR &#39;לאימות של יעד mRNA כבר תיארה בעבר 25. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הלה זרע בצפיפות של 10 5 תאים / גם בצלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תאי הלה 24 שעות, שיתוף transfect עם 1.5 μl של מגיב transfection ושל NR4A3 3 פלסמיד UTR &#39;UTRor SOX5 3&#39; או 100 ng, כמו גם 20 ננומטר מחקה מירנה (HSA-miR-96-5p לSOX5 3217; UTR, וHSA-miR-7-5p, וHSA-miR-17-5p לNR4A3 3 &#39;UTR בהתאמה) בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארות שליטת Co-transfect עם NR4A3 3 UTRplasmid &#39;UTRor SOX5 3&#39; וsiRNAs שליטה שלילית fluorochrome שכותרת. Transfection של בארות שליטה עם siRNAs שליטה השלילי fluorochrome שכותרתו מאפשר הערכה של יעילות transfection ומהווה סגוליות bind מירנה 3&#39;UTR לחקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה של פעילויות בלוציפראז הכפולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הפעילות בלוציפראז Firefly וRenilla לאחר transfection 24 שעות. הסר בינוני צמיחת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד אני על ידי הוספת 50 μl של מצע אני לתוך 10 מיליליטר של הפתרון אני; מערבב היטב. להוסיף 300 μl של פתרון עובד אני לכל 24 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התוכן של כל 24 גם לתוך 3 בארות של צלחת לבנה 96, 100 μl כל אחד. חכה 10 דקות ולמדוד לוציפראז Firefly בסט luminometer לרכישת הארה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן solut עובדהיון השני על ידי הוספת 50 μl של המצע השני ל -10 מיליליטר של התמיסה II; מערבב היטב. הוספה של פתרון עובד לי 100 μl היטב לתוך כל אחד 96 כבר מכיל של I. פתרון עובד 100 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 10 דקות ולמדוד לוציפראז Renilla בסט luminometer לרכישת הארה. לחשב את היחס של הארה מלוציפראז Firefly ללוציפראז Renilla. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li>
<li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li>
<li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li>
<li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li>
<li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li>
<li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+repair%3A+cell+therapy+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Cloning%22%5BJournal%5D)">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li>
<li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li>
<li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+feel+the+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li>
<li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li>
<li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70(2010).</li>
<li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li>
<li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alvetex%28R%29%3A+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li>
<li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture%3A+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li>
<li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li>
<li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49(2014).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li>
<li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+microRNA+target+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li>
<li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295(2009).</li>
<li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+seed+pairing%2C+often+flanked+by+adenosines%2C+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li>
<li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3%27UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance%2C+pyramidal+cell+survival%2C+and+seizure+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li>
<li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+postmitotically+regulates+migration%2C+postmigratory+differentiation%2C+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li>
<li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li>
</ol>

כל הכותבים הם עובדים, מלאי ו / או מחזיקי אופציות ברה-נוירון בע&quot;מ או החברה האם שלה. מחקר זה נתמך על ידי רה-נוירון (RENE.L).

