Name: טיפוח Heligmosomoides Polygyrus: נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: למדו כיצד לטפח את הנמטודה Heligmosomoides polygyrus בעכברים ולבודד מולקולות מופרשות בעלות תכונות מדכאות חיסון. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני דיכוי חיסוני ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים ממומנים על ידי קרן וולקאם באמצעות המסלול האקדמי הקליני של אדינבורו (C.J.C.J.) ומענק תוכנית (Y.H., ו-R.M.M.) ומימון מלגות (J.R.G), BBSRC (G.C.), הקרן האמריקאית לאסתמה (E.R., H.J.MCS. ו-R.M.M.), אסתמה בריטניה (H.J.MCS.) וקרן ריינין (D.J.S. ו-R.M.M).

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה מבוצעת בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי משרד בית אנגליה ואוניברסיטת השירותים הווטרינריים אדינבורו. 1. זיהום של עכברים על ידי Gavage <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות זחלי Heligmosomoides polygyrus L3 במים מזוקקים עד שישה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, לשטוף זחלי L3 שלוש פעמים במים מזוקקים: צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות (עם בלם), להסיר את כל אבל 500 μl של מים (כדי למנוע זחלי L3 טבליות מטרידים) וresuspend גלולה בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטיפה השלישית, מוסיף מים עד לנפח מדויק (בדרך כלל 40 מיליליטר) ולשאוב 20 μl עם חתך טיפ 200 μl להרחיב צמצמה. מניחים שתי 20 דגימות μl על פני השטח של צלחת תרבות 60 מ&quot;מ ולספור את זחלי L3 (בדרך כלל ניידת, ונראה במיטבו תחת 50X הגדלה עם מיקרוסקופ לנתח). Resuspend גלולה הסופיים במים מזוקקים לconcentration של 2,000 זחלי L3 לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצור מעגל חיים, להדביק (C57BL / 6xCBA) עכברים 8 שבועות בן F1 עם 400 H. זחלי polygyrus L3 ב 200 μl של מים מזוקקים על ידי gavage האוראלי (לרסן את העכברים במצב הזקוף בעורף ובעדינות להעביר את מחט gavage הבוטה דרך הפה והוושט לקיבה). להתסיס ביסודיות לפני כל זיהום (זחלים ליישב במהירות במים) ולשאוב 200 μl במזרק 1 מיליליטר; להשתמש במחט gavage ייעודית עם קצה מעוגל. לזיהום ניסיון של עכברים צעירים (6-8 שבועות), או זנים טהורים אחרים (למשל C57BL / 6 או BALBc), להדביק עכברים עם 200 זחלי L3. </li></ol> 2. רביה ותחזוקה של H. polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פחם במרכז אמבטיה פלסטיק גדול ומאפשר למים ברז קרים לדרוס אותו למינימום של 30 דקות (לא רחוץ פחם פעיל הוא רעיל לזחלי L3). מסננים את המים מהאמבטיה ולמקם את הפחם על tוו שכבות של נייר סופג, והשאירו אותו חשוף לאוויר חדר עד יבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצים נדרשות, לגרד צואה הראשונה מתוך המעי הגס עם מלקחיים (ומספריים במידת צורך). אם יש צורך במספר גדול של זחלי L3, מקום עכברים על רשת תיל ולאסוף כדורי צואה על פני כמה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הצואה עם פחם מגורען ביחס של לפחות 1: 1, כדי להשיג עקביות פשוט רטוב מספיק כדי לדבוק לסנן נייר. למרוח שכבה דקה על המרכז של כמה נייר סינון לח בצלחת פטרי ומניח את זה בתיבה לחה (להוסיף קצת נייר מגבת לחה וקערת מים) בחושך במשך 12-14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר זחלי L3 מיום 7 ואילך, ולאסוף אותם, לפחות בשתי הזדמנויות לפני שהנייר שהושלך. הזחלים יוצרים טבעת מסביב לקצה של