Name: באוב אפרוח chorioallantoic ממברנה (CAM) כמודל xenograft יעיל של Hepatocellular Carcinoma (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: למדו שיטת קסנוגרפט CAM אמינה לחקר קרצינומה של תאי הכבד (HCC) באמצעות ביצי עוף. מודל זה מאפשר צמיחת גידולים תלת-ממדיים מווסקולריים עם שרידות עוברית של עד 93% לבחינת אנגיוגנזה ופיתוח טיפולים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S. נתמך בחלקו על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH), המכון הלאומי לחקר שיניים וגולגולת פנים (5R03DE021741-02) והמכון הלאומי לסרטן (1K08CA154963-01A1). 
המכון הרפואי הווארד יוז סיפק מימון ל-M.L. באמצעות תוכנית עמיתי המחקר הרפואי של HHMI.

דגירה 1. ביצה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג ביצי 8 יום ישנים ספציפיות הפתוגן ללא embryonated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הביצים במגש מסתובב ביצה, קצות חותמת יפנו כלפי מעלה, ומניח את המגש מסתובב בתוך חממת ביצה. דגירה ביצים במשך 48 שעות ב 36 מעלות צלזיוס ולחות של 50%. </li></ol> 2. הפלת CAM ופתיחת הביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ביצים מחממה. ביצי מקום במדף ביצה, חותמת הצד, ולהביא לזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות בחדר ומכסה מנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הקצה חותם של ביצה קלה לקנדלר הביצה כדי לחשוף את כלי הדם של CAM, כמו גם את שק האוויר. הערה: קנדלר הביצה הוא מקור אור המציג את העובר המתפתח וצק האוויר קשור וכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מציב סימן עיפרון בין שני כלי דם גדולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדליק את האורות ולהשתמש סיכה לדחוף סטרילי לעשות חור אחד בקצה הביצה מעל (סוף החותמת) שק האוויר וחור אחד בPEסימן ncil. לא לדחוף הסיכה לדחוף לאורך כל הדרך; חור בסביבות 3 מ&quot;מ עמוק בדרך כלל יספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכבות את האורות. לסחוט הנורה בטיחות, לחיצה על הקצה הפתוח בתקיפות נגד החור מעל שק האוויר. החל יניקה לשאוף אוויר אל תוך החור בסימן העיפרון, גורם CAM לרדת מהפגז בסימן העיפרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שצק האוויר עבר מהקצה החותמת של הביצה לחור מסומן העיפרון באמצעות קנדלר. אם לא, השתמש בסיכת הדחיפה לעשות שני החורים מעט עמוקים יותר ולאחר מכן להירשם מחדש באמצעות שאיבת הנורה הבטיחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדלק את האור. מחזיק את הביצה ביד אחת, להפעיל את הכלי הסיבובי DREMEL עם חתך גלגל 15/16 אינץ &#39;המצורף ולעשות שני חתכים רוחביים רק עמוק מספיק כדי לחתוך דרך הקליפה אבל לא עמוק מספיק כדי לחתוך את כל הדרך עד לדיכאון CAM. להפוך את החתכים סביב 2 סנטימטר באורך 1 סנטימטר ומלבד אחד את השני. הפוך את הקיצוצים רחבים מספיק כך שטבעת סיליקון 1 סנטימטר קוטר יכול לעבור דרךאבל רזה יותר רוחב הסרט דביק לסטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לעשות חתך אורכי 1 בין ובקצוות של שני חתכים רוחביים בקלילות הנגיעה הגלגל החתוך לקליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Slide מלקחיים סטריליות תחת חתיכת קליפה ובמקביל לקליפה. תפוס את חתיכת הקליפה עם המלקחיים ולהסיר את כל החתיכה נקיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים נייר דבק מעל החלון החדש שנפתח, והקפד לקפל קצה אחד מעל בעצמו על מנת להקל על ההסרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי מקום בחזרה בחממה במגש הביצה (לא במדפי הביצה מסתובבים) עד הזמן של חיסון. </li></ol> 3. הרכבת חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תערובת חלבוני קרום במרתף, כגון Matrigel, על קרח (כדי למנוע פילמור) ומקום במכסת מנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 2 מ&quot;מ EDTA