הפיתוח חדש במבחני חוץ גופית על מנת להעריך ולשפר את ההתמיינות של תאי גזע תמיד הציג אתגר לחקירת הפונקציות שלהם והיכולות טיפוליות. לטווח ארוך ויציב של קובץ מצורף hNSCs, הנדרש לפיתוח של 3D חזק בassay בידול מבחנה, טופל על ידי בדיקת מספר מצעי 3D עם מאפיינים שונים בטווח של חומרים ומבנים. כחלק מפיתוח assay אנחנו גם הערכנו ריכוז זריעת תאים אופטימלי וזיהינו את הדרישה לפיגומים להיות מצופים laminin. למרות hNSCs שלנו באופן ספונטני יכול להבדיל על 4-OHT והסרת גורם גדילה, יישום מערכת תרבות 3D הראו שיפור משמעותי ביכולת הבידול שלהם כפי שהיא נמדדים על ידי תולדת תהליך האקסון בהשוואה לhNSCs 2D המובחנת הסטנדרטי. כדי לחקור את ההשפעה של differe 3D המושרהntiation על ביטוי hNSC מירנה השתמשנו מערך PCR. לעומת microarray שבב סטנדרטי מערך PCR מציע את היתרונות של כימות ואימות ישירות של מירנה עניין. למרות שמערך ה- PCR מוגבל בטווח של מספר הכולל של מירנה בכל מערך, למשל כאן פחות מ -96, זה יכול להיות מותאם לכולל במיוחד miRNAs של עניין, במקרה שלנו שדווח בעבר בפיתוח תאי גזע. הביטוי של miRNAs מסלול ממוקד היה צדודית בhNSCs המובחנת 3D ו 2D לעומת hNSCs מובחן. MiRNAs באופן משמעותי ביותר למטה מוסדר נבחרו ונותח להעריך mRNAs היעד המשוער שלהם במטרה לקבוע את הפונקציונליות שלהם ופרשנות ביולוגית באמצעות אלגוריתמים זמינים באינטרנט (Lab דיאנה, PicTar, וTargetScans). מירנה אחד יכולה לזהות מאות יעדים ומסיבה זו אנו תוקף אינטראקציות מירנה עם 3 &#39;UTR mRNAsthat עשוי להיות מועמדים מתאימים בהרגולציה xonal. NR4A3, יעד של HSA-miR-7, וmiR-17 משפחתי, הוא חבר של קולטנים הגרעיניים משפחת NR4A ש, תלוי ברמת ביטוי שלהם, מעורבים בהבחנה, ההישרדות, אפופטוזיס והרגולציה של האקסון בהיפוקמפוס הדרכת 26. באופן דומה SOX5, יעד של HSA-miR-96, הוא דיווח לשלוט התקדמות מחזור התא בתאי אב עצבי 27 אורך האקסון 28, הגירה, בידול פוסט-נודד, ותחזיות של נוירונים 29. SOX5 וNR4A3 שני זוהו כmRNA יעד ישיר של HSA-miR-96, וHSA-miR-7 ו -17 בהתאמה על ידי מבחני כתב בלוציפראז כפולים. לוציפראז הכפול (Firefly וRenilla) מסתמך על שני גני כתב שונים באותה פלסמיד ומציע מערכת משופרת המאפשרת נורמליזציה לאפקטים הנגרמים על ידי transfection לא טוב ואפקטים רעילים לתאים בהשוואה למערכת פלסמיד בלוציפראז יחידה. כחלק מפיתוח assay שלנו אנחנו גם מותאמים conditi transfection שלנותוספות על מנת לקבל יעילות גבוהה. Protocolsdescribed במסמך זה עשוי להיות מנוצל כדי לייעל עוד יותר ולאפיין בידול במבחנה hNSC אשר עשוי beimplemented פרוטוקולי intransplantation ללימודי קדם-קליניים ויישומים קליניים בעתיד.