נייר הסינון; הרם את נייר הסינון מצלחת פטרי ולשטוף את הזחלים שנשארו מהצלחת (בעזרת פיפטה ו -5 מיליליטר של מים סטריליים לכל צלחת) לתוך צינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Liftאת נייר הסינון ולאסוף את הזחלים שנותרו נשארו בצלחת עם מים מזוקקים לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה פתרון השפכים ב XG 300 עבור 10 דקות. שטוף את הזחלים שלוש פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס בעד 50 מיליליטר של מים מזוקקים עד נדרשת. הערה: הזחלים להישאר קיימא ומזהם במשך לפחות 6 חודשים. </li></ol> 3. אוסף של H. מבוגרים התולעים polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשירי Baermann שונה מראש, כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים ללקט ארבע עשרה ימים לאחר ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבטן עם אתנול 70%. חותך את העור מעל הבטן ולמשוך בחזרה כדי לחשוף את דופן הבטן הקדמית. לעשות חתך קו האמצע כדי להיכנס לחלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי כולו קטן וגדול (מתריסריון הפרוקסימלי לרקטום דיסטלי). הנח לצלחת פטרי יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הבטן לכל אורכו; בלו מעי גס צואה המכיל; את המקום הזה לצלחת נפרדת להכנות ביצה מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו 20 סנטימטרים הפרוקסימלי של מעי דק שמכיל את התולעים בוגרות -identified על ידי הקיר העבה יחסית של התריסריון, ולעתים קרובות מראה אדום בשל תולעי התוך luminal. הנח לתוך צלחת פטרי (100 מ&quot;מ קוטר) עם 5 מיליליטר של הפתרון &#39;הנקס, חימם עד 37 ° C (שתי דגימות לכל צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלק מעי הפרוקסימלי מלא תולעת longitudinally עם מספריים (מספריים הסתיימו עגולים הם הטובים ביותר לכך), ולגרד את החלק הפנימי של מעי בטנה עם שתי שקופיות זכוכית כדי להסיר את התולעים. ואז להשליך את קיר הבטן הנקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעי טיפ לשקיות מוסלין קטנים, מצרך סגור ובטוח עם מהדקים מסביב לקצה של משפך הזכוכית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא משפך עם הפתרון &#39;הנקס ולהוסיף כ 4 צלחות פטרי של תולעים לכל משפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון מקום 37 ° C חממה במשך 1-2 שעות, בעדינות להסעיר חצי דרך כדי לסלקפסולת ממעי ההכנה שעשויה לחסום את מסנן המוסלין. תשמור על עצמך, כדי למנוע דליפה של פסולת מחוץ לשקית המוסלין - זה יגרום זיהום של הכנת הס הסופית. צריכה היגרו תולעים בוגרות באיטיות דרך בד המוסלין והתיישבו בחלק התחתון של מבחנת זכוכית. לנתק בזהירות את המבחנה מצינור גומי חיבור מעל הכיור (טיפול כדי למנוע אובדן של תולעים בשלב זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את התולעים לתוך צינור 50 מ&quot;ל ולשטוף שש פעמים עם הנקס &#39;פתרון (לאפשר תולעים להתיישב עם כוח הכבידה, להסיר תקשורת עם stripette, להוסיף 40 מיליליטר של הנקס&#39; הפתרון וחזור חמש פעמים). הערה: תרבות תולעת חייבת להישמר סטרילי מנקודה זו ואילך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לזרימה למינרית ולשטוף עוד שש פעמים בפתרון &#39;הנקס סטרילי בתוספת 100 U / ml פניצילין ושל 100 מק&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, מוכן לתרבות במבחנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזןתולעים בוגרות התאוששו על ידי