לנתק תאים (4 - 5 מיליליטר לכל בקבוק T75) וצלוחיות מקום בתרבית רקמת חממה במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים המנותק בתקשורת ולספור באמצעות hemocytometer וtrypan כחול. השתמש בין 500,000 to 2,000,000 תאים להשתלה על CAM, בהתאם לקו תא. לייעל את המספר הנכון בניסויים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד הנדרש למספר תא המתאים וצנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ואז resuspend תא גלולה ב 40 μ l של PBS ++ ו- 20 μ l של תערובת קרום במרתף. הערה: בשלב זה, ניתן לטפל בתאים עם סמים או סוכני מבחן אחרים כנדרש לניסויים על ידי resuspending להשעית תערובת קרום תא / מרתף. לחלופין, ניתן pipetted סוכנים על ההשעיה תערובת קרום תא / מרתף לאחר השתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר מדף ביצה עם ביצים מן החממה והמקום בזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת לקלף את החלון, לשלוף טבעת סיליקון 1 מ&quot;מ מהכובע של בקבוקון קריוגני באמצעות מלקחיים מעוקרים, ושחרר את הטבעת דרך החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mixtur Pipet פתרון תא l 60 μ של PBS ++ וקרום במרתףדואר ישירות למרכז זירת סיליקון נח על CAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-קלטת החלון ולעבור מדף ביצה חזרה לחממה. בשלב זה, בזהירות בעת הזזת הביצים כטבעת והשעית התא יכול בקלות להיות שנעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר גידולים לגדול במשך 5 עד 7 ימים. </li></ol> 4. גידולי קציר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מתחת לכרית במכסת מנוע. הכן 35 x 10 מ&quot;מ צלחות ומכולות paraformaldehyde לפי צורך להיסטולוגיה. שים 1 מיליליטר PBS ++ בכל צלחת 35 מ&quot;מ x 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שקית Biohazard במכסת מנוע. קח מספריים לנתיחה סטרילית והכנס את הקצה המחודד לביצה בחור קרוב לסוף החותמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך סביב כל הביצה longitudinally. הערה: CAM והגידול עם הטבעת צריך לדבוק במחצית העליונה של הקליפה עם החלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה ומלקחיים, לנתח את הגידול מCAM ולמקם את הגידול בצלחת 35 מ&quot;מ x 10. למדוד ולשקול גידולים. גידולים קבועים בparaformaldehyדה ולאחר מכן פרפין-להטביע אותם לשימוש בניסויי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה. </li></ol> 5. (אופציונאלי): דיסוציאציה תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים לנתיחה כדי לרכך את הגידול בצלחת 35 מ&quot;מ x 10. יוצקים גידול טחון לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות ולהסיר כמה שיותר PBS ++ ככל האפשר באמצעות pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של collagenase (1 מ&quot;ג / מיליליטר PBS ++), להפוך את הצינור על פני כמה פעמים, ודגירת צינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות (עד כמה שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר תקשורת על צינור אחד וresuspend ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 20 - 40X. pipetting היסודי הוא קריטי לתא דיסוציאציה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר משקעים להתיישב, ולהעביר את supernatant לצינור טרי. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. הסר supernatant, משאיר מאחורי תא גלולה ניתק. הערה: בשלב זה, כדורי תא יכולים לשמש לניסויים שונים (cytometry זרימה, תמוגה לשימוש בסופג מערבי, בידוד RNA, וכו &#39;). ניתן להשיג ספירת תאי גידול כוללת באמצעות hemocytometer וצביעת trypan כחולה. שימו לב שתאים קטנים יותר, סגלגלים הם תאי עוף מCAM ולא צריך להיחשב כתאים סרטניים. לא צריך להיות מספר מינימאלי של זיהום תאים שאינם סרטניים (CAM) אם הגידול הוא גזור מCAM בזהירות. </li></ol>