מחקר בתאי גזע ממלא תפקיד מרכזי ברפואת רגנרטיבית, שגם משתרעת על פני הדיסציפלינות של הנדסת רקמות, ביולוגיה של תא התפתחותיים, הרפוי סלולארי, ריפוי גנטי, וביו-חומרים (פיגומים ומטריצות). תאי גזע הם חשובים בשני תיקון רקמות developmentand האיבר; ההבנה כיצד תאי גזע לעבוד היא מרכזית לפיתוח טיפולי 1 תאי גזע חדשים המבוססים. CTX0E03 הוא תאי גזע עצביים שהונצחו על-תנאי אנושיים קו משובט, (hNSC) 2 מבודדים מהשליש הראשון אדם קליפה עוברית. CTX0E03 הגדיר מאפייני איכות שהם חיוניים לבנקאות סלולארי קלינית תחת תרגול טוב ייצור (GMP) 3. HNSCs באופן ספונטני יכול להתמיין לתאי עצב, גליה, וoligodendrocytes והוכח לשפר גירעונות נוירולוגיות כאשר הושתל במודל מכרסם של 2,4,5 איסכמיה מוקד. CTX0E03 hNSCs כרגע בניסויים קליניים לdisabil שבץity (NCT01151124 6 וNCT02117635, Clinicaltrials.gov). יש לי miRNAs 22 נוקלאוטידים ממוצע באורך ומוכח מולקולות רגולציה 7, הם לא מקודדים חלבונים, אלא להיקשר 3 אזור ראש מתורגם (3&#39;UTR) של mRNAs, המסדירים את יציבותם ותרגום לחלבונים. MiRNAs מדווחים להשתתף ברגולציה של מספר התהליכים תאיים, כוללים פיתוח, שגשוג, והבחנה 8. כמה miRNAs היה מעורב בויסות הגורל והמפרט של תאי גזע עצביים 9. בשני ממדים (2D) סביבת תרבות סטנדרטית מורכבות סביבת in vivo לא התאימו, וכתוצאה מכך האינדוקציה והרגולציה של בידול hNSC אינה אופטימלית. בvivo, תאים מוקפים במייקרו-סביבה תלת ממדים (3D) שחובר על ידי אחר תאים וligands תאי, כולל רביםסוגי collagens, laminin, וחלבונים אחרים מטריצה ​​(חוץ-תאי, ECM). מחקרים קודמים דיווחו כי הטופוגרפיה האדריכלית של החומרים מחקת ECMS ופנוטיפ תא השפעת הגיאומטריה שלהם וגורל 10-15. מספר פיגומי 3D הזמינים מסחרי זמין; אנו משמשים פיגום קלקר נקבובי ביותר מהונדס עם ארכיטקטורה מוגדרת היטב ואחידה לקרום עבה 200 מיקרומטר המספק 3D שטח שאליו תאים יכולים לפלוש ולהבדיל 16-18. מבחני בידול במסמך זה 2D and 3D משמשים כדי להעריך תולדת axonprocess. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לפרופיל ביטוי מירנה של קו hNSC הכיתה קליני להמשיך לחקור תופעות מירנה על בידולה. השיטות לכאן מאוירות המבוססות על אלה שתוארו במקור ב -19.

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>להכנה בינונית RMM</td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין אנושי&nbsp;</td><td>בקסטר הלת' קר בע"מ&nbsp;</td><td>1501052</td><td>עבור מדיום RMM המשמש בריכוז סופי של&nbsp; 0.03%</td></tr> <tr><td>טרנספרין, רקומביננט אנושי</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td>עבור מדיום RMM המשמש בריכוז סופי של&nbsp; 5 &micro; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פוטרסין DiHCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>למדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של&nbsp; 16.2 &micro; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>אינסולין, רקומביננט אנושי&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td>למדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של&nbsp; 5 &micro; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פרוגסטרון&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>למדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של&nbsp; 60 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030-24</td><td>למדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של&nbsp; 2 מ"מ</td></tr><tr><td>נתרן סלניט&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>למדיום RMM בשימוש בריכוז סופי של 40 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>bFGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>להוספה למדיום RMM, בשימוש בריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>EGF&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>יש להוסיף למדיום RMM, בשימוש בריכוז סופי של 20 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>יש להוסיף למדיום RMM, בשימוש בריכוז סופי של 100 ננומטר</td></tr><tr><td>למינין</td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E</td><td></td></tr><tr><td>מים להשקיה</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין מוגדר (DTI) (חנות -20&deg; ג)</td> <td>Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex 12 צלחת באר&nbsp;</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>אתנול&nbsp;</td><td>מרק&nbsp;</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr><tr><td>&בטא; נוגדן טובולין III</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Sigma</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy מיני</td><td>קיט Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>217004 ללא RNase DNase&nbsp;</td><td>קיאגן&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כלורופורם</td><td>סיגמא</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT&nbsp;</td><td>קיאגן&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>ערכת PCR ירוקה SYBR</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>218073 התפתחות תאים בידול miScript miRNA PCR Array</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 לבן 96 צלחת</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729692001</tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; רדיד איטום</td><td>Roche</td><td>&nbsp; </td><td></td>4729757001</tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>וקטור NR4A3 miRNA 3' UTR שיבוטי מטרה&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>וקטור SOX5 miRNA 3' שיבוטי יעד UTR&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars בקרה שלילית siRNA AF 488 (Qiagen).</td><td>קיאגן&nbsp;</td><td>1027284</td><td>בקרת טרנספקציה של MiRNA</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR Luciferase Assay</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 לומינומטר מיקרופלייט&nbsp;</td><td>פרומגה</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של microrna והמשוער יעד