לקיחת שתי דגימות של 20 μl נלקח עם קיצוץ קצה צהוב להרחיב צמצמה; מצפה כ -50% מהכמות של זחלים מחוסן. </li></ol> 4. הגדרת תרבויות להס: הכנה בינונית, כביסה תולעים בוגרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את התולעים מ3.11 בכ 10 מיליליטר של RPMI בתוספת 10% gentamycin במשך 20 דקות, והשאיר את מנוחת הצינור בזווית כדי להבטיח תולעים מכוסים במלואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את זה בזרימה למינרית: לשטוף שוב שש פעמים עם הפתרון &quot;הנקס (בתוספת 5 U / ml פניצילין ו5 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן H. תקשורת polygrus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על סטריליות בזרימה למינרית מכסה המנוע, 500 מיליליטר של RPMI1640, להוסיף 11.1 מיליליטר של 45% גלוקוז (ריכוז סופי 1.2% כRPMI1640 מכיל גלוקוז 0.2%), 5 מיליליטר של 100x Peniclllin סטרפטומיצין (ריכוז סופי 5 U / ml פניצילין, 5 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר), 5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 2 מ&quot;מ), ו5 מיליליטר של gentamycin (ריכוז סופי 1%). אל תוסיף FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעי Aliquot לתוך צלוחיות T25 פרקו, כ. 1,000 תולעים בH. 15 מיליליטר תקשורת polygyrus לכל בקבוק, ומקום זקוף ב -37 חממת ° C (5% CO 2) במשך 3 שבועות. </li></ol> 5. הכנת הס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף הס המכיל תקשורת ותרבות מתרבויות במרווחים של לא יותר מפעמיים בשבוע, להניח בצד את האוסף הראשון לאחר 24 שעות של התרבות (עקב רמות גבוהות של זיהום LPS וחלבוני מארח - יכול להיות מעובד בנפרד או שהושלך). שמור כל איסוף נפרד ומסומן עם מספר התאריך ויצווה בבירור. החלף עם נפח שווה של H. תקשורת polygyrus בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הס המכיל תקשורת ב 400 x גרם במשך 5 דקות. אז לסנן לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר מסננים דל חלבון מחייב לצינורות 50 מיליליטר. חנות ב-20 ° C במקפיא שכותרתו עם תאריך של קציר תולעת ותאריך ג הס ברורollection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 21 ימים של אוסף הס מתרבות, להשליך תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500-1,000 מיליליטר בריכה של supernatant הס (בדרך כלל ממניות קפוא, ולא כולל את אוסף שעות 24 הראשונים) ולהתרכז על מסנן 3,000 MWCO במכשיר אולטרה תחת לחץ חנקן. הערה: היה זהיר מאוד שלא לתת ליבש מסנן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את מכשיר הסינון, ראשון לשטוף את הצד המבריק 3 קרום kDa למטה בכוס 1 ליטר עם מים מזוקקים במשך 3 x 20 דקות תוך בחישה. להרכיב את מכשיר אולטרה סינון לפי הוראות יצרן עם קרום מסנן צד מבריק למעלה. מקום בארון על 4 מעלות צלזיוס ולהעביר 50 מיליליטר של מים מזוקקים דרך לפני שמתחיל להתרכז הס נקווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף צינור אחד של הס למכשיר הסינון כנדרש (100-140 מיליליטר ביום), עד הנפח מרוכז עד 2-5 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר מזהמים מכלי תקשורת התרבות הס המכיל, להוסיף 50 מיליליטר של PYRעוגן ללא PBS למכשיר הסינון ולאחר מכן להתרכז עד כ 2 מיליליטר. חזור על פעולה זו פעמיים (150 מיליליטר של PBS בסך הכל). העבר את הס לתוך צינור 15 מיליליטר, לעקר מסנן (עם מסנן 0.2 מיקרומטר) בזרימה למינרית ולמדוד ריכוז חלבון באמצעות