<ol><li>Sangiovanni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+of+cirrhotic+patients+with+a+hepatocellular+carcinoma+detected+during+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance.</a> Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).</li>
<li>Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review%3A+evidence-based+management+of+hepatocellular+carcinoma--an+updated+analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials.</a> Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).</li>
<li>Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma.</a> Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent.</a> J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Dumartin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+mediates+early+events+in+pancreatic+adenocarcinoma+progression%2C+acting+on+tumor+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells.</a> Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).</li>
<li>Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK%28MAPK%29+activity+as+a+determinant+of+tumor+growth+and+dormancy%3B+regulation+by+p38%28SAPK%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK).</a> Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).</li>
<li>Baroni, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomic+and+short+hairpin+RNA+gene+silencing+methods+to+explore+functional+gene+programs+associated+with+tumor+growth+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest.</a> Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).</li>
<li>Lopez-Rivera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+drives+mTOR+pathway+activation+and+proliferation+of+human+melanoma+by+reversible+nitrosylation+of+TSC2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2.</a> Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+in+vivo+model+for+giant+cell+tumor+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone.</a> BMC Cancer. 11, 241(2011).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Res Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Sys, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+ovo+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J Vis Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ossowski, L., Reich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+for+quantitative+study+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental model for quantitative study of metastasis.</a> Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).</li>
<li>Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+do+not+arise+from+tumor-initiating+cells+in+human+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma.</a> BMC Cancer. 13, 485(2013).</li>
<li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+novel+immunomodulating+agent%2C+FTY720%2C+on+tumor+growth+and+angiogenesis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma.</a> Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+coordinates+interaction+of+pericytes+and+endothelial+cells+during+vasculogenesis+and+experimental+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis.</a> Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).</li>
</ol>

A.S מקבלת מימון מחברת התרופות Advaxis כדי לתמוך בניסוי קליני ביוזמת החוקרים.

כמה שלבים עיקריים בפרוטוקול זה סביר ביותר להסביר את ההישרדות העוברית המשופרת, כמו גם אמינות מוגברת של צמיחת גידול. הפלת CAM מהפגז על ידי יישום יניקה לצק האוויר היא פחות פולשני יותר משיטות קיימות אחרות (באמצעות מחט כדי להסיר אלבומין מהביצה, לנתיחה בוטה, וכו &#39;). באמצעות סיכה לדחוף סטרילי כדי ליצור שני חורים קטנים הנדרשים לשיטה זו הוא החלק המאתגר ביותר של הפרוטוקול. שימוש בכוח רב מדי עלולה לגרום נזק לכלי הדם וCAM דרך על-חדירה עם פין הדחיפה או אפילו יכול לגרום לפיצוח או להרוס את ה...

קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא הגורם המוביל 3 בתמותה מהסרטן בעולם 1. כיום רק 30% מחולי HCC זכאים לטיפולים כירורגיים פוטנציאל מרפא 2, וכימותרפיה מערכתית אינה יעילה 3. לכן, יש צורך דחוף שלא סופקו קליני לטיפולי HCC רומן, והפיתוח של מערכות מודל מתאימות לבדיקות יעילים של סוכנים חדשים. Assay חומוס chorioallantoic קרום (CAM) מספק שיטה לשחזור, חסכונית, מהירה ובינונית תפוקה של בדיקת תרופות אנטי-סרטניים פוטנציאליות in vivo. Assay CAM כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד אנגיוגנזה 4. כמו כן פיתח בהצלחה למודל xenograft גידול של סרטן, כולל גליובלסטומה 5, סרטן לבלב 6, מלנומה 7-9, ואוסטאוסרקומה 10-11. שני באובו 12 ולשעבר אובו13 טכניקות כבר נוצלו בספרות, עם פרטים שונים מפרוטוקול לפרוטוקול. אחד אתגרים עיקריים למודל xenograft CAM הוא יחסית השכיחות הגבוהה של מוות עוברי לאחר המניפולציה של הביצה, עם שיעורי תמותה שפורסמו עובר אפרוח החל 25-50 אחוזים 11-14. במאמר זה, אנו מתארים את הפיתוח של מודל באוב xenograft של HCC שמייצר באופן מהימן צמיחה של גידולים תלת-ממדיים, כלי דם שהיסטולוגית דומה HCC מובחן. יש לנו מותאם פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Ossowski et al. 14 והשיגו שיעורי הישרדות חומוס עוברי של עד 93% בקליטתם גידול גבוה מאוד.