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

תאי גזע עצביים (NSCs) מסוגלים התחדשות עצמית ובידול לתוך הנוירונים, האסטרוציטים וoligodendrocytes תחת microenvironments המקומית הספציפית. כאן, אנו מציגים סדרה של שיטות המשמשות לשלושה בידול ממדי (3D) וניתוח מירנה של קו משובט תאי גזע עצביים אנושיים (hNSC), כיום בניסויים קליניים עבור נכות שבץ (NCT01151124 וNCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs נגזרו מהשליש הראשון אדם קליפה עוברית אושרה אתית ותנאים הונצח באמצעות שילוב retroviral של עותק יחיד של c-mycER TAM לבנות. אנו מתארים כיצד למדוד תולדת תהליך האקסון של hNSCs המובחן על פיגומים וכיצד לכמת שינויים הקשורים בביטוי מירנה באמצעות מערך PCR 3D. יתר על כן אנו מדגימים אנליזה חישובית במטרה בחירת מירנה מטרות המשוערות. SOX5 וNR4A3 זוהו כיעד משוער מתאים מירנה של נבחר באופן משמעותי כלפי מטה-להסדירmiRNAs ד בhNSC המובחן. אימות יעד מירנה בוצעה על SOX5 ו3&#39;UTRs NR4A3 ידי transfection פלסמיד הכתב הכפול וassay בלוציפראז הכפול.