ספקטרופוטומטר (E 280 = 10) או על ידי assay ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot, תווית עם מספר האצווה ותאריך, והקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay LAL chromogenic על פי הפרוטוקולים של היצרן על כל אצווה של הס לפני השימוש. אם רמות LPS הן גדולות מ -1 U LPS חלבון 1 מיקרוגרם ל, לשקול לא באמצעות אצווה זה לin vivo ניסויים או בתרבויות חוץ גופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הס שנאסף ב 24 שעות בנפרד באותו אופן; הוא יכיל LPS וכמה חלבוני מארח ו, ואילו אינו מתאים לניסויים פונקציונליים, היא מהווה מקור שימושי של מולקולות בודדות שעשויים להיות מבודדת על ידי טיהור זיקת נוגדן חד שבטי. </li></ol&gt;

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

מחזור החיים של H. תמורת polygyrus באופן מהימן ועקבי. בעקבות בליעה טבעית או gavage פה של זחלי L3 ביום 0, ציסטות מתחילות להיווצר מתחת לserosa התריסריון ביום 5, התקדמו לmoults זחל ולאחר מכן מתעוררות כמו תולעים בוגרות לתוך לום הבטן מיום 10, ניתן לראות ביצים בצואה מ יום 14 וגרנולומות גלויים על פני השטח serosal התריסריון מיום 21. הפרוטוקול שתואר לעיל (ומסוכם באיור 6) מאפשר לייצור תפוקה גבוהה של ח מוצרי polygyrus הפרשה-הפרשה (הס), בנוסף להתאוששות אמינה של זחלי L3 קיימא לזיהומי מחזור ניסיוניים וחיים בעתיד. זיהום polygyrus H. הוכח להיות מגן במודלים של אסתמה תלויות בOVA או Der p 1 (אלרגן קרדית אבק הבית) 14. יתר על כן, דיכוי הדלקת בדרכי אוויר יכול להיות מועבר עם CD4 + CD25 + </sup&gt; תאי T רגולטורים 14 או CD19 + CD23 תאי B רגולציה היי 24 מאינם רגישים, ח &#39; polygyrus -infected עכברים. במודלים של אוטואימוניות, ח &#39; זיהום polygyrus הוכח להיות מדכא במודל הניסויי Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE) של טרשת נפוצה 9, ודיכוי ניתן להעביר גם עם תאי CD4 + T או CD19 + B תאים מעכברים נגועים 24. חומרי ההפרשה-הפרשה polygyrus Heligmosomoides (הס) לווסת את התגובה החיסונית המארחת ולדכא דלקת בתיווך Th2 על ידי מספר המנגנונים (שמתוארים באיור 7), ובם: א) עיכוב של היענות תאים דנדריטים לגירוי 25, ב ​​אינדוקציה) של CD4 תאים + Foxp3 + רגולציה T 18. וג) מצור של IL-33 ייצור 20. הס הוכח להיות מגן כאשר מנוהלרגישות t או אתגר במודל OVA-אלום של אסטמה 19 וגם כאשר מנוהל intranasally עם האלרגן תמצית Alternaria 20, דרך דיכוי של IL-33 שחרור מוקדם. הימנעות מזיהום LPS של הס היא לעתים קרובות חיונית להצלחה של ניסויים חיסוניים עתיד. בפרוטוקול שתואר כאן, השלבים הקריטיים בהשגת מטרה זו הם להבטיח כי פסולת הכלול בתוך שקיות המוסלין של מכשירי Baermann לא נכנס להכנת הס הסופית (ראו 2.10) ולהניח בצד את פתרון ES מהשעה 24 הראשונה של תרבות (ראה 5.1). בשנים האחרונות, הס התאפיין ביסודיות ברמת proteomic עם מעל 370 חלבונים שונים זיהו 26,27. בנוסף, ES מזחלי שלב 4 כבר נתון לניתוח proteomic 28. עבודה שוטפת כוללת אפיון הרכיבים העיקריים של סוכרי הס, ידועים להיות מאוד חיסוני 3, ומופרשת מיקרו-RNשכגלומים 50-100 ננומטר שלפוחית ​​או exosomes (Buck et al., הוגשה לפרסום). עם הקמתה של פרוטוקולים לשחזור לאיסוף ES מטפיל המערכת החיסונית הזה מאוד, ועם נתונים proteomic נרחבים זיהוי הרכיבים המולקולריים של הס, השלב מוגדר כעת לזיהוי והבדיקה רפואית של מולקולות בודדות מH. polygyrus שיכול לתווך השפעות מרכזיות על המערכת החיסונית המארח.