<table><tbody><tr><td>ביצים מודגרות פרימיום</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>N / A</td><td>http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx</td></tr><tr><td>חממות ביצים</td><td>GQF</td><td>Hova-Bator 2362N</td><td></td></tr><tr><td>מגשי ביצים מסתובבים</td><td>GQF</td><td>1611 אוטומטי טרנר</td><td></td></tr><tr><td>ביצים נר ליון</td><td></td><td>Hi-Power 950-070</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 100 כלי סיבובי עם גלגל חיתוך 15/16</td><td>Dremel</td><td>100-N/7</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטריליים, סיכת דחיפה, מספריים לדיסקציה, סקוטש Matrigel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקונים קריוגניים, חוט חיצוני עם מכונת כביסה מסיליקון</td><td>קורנינג</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז מבית Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C9891</td><td></td></tr></tbody></table>

<em&gt; באוב</emassay&gt; אפרוח chorioallantoic ממברנה (cam) כמודל xenograft יעיל של hepatocellular carcinoma

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

קרום החומוס chorioallantoic (רמ&quot;א) מתחיל לפתח על ידי יום 7 לאחר הפריה ומתבגר ביום 12. CAM הוא באופן טבעי immunodeficient וכלי דם מאוד, מה שהופך את מערכת אידיאלית להשתלת גידול. יתר על כן, CAM מכיל חלבונים תאיים מטריצה ​​כגון פיברונקטין, laminin, קולגן, אלפא integrin (נ) beta3, וMMP-2, מה שהופך את מודל אטרקטיבי ללמוד פלישת גידול וגרור. מדענים רבים ניצלו את הפיסיולוגיה של CAM על ידי שימוש בו כמודל של אנגיוגנזה. לאחרונה, assay CAM שונתה כדי לעבוד כמערכת in vivo xenograft מודל לסוגי סרטן שונים שמגשרת על הפער בין עבודה בסיסית במבחנה ודגמי סרטן בבעלי החיים מורכבים יותר. Assay CAM מאפשר לחקר צמיחת גידול, טיפולים אנטי-סרטניים, ומסלולים מולקולריים פרו-סרטניים במערכת רלוונטית מבחינה ביולוגית שהוא גם עלות וזמן יעיל. כאן, אנו מתארים את ההתפתחות של Xen CAMמודל ograft של קרצינומה hepatocellular (HCC) עם שיעורי הישרדות עובריים של עד 93% וגידול אמין לקחת מוביל לצמיחה של גידולים תלת-ממדיים, כלי דם.

תמונות נציג של שלבים עיקריים בפרוטוקול מוצגות כאן. איור 1 א מדגים את השימוש של קנדלר לדמיין את העובר המתפתח, שק האוויר, וכלי הדם של CAM. איור 1-1C להראות את התהליך של נשירת CAM על ידי ביצוע שני חורים ולאחר מכן הפעלת לחץ שלילי באמצעות הנורה הבטיחות, ו1D איור מראה ירד בהצלחה CAM עם בועת אוויר גדולה מתחת לחור מסומן העיפרון. איור 1E ואיור 1F להדגים את השימוש בכלי הסיבובי DREMEL לעשות דרוש קיצוצים בפגז מעל בועת האוויר ...

הממברנה הכוריואלנטואית של הגוזל (CAM) היא חסרת חיסון ובעלת כלי דם גבוהים, מה שהופך אותה למודל טבעי in vivo של צמיחת גידול ואנגיוגנזה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה אמינה לגידול גידולי קרצינומה תלת מימדיים של הכבד (HCC) באמצעות בדיקת CAM.