באיור 1 היא דמיינה את החקירה וכימות של בידול hNSC על פיגומי 3D לעומת תרבויות משטח שטוחות מסורתיות (2D) וexpressedas מדידות תולדת תהליך האקסון. באיור 2 היא representedthe זרימת עבודה ואת התוצאות לכימות מירנה שימוש בתאי גזע ומסלולים התפתחותיים התמקדו מערך מירנה PCR לחקור ביטוי ההפרש של miRNAs בhNSCs המובחן 2D and 3D לעומת שליטה מובחנת. ניתוח השוואתי בין מירנה הבאה hNSCs המובחן ובלתי-המובחן, ואנליזה חישובית לחיזוי היעד, SOX5 וNR4A3 (NOR1) זוהו כmRNAs יעד משוער. ללמוד אינטראקציה הישירה בין miRNAs והאתר המשוער שלהם על mRNA 3&#39;UTR השתמשנו 2 פלסמידים זמינים מסחרי המכילים גם SOX5 או רצף NR4A3 3&#39;UTR הוכנסו במורד הזרם של גן הכתב בלוציפראז גחלילית,<html> nd המכיל באותו הגן בלוציפראז renilla פלסמיד לנורמליזציה. תוצאות הנציג של 3 פעילות לוציפראז &#39;UTR למטה ויסות מוצגות באיור 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> איור 1:. בידול של hNSCs על פיגומי 3D, ומדידה של תולדת תהליך es האקסון () בעקבות צביעת ICC סטנדרטית לβ3 טובולין (ירוק) וגרעינים counterstained עם Hoechst (כחול) microphotographs נציג נרכשו והמדידה של תהליכי האקסון היו בוצע בסיוע תוכנת ניתוח תמונה. (ב) תרשימים דיווח המדידה של תולדת תהליך האקסון שבוצעה בhNSCs המובחן 2D and 3D עבור 1 (1W) או 3 שבועות (3W).com / קבצים / ftp_upload / 52,410 / &quot;target =&quot; 52410fig1highres.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> איור 2:. עבודה סכמטי של פרופיל מירנה בhNSCs המובחן RNA סה&quot;כ, כולל miRNAs, הופק משני hNSCs המובחן על פיגומי 3D ותרבויות 2D סטנדרטיים, או שליטה מובחנת. 250 ננוגרם של רנ&quot;א הכל היה עם שיטה המאפשרת את ההמרה סלקטיבית של miRNAs הבוגר לcDNA המתאים לכימות מירנה עם התמיינות תאים אנושית ופיתוח מערך miScript מירנה PCR-עיבד רטרו. גיאו-הממוצע של SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, וRNU6-2 שימש לניתוח נתונים המבוסס על שיטת 2 -ΔΔct. שינויים משמעותיים הוגדרו כ+/- 1.5 לקפל למעלה ולמטה רגולציה לstaבמידת tistically משמעותית. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה מבוססת אינטרנט זמינה בתוצאות באות לידי ביטוי כclustergram. שונה מאיור 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> איור 3: אימות של יעד מירנה חזתה mRNA באמצעות assay דו&quot;ח לוציפראז כפול. תרשים נציג של פלסמיד כתב בלוציפראז כפול משמש ככלי כדי לאמת את רצף 3&#39;UTR כמטרה ישירה של מירנה (). (ב) מיקרוסקופ נציג מראה יעילות transfection. (C) &#160; אותות, הביעו כפעילות לוציפראז היחסית, בין 3 &amp; # אדם39; גני כתבי UTR ofSOX5 וNR4A3 הופלו באופן משמעותי כלפי מטה בנוכחות HSA-miR-96, וHSA-miR-7 ו -17 מחקה מירנה בהתאמה. שונה מאיור 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> מירנה </td><td> גן המטרה </td><td> אתרי יעד / גנים שנמצאו </td><td> Precision </td><td> ציון </td><td> המצרפי P CT </td></tr><tr><td> HSA-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> HSA-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; HSA-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> HSA-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> טבלת 1: רשימה של mRNAs חיזוי יעד מירנה. שולחן נציג של miRNAs, למקד את הגנים חזוי, וניתוח אלגוריתמים (לחזותיון / ציון / כולל הניתן באמצעות המעבדה דיאנה, PicTar, וTargetScan בהתאמה). שונה מטבלה 3 19.

