בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך התמיינות, מיקרו RNA, פרופיל ואימות Mr.NA מטרה של קו תאי גזע עצבי אנושי. זה מושג על ידי תרבית ראשונה של תאי גזע עצביים אנושיים במערכת תרבית תלת מימדית כדי לגרום להתמיינות תאים. השלב השני הוא לכמת התמיינות על ידי מדידת צמיחת תהליך אקסון.

לאחר מכן, שינויים בביטוי מיקרו RNA מוערכים על ידי מערך מיקרו R-N-A-P-C-R. לאחר מכן מבוצע ניתוח חישובי של מיקרו-RNAs נבחרים המתבטאים באופן דיפרנציאלי כדי לזהות קבוצה של mRNAs מטרה משוערים. בסופו של דבר, ה-mRNAs המטרה מאומתים על ידי פלסמיד מדווח, טרנספקציה ובדיקת לוציפראז כפולה.

כך שהשיטה שתוצג כאן יכולה לעזור לענות על סוגיות מפתח בתחום תאי הגזע העצביים, כגון אפיון של מיקרו-רנ"א מבוטא, והם מכוונים לרנ"א שליח בתאי גזע עצביים אנושיים כאשר הם עוברים התמיינות. אם כי שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הביולוגיה של תאי גזע עצביים. ניתן ליישם אותו גם על מערכות תאי גזע אחרות כגון תאי גזע מזנכימליים, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, או מערכות אחרות הדורשות אינדוקציה של התמיינות ואפיון מולקולרי.

הדגמה חזותית של שיטה זו מפרקת את השלבים הקריטיים בהתמיינות של קו תאי גזע נוירולוגיים אנושיים וחקירת פרופיל מיקרו-RNA ואימות של mRNA מטרה המדגים חלק מההליך יהיה לבניה, מדען מהמעבדה שלי. יש לבצע את כל ההליך הזה בארון בטיחות ביולוגי בטכניקות אספטיות. החזר את הפיגומים על ידי הוספה לכל באר של AL VX 12.

צלחת באר שני מיליליטר של 70% אתנול שהוכן באמצעות מים להשקיה. הימנע מלגעת בפיגומים על ידי הוצאת האתנול 70% במורד הקיר של כל אחד מהם. ובכן, שאפו בזהירות את האתנול 70% ושטפו מיד את הפיגומים עם שני מיליליטר לבאר D-M-E-M-F 12 למשך דקה אחת.

חזור על הליך הכביסה פעמיים, שאב בזהירות את ה-D-M-E-M-F 12 לאחר הכביסה הסופית. מצפים את הפיגומים על ידי הוספת שני מיליליטר למינין ב-D-M-E-M-F 12 לכל אחד. ובכן דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים לפחות.

לאחר מכן, שטפו את הצלחת עם זרעי D-M-E-M-F 12 חמים כל פיגום עם כ-500,000 תאי גזע עצביים אנושיים או H nscs בנפח של 150 מיקרוליטר של מדיום RMM עם גורמי גדילה. דגרו את הצלחת למשך שלוש שעות כדי לאפשר לתאים להתיישב בפיגומים לאחר שלוש שעות. הוסף 3.5 מיליליטר RMM לכל באר הקפד לא לעקור תאים מהפיגומים.

דגרו על הצלחת למשך שבעה או 21 יום. החלף את מדיום ה- RMM לאחר יום אחד, שהוא ההאכלה הראשונה והחלף את המדיום שוב יומיים-שלושה לאחר ההאכלה הראשונה. שבעה ו-21 ימים לאחר התרבות התלת-ממדית של H nscs.

הסר את מדיום ה-RMM ותקן את התאים הממוינים עם 4% אלדהיד פרפורם. התאים הקבועים נצבעים לאחר מכן באמצעות נוגדן ראשוני בטא שלוש טובולין שזוהה עם פלואורוכרום מצומד. גרעיני תאי נוגדנים משניים הם כתמים נגדיים עם ווים.

צלם תמונות מייצגות של תאים מוכתמים בבטא שלושה טובולין. בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שמרו את התמונות בתבנית TIFF או JPEG. מדידת צמיחת תהליך האקסון מתבצעת באמצעות כלי המדידה image PRO plus 7 תוכנה.

כדי להתחיל לפתוח את התמונה, בחר באפשרות המדידה בסרגל הכלים ובחר תכונת מעקב. כדי להתחיל את המעקב, בחר את נקודת ההתחלה על צמיחת האקסון על ידי לחיצה על עקיבה אחר לחצן העכבר לכל אורך צמיחת האקסון לחיצה ימנית כדי לסיים כל מעקב. באופן זה, מדוד את כל צמיחות האקסונים בשדה הראייה מבטאים מדידות כפיקסלים או מיקרומטרים.

ייצוא מדידות אורך לתוכנית גיליון אלקטרוני לניתוח השוואתי וסטטיסטי מדגם להערכת שינויים בביטוי מיקרו RNA של HSCs בתרבית תלת מימדית. ראשית בצע מיצוי מיקרו RNA והכנת מיקרו RNA CD NA כמתואר בפרוטוקול הנלווה. טקסט מיד לאחר קבלת המיקרו RNA CD NA.