<em&gt; באוב</emAssay&gt; אפרוח chorioallantoic ממברנה (CAM) כמודל xenograft יעיל של Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא לפתח מודל אמין של שיבוי זרות (xenograft) של קרצינומה התאית של הכבד בממברנה קוריאלית (cam). מטרה זו מושגת תחילה על ידי דגירה של הביצים כדי להכינן אותן להזרקה. בשלב השני, מנמיכים את הקליפה ואת הממברנה החלבונית, או את ה-cam של הביצה, ונחתוך חלון בקליפת הביצה.בשלב הבא, מחדירים לתבנית תאי קרצינומה של תאי כבד אנושיים דרך חלון קליפת הביצה במטרה להבטיח צמיחת גידול. התוצאות מראות כי גודלו בהצלחה גידולים מvסוכלים בתלת-ממד באמצעות שורות תאים של קרצינומה של תאי כבד אנושיים. באמצעות פרוטוקול זה, הושגו שיעורי הישרדות עובריים של עד 93%.היתרונות המרכזיים של בדיקת ה-CAM על פני טכניקות in vivo אחרות, כגון מודלים של גידולי עכבר, הם זמן ביצוע קצר של הבדיקה הניסוית, עלות כוללת נמוכה של הניסוי וזמינות. בדיקות CAM יכולות לשמש למחקר של אנגיוגנזה, גידולים, פלישת תאים וגרורות. הן יכולות לשמש גם לקביעת השפעתם של מולקולות קטנות ותרופות על צמיחה והתפתחות של גידולים.הדגמה ויזואלית של פרוצדורה זו היא חשובה מכיוון שהשלבים השונים בהכנת הביצה כוללים בדיקה באור (candling), זיהוי של כלי הדם, ביצוע נקבים קטנים ליד תאי האוויר ובחלק העליון של הביצה מבלי לרוקן אותה. פתיחת החלונות ללא סדקים בקליפת הביצה והבטחה שהעובר נשאר שלם לאורך כל התהליכים עשויים להוות אתגר עבור משתמשים חדשים. כדי להתחיל, הניחו.ביצים של תרנגולות מקומיות (native chicken) בני שמונה ימים, נקיות מפתוגנים ספציפיים (SPF), במגש ביצים מסתובב כאשר הצד המסומן פונה כלפי מעלה. הניחו את המגש המסתובב בתוך מדגרה בטמפרטורה של 36 °C ובלחירות של 50% והדגירו את הביצים למשך 48 שעות. לאחר הדגירה, הניחו את הביצים במתקן לביצים כאשר הצד המסומן פונה למעלה והעבירו אותן למכסוף זרימה למינרית (laminar flow hood).כבו את אורות החדר והמכספה, והצמידו בעדינות את הקצה המסומן של הביצה למכשיר הדיור (egg candler) כדי לחשוף את כלי הדם של העובר, את קרום ה-Chorio Allantoic (המכונה CAM) ואת תאי האוויר. סמנו בעיפרון נקודה בין שני כלי הדם העיקריים. לאחר מכן, צרו חור אחד בקצה הביצה מעל תאי האוויר בצד המסומן, וחור שני בנקודה שסומנה בעיפרון.באמצעות סיכה סטרילית, יש ליצור חור בעומק של כ-שלושה מילימטרים. סחטו את האוויר מנורת ואקום (safety bulb) והדביקו בחוזקה את הקצה הפתוח אל החור שמעל שקיק האוויר. שחררו את הנורה באיטיות כדי ליצור ואקום שימשוך אוויר אל החור בסימון העיפרון ויגרום לקאם (cam) להיפרד מהקליפה.אשרו באמצעות המכשיר לבדיקת ביצים (candler) ששק האוויר עבר מהקצה המסומן של הביצה אל החור שסומן בעיפרון. אם לא כך, הגדילו מעט את עומקם של שני החורים ושאינו שוב באמצעות פומפית הבטיחות. לאחר מכן, אחזו את הביצה ביד אחת והשתמשו בכלי רוטטורי עם דיסקיות חיתוך בקוטר 1/16 אינץ'.בצעו שני חיתוכים רוחביים דרך הקליפה מבלי לגעת ב-cam. אורך כל חיתוך צריך להיות שני סנטימטרים, והמרחק ביניהם סנטימטר אחד. לאחר מכן, בצעו חיתוכים לאורך בקצוות שני החיתוכים הרוחביים על ידי נגיעה קלה של גלגל החיתוך בקליפה.כדי להסיר את הקליפה, החליקו פינצטה סטרילית מתחת לחלק הקליפה ובמקביל לו. תפסו את החלק באמצעות הפינצטה והסירו אותו בנקיון. החזיקו קצה אחד של פס סרט דביק מקופל על עצמו, ולאחר מכן הניחו את הסרט מעל הפתח בביצה.