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך את ביטוי ה-micro RNA של התמיינות, מיפוי ותיקוף של mRNA מטרה של קו תאי גזע עצביים אנושיים. דבר זה מושג תחילה על ידי תרבית של תאי גזע עצביים אנושיים במערכת תרבית תלת-ממדית כדי להשרות התמיינות תאים. השלב השני הוא כימות ההתמיינות על ידי מדידת צמיחת נשקי אקסונים.בשלב הבא, שינויים בביטוי של micro RNA מוערכים באמצעות מערך micro R-N-A-P-C-R. לאחר מכן, מבוצע ניתוח חישובי של microRNAs נבחרים בעלי ביטוי דיפרנציאלי במטרה לזהות קבוצה של mRNAs מטרה פוטנציאליים. לבסוף, ה-mRNAs המטרה מאומתים באמצעות פלסמיד רפורטר, טרנספקציה ובדיקת לוסיפראז כפולה (dual luciferase assay).השיטה שתוצג כאן יכולה לסייע במתן מענה לסוגיות מרכזיות בתחום תאי הגזע העצביים, כגון אפיון של microRNAs מבוטאים ומסננקי messenger RNAs שהם מטרתם בתאי גזע עצביים אנושיים בעת שהם עוברים דיפרנציאציה. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה של תאי גזע עצביים, ניתן להחילה אותה גם על מערכות אחרות של תאי גזע, כגון תאי גזע מזנכימליים, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים, או מערכות אחרות הדורשות השראת דיפרנציאציה ואפיון מולקולרי.ההדגמה הוויזואלית של שיטה זו מפרקת לשלבים קריטיים את תהליך ההביניה של קו תאי גזע עצביים אנושיים, את חקירת פרופיל ה-microRNA ואת התיקוף של ה-mRNA מטרה; חלק מההליך יוצג על ידי לביניה, מדענית מהמעבדה שלי. יש לבצע את כל ההליך בתוך קבבית בטיחות ביולוגית תוך שימוש בטכניקות סטריליות. יש להשקות את הפיגומים על ידי הוספה לכל באר של ה-AL VX 12.מלאו כל באר ב-2 mL של 70% ethanol שהוכן באמצעות מים להשקיה. הימנעו ממגע עם הפיגומים על ידי מזיגת ה-70% ethanol לאורך דופן כל באר. שאבו בזהירות את ה-70% ethanol ושטפו מיד את הפיגומים ב-2 mL של D-M-E-M-F 12 לכל באר למשך דקה אחת.חזור על תהליך השטיפה פעמיים ושאב בזהירות את ה-D-M-E-M-F 12 לאחר השטיפה האחרונה. כסה את הפיגומים על ידי הוספת שני מיליליטר של laminin ב-D-M-E-M-F 12 לכל באר. דגרי את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide למשך שעתיים לפחות.לאחר מכן, שטפו את הפלטה עם D-M-E-M-F 12 חמים. זרעו בכל פיגום כ-500,000 תאי גזע עצביים אנושיים (H nscs) בנפח של 150 µL של מצע RMM עם גורמי גדילה. דגרו את הפלטה למשך שלוש שעות כדי לאפשר לתאים להשקיע בתוך הפיגומים. לאחר שלוש שעות, הוסיפו 3.5 mL של RMM לכל באער, תוך הקפדה לא להרחיק את התאים מהפיגומים.דגרו את הפלטה למשך שבעה או 21 ימים. החליפו את מצע ה-RMM לאחר יום אחד, המהווה את ההאכלה הראשונה, והחליפו את המצע שוב יומיים עד שלושה ימים לאחר ההאכלה הראשונה. שבעה ו-21 ימים לאחר תרבית תלת-ממדית של H nscs.הסיר את מצע ה-RMM וקבע את התאים המובחנים באמצעות 4%paraform aldehyde. לאחר מכן צבע את התאים הקבועים באמצעות נוגדן ראשוני ל-beta three tubulin שזוהה באמצעות נוגדן משני מצומד לפלואורוכרום. גרעיני התאים נצבעים בצביעה נגדית עם hooks.צלמו תמונות מייצגות של התאים שצבעו ב-beta three tubulin. שמרו את התמונות בפורמט TIFF או JPEG באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מדידת צמיחת נשקי האקסון מתבצעת באמצעות כלי המדידה של תוכנת image PRO plus seven.כדי להתחיל, פתחו את התמונה, בחרו באפשרות המדידה בסרגל הכלים ובחרו בתכונת העקיבה (trace). כדי להתחיל את העקיבה, סמנו את נקודת ההתחלה של צמיחת האקסון על ידי לחיצה על לחצן העכבר, עקבו לאורך כל אורכה של צמיחת האקסון ולחצו על המקש הימני כדי לסיים כל עקיבה. באופן זה, מדדו את כל צמיחות האקסונים בתוך שדה הראייה והציגו את המדידות כפיקסלים או במיקרומטרים.ייצאו את מדידות האורך לתוכנת גיליונות נתונים לצורך ניתוח השוואתי וסטטיסטי של הדגימות, כדי להעריך שינויים בביטוי של micro RNA בתאי HSC שגודלו בתרבית תלת-ממדית. ראשית, בצעו מיצוי של micro RNA והכנה של micro RNA CD NA כפי שמתואר בפרוטוקול הנלווה. הטקסט מופיע מיד לאחר קבלת ה-micro RNA CD NA.