הכן את תערובת רכיבי ה-PCR ל-PCR בזמן אמת בצינור של 15 מיליליטר. הוסף 1375 מיקרוליטר של שני X-S-Y-B-R תערובת מאסטר ירוקה. 100 מיקרוליטר של מיקרו RNA, CD NA, 275 מיקרוליטר של הפריימר האוניברסלי ו-1000 מיקרוליטר של RNA, העברת מים חופשית.

רכיבי ה-PCR מתערבבים למאגר טעינה PCR. הסר בזהירות את מערך ה-PCR של 96 בארות מהשקית האטומה שלו. בעזרת צינור רב ערוצי, הוסף 25 מיקרוליטר מרכיבי ה-PCR.

מערבבים לכל באר של מערך ה-PCR. החלף את קצות הפיפטה לאחר כל שלב פיפטה כדי למנוע זיהום צולב בין איטום הבארות. צלחת 96 בארות עם סרט דבק אופטי וצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-1000 GS בטמפרטורת החדר להסרת בועות בדקו חזותית את הצלחת כדי לוודא שאין בועות במקום הבארות.

מערך ה-PCR של 96 בארות בתוכנית האופניים בזמן אמת. רוכב האופניים בזמן אמת בהתאם. לאחר מכן, ייצא את ערכי ה-CT עבור כל הבארות לגיליון אלקטרוני ריק של Excel עבור מערך PCR ניתוח נתונים, אלגוריתם הזמין באינטרנט PIC ktar משמש לזיהוי מטרות מיקרו RNA חזויות.

לחץ כאן, לחץ כאן לחיזוי פיק קטאר על בעלי חוליות כדי לפתוח דף חדש בממשק האינטרנט של PIC KTAR. בחר מינים בתפריט הנפתח והכנס את המיקרו RNA המעניין בתיבת מזהה המיקרו RNA. לחץ על חפש מטרות של מיקרו RNA.

תוצג רשימה של mRNAs יעד המדורגים לפי ציון PIC KTAR. הדירוגים המתקבלים משמשים לאחר מכן להרכבת טבלה השוואתית של מיקרו-רנ"א. פלסמיד מדווח לוציפראז כפול משמש ככלי לאימות ה-mRNA של המטרה, פעילויות הגחליליות והלוציפראז הכלייתי נמדדות 24 שעות לאחר הטרנספקציה של תאי הלה.

הכן פתרון עבודה אחד על ידי הוספת 50 מיקרוליטר מצע, אחד ל -10 מיליליטר תמיסה אחת וערבוב יסודי הסר את מצע גידול התאים מכל באר של צלחת 24 הבארות והוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת עבודה אחת לכל אחת. העבירו היטב 100 מיקרוליטר מתכולת כל באר. מתוך צלחת 24 בארות לשלוש בארות של צלחת 96 בארות המתינו 10 דקות ולאחר מכן מדדו את פעילות לוציפראז הגחלילית בסט לומינומטר לרכישת זוהר.

הכן פתרון עבודה שני על ידי הוספת 50 מיקרוליטר מצע, שניים עד 10 מיליליטר תמיסה שתיים וערבוב יסודי. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה, שניים לכל באר של צלחת 96 הבאר שכבר מכילה 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. יש להמתין 10 דקות ולאחר מכן למדוד את פעילות הלוציפראז הכלייתי.

לאחר מכן, מחושב יחס הזוהר מלוציפראז הגחלילית ללוציפראז הכליה. צילומי מיקרו מייצגים של H NSCS על פיגומים תלת מימדיים נרכשו בעקבות צביעה אימונוכימית עבור בטא שלושה טובולין המוצג בירוק וכתם נגד גרעינים עם ווים המוצג בכחול מדידה של תהליכי אקסון בוצעה בעזרת תוכנת ניתוח תמונה. השוואה של צמיחת תהליך אקסון בין H nscs שגדלו עם פיגומים תלת מימדיים ועם משטח שטוח מסורתי או תרביות דו-ממדיות מראה שתוך שבוע או שלושה שבועות HSCs המובחנים בתלת מימד הראו צמיחה גדולה יותר של תהליך אקסון.

ניתוח חישובי לחיזוי מטרה הביא למידע המוצג כאן רשימה של מיקרו-רנ"א חזו גנים וציון דיוק וערכים מצטברים. SOX 5 ו-NR 4 A 3 זוהו כגנים מטרה משוערים. נעשה שימוש במבחן מדווח לוציפראז כפול כדי לאמת את המטרות של המיקרו-רנ"א כפי שמוצג כאן.

פעילות לוציפראז יחסית משלושה מדווחי UTR ראשוניים אנושיים של SOX 5 ו-NR 4 A שלושה הופלה באופן משמעותי בנוכחות המיקרו-RNA שצוינו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להבדיל אותו בתאי גזע עצביים ולחקור ביטוי מיקרו RNA ואימות של Messenger.RNA מטרה.