הניחו את הביצה במגש ביצים והכניסו את המגש למדגרה ללא סיבוב למשך לא יותר משעתיים עד שלוש שעות לפני ההחדרה. כדי להכין את התמיסה להחדרה, הניחו תערובת חלבוני קרומי בסיס, כגון matrigel, על קרח כדי למנוע פולימריזציה. לאחר מכן, השתמשו ב-4 עד 5 mL של תמיסת EDTA בריכוז 2 mM לכל בקבוק כדי לנתק את תאי הגידול, והכניסו את הבקבוק למדגרה לתרבית רקמות למשך חמש דקות.לאחר מכן, השעו את התאים שהסרו בנוכחות המצע וספרו את מספר התאים. השתמשו בין 500,000 ל-2 מיליון תאים להשתלה על ה-cam, בהתאם לסוג שורת התאים. לאחר מכן, העבירו לנבובת חדשה את הנפח הדרוש להשגת מספר התאים המתאים וסובבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות.ב-500 ×g, השליכו את העלייה (supernatant) והשעיכו מחדש את משקע התאים. ב-40 µL של PBS המכיל סידן ומגנזיום, המכונה PBS++, וב-20 µL של תערובת קרום בסיס (basement membrane mixture). בשלב זה, ניתן להוסיף תרופות או חומרי בדיקה אחרים לתמיחת התאים.בשלב הבא, מקם את מגש הביצים במכסה הזרימה הלמינרית. קלף את הסרט מהביצה והנח טבעת סיליקון סטרילית בקוטר 1 mm מבקבוב קריוגני דרך הפתח אל תוך צינור המצלמה. הזרק 60 µL מהתמיסה של תאי, PBS++ ותערובת קרום בסיס למרכז טבעת הסיליקון, הדבק מחדש את החלון והחזר בזהירות את מגש הביצים למדגרה.אפשרו לגידולים לגדול במשך חמישה עד שבעה ימים. לשם קצירת הגידולים, הניחו מדפס (underpad) ושק לפסחאות ביולוגיות במCב (hood).הכינו פלטות בגודל 35 מילימטר על 10 מילימטר המכילות 1 מיליליטר של PBS++ ומכלי פאראפורמלידה כפי שנדרש להיסטולוגיה. הכניסו את הקצה המחודד של מספרי ניתוח סטריליים לתוך הביצה דרך החור שקרוב לקצה החתום, וגזרו לאורך כל הביצה. ה-cam והגידול עם הטבעת צריכים להיצמד לחצי העליון של הקליפה עם הפתח.הוצא את הגידול מהעכבר באמצעות דיסקציה, מספריים ופינצטה, והנח את הגידול בצלחת בגודל 35 מילימטר על 10 מילימטר. מדוד ושקול את הגידול. קבע את הגידול ב-paraform, aldehyde וטמיעה בפרפין לשימוש בניסויי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה.לאחר קצירת הגידול, קצצו את הגידול בצלחת באמצעות מספרי ניתוח. לאחר מכן, העבירו את הגידול הקצוץ למבחנה לצנטריפוגה בנפח 15 milliliter והסִירו את ה-PBS plus plus באמצעות פיפטה. הוסיפו שני milliliters של תמיסת collagenase בריכוז one milligram per milliliter ב-PBS plus plus וערבבו על ידי הפיכת המבחנה מספר פעמים.דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לפחות ועד מספר שעות. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 5 mL של מצע ותערבבו היטב באמצעות פיפט 20 עד 40 פעמים. שלב זה קריטי להפרדה מלאה של התאים.לאחר שהמשקע שקע, העבירו את ה-snat למבחנה נקייה, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך חמש דקות, והסילו את הנוזל העליון כך שיישאר משקע התאים המנותקים. כאשר ה-cam הושב עם תאי גידול HUH seven, נראה גידול מרוויין בכלי דם בתוך הטבעת. לאחר חמישה ימי צמיחה, היסטולוגיה של גידול HUH seven מתוך בדיקת ה-CAM הראתה כי תאי הגידול דומים לתאי קרצינומה של תאי כבד (hepatocellular carcinoma) לא מובחנים.בעת עבודה עם שיטה זו, חשוב לזכור כי עשויים להידרש אופטימיזציות מסוימות בכל הנוגע לסוגי תאים שונים או לסוגי תרופות שונים. לדוגמה, קווי תאים מסוימים עשויים להזדקק לצפיפויות גבוהות או נמוכות יותר כדי להוות גידולים תלת-ממדיים.