הכינו את תערובת רכיבי ה-PCR עבור ה-real-time PCR בשפופרת של 15 מיליליטר. הוסיפו 1375 µL של תערובת מאסטר (master mix) מסוג X-S-Y-B-R green בריכוז 2X, כמות של 100 µL של micro RNA CD NA, כמות של 275 µL של הפרימר האוניברסלי ו-1000 µL של מים נקיים מ-RNase.ערבבו את רכיבי ה-PCR למאגר טעינה של PCR. הוציאו בזהירות את מערך ה-PCR בלוח 96 בארות מהשקית האטומה שלו. בעזרת פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 25 µl מרכיבי ה-PCR.ערבבו בכל באר של מערך ה-PCR. החליפו את טיפי הפפטה לאחר כל שלב של פפטציה כדי למנוע זיהום צולב בין הבאערים. אטמו את פלטת 96 הבאערים עם סרט דביק אופטי וסבבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-1000 GS בטמפרטורת החדר כדי להסיר בועות. בצעו בדיקה ויזואלית של הפלטה כדי לוודא שאין בועות בבאערים.לוחית PCR עם 96 בארות בתוכנת המכשיר למחזור בזמן אמת. הגדירו את המכשיר למחזור בזמן אמת בהתאם. לאחר מכן, ייצאו את ערכי ה-CT של כל הבארות לגיליון אקסל ריק לצורך ניתוח נתוני ה-PCR array; לצורך זיהוי מטרות micro RNA חזויות, נעשה שימוש באלגוריתם PIC ktar הזמין באופן מקוון.לחצו על "לחצו כאן לחיזוי pic ktar בחולייתנים" כדי לפתוח דף חדש בממשק האינטרנט של PIC KTAR. בחרו את המין בתפריט הנפתח והזינו את ה-micro RNA המבוקש בתיבת ה-micro RNA ID. לחצו על "search for targets of a micro RNA" כדי לחפש מטרות עבור ה-micro RNA.תוצג רשימה של mRNA מטרה המדורגים לפי מדד PIC KTAR. הדירוגים שהתקבלו משמשים לאחר מכן להרכבת טבלה השוואית של microRNAs. פלסמיד דו-לוקידאז של דוח (dual luciferase reporter plasmid) משמש ככלי לתיקוף ה-mRNAs המטרה; פעילויות לוקידאז של גחליליל וכליה נמדדות 24 שעות לאחר טרנספקציה של תאי hela.הכינו את תמיסת העבודה הראשונה על ידי הוספת 50 µl של סובסטרט ל-10 mL של תמיסה אחת וערבבו היטב. הוציאו את מצע גידול התאים מכל באר בלוח 24 בארות והוסיפו 300 µl של תמיסת העבודה הראשונה לכל באר. העבירו 100 µl מהתכולה של כל באר בלוח 24 הבארות לשלוש בארות בלוח 96 בארות. המתינו 10 דקות ולאחר מכן מדדו את פעילות ה-firefly luciferase בלומינומטר המכוון לרכישת לומינסנציה.הכינו את תמיסת העבודה השנייה על ידי הוספה של 50 µL של סובסטרט, 2 עד 10 mL של תמיסה שנייה וערבוב יסודי. הוסיפו 100 µL של תמיסת העבודה השנייה לכל באר בלוח 96 הבארים המכיל כבר 100 µL של תמיסת עבודה אחת. המתינו 10 דקות ולאחר מכן מדדו את פעילות ה-renal luciferase.לאחר מכן, מחושב היחס בין הלומנס (luminescence) של לוקיפראז הגחלילית לבין לוקיפראז הכליתי. צולמו תמונות מיקרוסקופיות מייצגות של H NSCS על פיגומים תלת-ממדיים (3D scaffolds) לאחר צביעה אימונוכימית ל-beta three tubulin המוצג בירוק וצביעת נגדית של הגרעינים ב-hooks המוצגים בכחול; מדידת תהליכי האקסון בוצעה בעזרת תוכנה לניתוח תמונות. השוואה של צמיחת תהליכי אקסון בין H nscs שגדלו עם פיגומים תלת-ממדיים לבין תרביות על פני שטח שטוח מסורתי או תרביות דו-ממדיות (2D), מראה כי לאחר שבוע אחד או שלושה שבועות, ה-HSCs המובחנים בתלת-ממד הראו צמיחה גדולה יותר של תהליכי אקסון.ניתוח חישובי לניבוי מטרות הניב שהביא למידע המוצג כאן: רשימה של גנים המהווים מטרות חזויות של microRNAs, וערכי דיוק וערכים מצטברים. SOX5 ו-NR4A3 זוהו כגנים המהווים מטרות משוערות. מערך דו-לוסיפראז (dual luciferase reporter assay) שימש לאימות המטרות של ה-microRNAs, כפי שמוצג כאן.פעילות לוקיפראז יחסית ממסמני 3' UTR אנושיים של הגנים SOX5 ו-NR4A3 הופחתה באופן משמעותי בנוכחות ה-microRNAs המצוינים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להבדיל אותם בתאי גזע עצביים, לחקור ביטוי של microRNA ולאמת mRNA מטרה.