the-ovo-chick-chorioallantoic-membrane-cam-assay-as-an-efficient

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Chorioallantoic חומוס קרום (רמ"א) הוא ייחודי, immunodeficient באופן טבעי בסביבה תומכת תרבות ללמוד אנגיוגנזה tumorigenesis. מאמר זה וידאו מדגים את השלבים השונים...

אפרוח אובו לשעבר תרבות אובו לשעבר CAM Assay: איך זה באמת עובד

בסרטון זה, אנו מתארים השתלה של תאים סרטניים על קרום כוריואלנטואי של תרנגולת כדי ליצור מודל in ovo. המודל משתיל בהצלחה את תאי סרטן השחלות כדי לחקור את התקדמות הסרטן הגינקולוגי.

מודל סרטן מבוסס קרום עוף Chorioallantoic: מודל In Ovo לחקר גידולים וגרורות של תאים סרטניים

בסרטון זה, אנו מתארים את השיטה לתרבית משותפת של גרעיני שורש גביים ותאים סרטניים על קרום כוריאואלנטואי אפרוח או CAM כדי לחקור פלישה פריעצבית.

Chick Chorioallantoic Membrane או CAM Tumor Model: שיטת In Ovo להדמיית פלישה פריעצבית של תאי גידול

סרטון זה מדגים את בידודו של קרום כוריאואלנטואי נושא גידול מעובר התרנגולת. ניתן להשתמש ב- CAM שנקצר ליישומים נוספים במורד הזרם.

קציר קרום צ'וריואלנטואי אפרוחים: שיטה לבידוד קרום כוריאואלנטואי נושא גידול מביצת תרנגולת

<em&gt; באוב</em&gt; CAM-assay כXenograftmodel לסרקומה

הפלישה הנקבים הוא פנוטיפ אגרסיבי הראש והצוואר קרצינומה של תאים וגידולים אחרים. מודל הממברנה של האפרוח שימש ללימוד אנגיוגנזה, הפלישה לסרטן וגרורות. כאן אנו מדגימים כיצד מודל זה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את הפלישה הנקבים בvivo.

ממברנה של צ'יק כוראלאנטוניק במודל Vivo להערכת הפלישה לתוך הראש ולסרטן הצוואר

ברור גרורות תא כליות קרצינומה של תאים היא מחלה ללא מודל בעל חיים כולל לחקירה יסודית מראש. פרוטוקול זה ממחיש שני מודלים של בעלי חיים חדשניים עבור המחלה: מודל העכבר המושתל אורתולמריחה ומודל ממברנה של עוף כוראלואלי, שניהם הפגינו גרורות בריאות הדומה למקרים קליניים.

השוואת הכליה גרורות תא כליות קרצינומה של תא מודל הוקמה בתוך כליה העכבר על עוף כוראולאלי ממברנה

אנו מציגים את המודל ממברנה העוף כוראואליאלי כחלופה, השתלה שולחן, במודל vivo עבור החרט של גינקולוגית ואורולוגית תאים לסרטן וגידולים הנגזר החולה.

שימוש בקרום כוראלאלי ממברנה במודל Vivo כדי ללמוד גינקולוגית ואורולוגיים סרטן

פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות כיצד להשיג ולהשתמש בעוברי עוף בני 5 עד 8 ימים ובממברנה הכוריאואלנטואית שלהם (CAM) כמודל in vivo לחקר הדמיית אולטרסאונד משופרת ניגודיות ואספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות.

הכנת עוברי עוף אקס אובו וכלי קרום כוריואלנטואיים כמודל In Vivo להדמיית אולטרסאונד משופר ניגודיות ומחקרי אספקת תרופות בתיווך מיקרו-בועות

במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לפיתוח מודל קסנוגרפטינג של קרום כוריואלנטואי אפרוח (CAM) עבור רקמת שחלה אנושית ומדגימים את יעילות הטכניקה, מסגרת הזמן של רה-וסקולריזציה של השתל ויכולת הקיום של הרקמה על פני תקופת השתלה של 6 ימים.

מודל הממברנה הכוריאואלנטואית של אפרוח (CAM) ככלי לחקר השתלת רקמת שחלה

למדו שיטת קסנוגרפט CAM אמינה לחקר קרצינומה של תאי הכבד (HCC) באמצעות ביצי עוף. מודל זה מאפשר צמיחת גידולים תלת-ממדיים מווסקולריים עם שרידות עוברית של עד 93% לבחינת אנגיוגנזה ופיתוח טיפולים.

גלה סרטונים נוספים