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מציג את ההתפתחות וההתמיינות של תאי גזע עצביים אנושיים בתוך פיגום תלת ממדי. ציפוי למינין על הפיגום מקדם את חיבור התא, ואילו תווך עצבי נטול גורמי גדילה גורם להתמיינות תאים לתאי אב עצביים, המרחיבים את התהליכים שלהם בתוך ארכיטקטורה נקבובית לכיוונים מרובים, ויוצרים תרבית תלת...

התמיינות תאי גזע עצביים אנושיים לתרבית תלת-ממדית באמצעות פיגום נקבובי

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים, או תאי גזע עובריים אנושיים, ישירות לתאי אב עצביים ללא שימוש בתאי הזנה או בשלבי ביניים כלשהם. עיכוב סלקטיבי של חלבון מורפוגנטי עצם או BMP והפיכת גורם גדילה-בטא, או TGF-β, מסלולי איתות מוביל להתמיינות תאי גזע עובריים עובריים עצביים לתאי אב עצביים, או NPCs.

התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לאבות עצביים

סרטון זה מדגים את הדור של תאי אב עצביים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שאינם מהונדסים ומהונדסים. hPSCs מתמיינים לתאי אב עצביים באמצעות מדיום התמיינות עצבי. בעוד התמיינות מושרית בתאים שאינם טרנסגניים באמצעות מולקולות קטנות, hPSCs טרנסגניים מתמיינים על ידי הוספת אנטיביוטיקה המשרה את המקדם עבור גורם שעתוק ספציפי התמיינות עצבית.

התמיינות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שאינם מהונדסים לתאי אב עצביים

בסרטון זה מודגם פרוטוקול מדורג של תאי גזע עובריים אנושיים לאורגנואידים עצביים. השיטה כוללת גרימת היווצרות רוזטה עצבית, ואחריה הבשלה מבוקרת וטיפוח סופי על קרום הידרופובי כדי להשיג אורגנואידים עצביים מפותחים במלואם.

התמיינות והבשלה של תאי גזע עובריים אנושיים לאורגנואידים עצביים

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

מחקר זה מציג ומתאר פרוטוקולים לגזור שני מסוימים נוירונואידים אנושיים האדם כמודל רלוונטי ומדויק עבור לימוד 1) התפתחות האדם הגלינובלסטומה בתוך אורגנואידים האדם באופן בלעדי בבני אדם ו 2) תא העצב הדואמיאנרגיות בידול היוצר אורגאיד תלת מימדי.

ארגונית עצבית אנושית לחקר סרטן המוח ומחלות ניווניות

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

חקור בידול של תאי גזע עצביים אנושיים בשלוש תרבות ממדים באמצעות ניתוח חישובי של microRNA ואימות יעדי mRNA באמצעות שיטת dual luciferase assay.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

גלה סרטונים נוספים