polygyrus Heligmosomoides הוא helminth עיכול עכברי טבעי הקשור באופן הדוק לטפילי נמטודות אדם מאוד-נפוצים 1. בניגוד לדגמים אחרים, כגון נמטודות Nippostrongylus brasiliensis, ח &#39; polygyrus קובע באופן עקבי זיהום כרוני בעכברים כתוצאה ישירה של מנגנוני המערכת החיסונית חזקה מרובים היא מעסיקה כדי לדכא את התגובה חיסונית המארח 2. יש polygyrus H. מחזור חיים ישיר: זחלי L3 מזהמים הם מעובדים על ידי העברת feco-שבעל-פה (או מנוהלים על ידי gavage האוראלי במעבדת ההגדרה), ואז הם נודדים לשכבת subserosal של התריסריון וencyst לפני ההחזרה ללומן המעי כ תולעים בוגרות שמונה כ ימים לאחר הדבקה ראשונית. ייצור הזדווגות והביצה מתרחש ביום 10 ואפשר לקצור תולעים בוגרות לתרבות ואוסף של חומרי הפרשה-הפרשה מday 14 3. ואילך H. polygyrus גם אינטראקציה עם מיקרופלורת commensal, עם לקטובצילוס המוגבר הנוכחית בעכברים נגועים רגישים 4-6, ורמות גבוהות של ח זיהום polygyrus בעקבות החשיפה של עכברים ללקטובצילוס 6. זיהום פעיל עם ח &#39; polygyrus הוכח כדי להגן מפני immunopathology במודלים של בעלי חיים רבים של אוטואימוניות 7-10, קוליטיס 11,12 והאלרגיה 13-16. כתוצאה מכך חל עניין רב בפוטנציאל של מולקולות טרמינל-הפרשה מטפיל זה (&quot;הס&quot;) ללמטה לווסת פתולוגיה in vivo 17,18. ואכן, השפעות מגנות נראות לאחר טיפול של עכברים עם מוצרי הס 19 דרך מסלולים אשר כעת עוברות זיהו 18,20. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצור אמין של polygyrus Heligmosomoides וההתאוששות של מוצרים המופרשיםשיכול להיות מנוצל נוסף עבור מגוון רחב של חקירות ביוכימיים וחיסוניות תפקודיות.

<table><tbody><tr><td>רכז Amicon</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>דגם 8050 50 מ"ל http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת של הנקס</td><td>סיגמא</td><td>H9394</td><td>500 מ"ל http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>סטרפטומיצין</td> <td>פניציליןInvitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 מ"ל http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 מ"מ 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>פחם פעיל</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 רשת http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>תמיסת גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 מ"ל 45% תמיסה http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>שפופרות בז</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 מ"ל http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>צלוחיות T25</td><td>סיגמא</td><td>CLS430639&nbsp;</td><td>בקבוק מאוורר 25 ס"מ http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>בדיקת LAL כרומוגנית</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 מ"ל; ללא L-גלוטמין http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

טיפוח<em&gt; heligmosomoides polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

polygyrus Heligmosomoides (שנקרא בעבר dubius Nematospiroides, וגם מכונה על ידי כמה כH. bakeri) הוא helminth עיכול שמעסיק מנגנוני המערכת החיסונית מרובים להקים זיהום כרוני בעכברים ובקירבת זיהומי helminth אנושיים נפוצים. H. polygyrus נחקר בהרחבה בתחום הרגולציה חיסונית הנגזר helminth וכבר מצא לדכא בעצמה מודלים ניסיוניים של אלרגיה ואוטואימוניות (שניהם עם מוצרים מופרשים מבודדים זיהום ופעיל). הפרוטוקול המתואר במאמר זה מתאר ניהול H. מחזור החיים polygyrus לייצור עקבי של זחלי L3, התאוששות של טפילים בוגרים, ואוסף של המוצרים שלהם ההפרשה-הפרשה (הס).

רגישות לזיהום עם ה &#39; polygyrus נשלט במידה רבה על ידי הרקע הגנטי של זן העכבר (טבלת 1); עכברי C57BL / 6 וCBA רגישים 21,22 מאוד. לתחזוקה של מחזור החיים טפילים, ההיברידי F1 בין שני זנים אלה נבחר ליכולתו לעמוד נטל תולעת הרבה יותר גבוה ללא תחלואה (נזק אפיתל במעי מוגזם) בהשוואה לאו מתח הורי. האוראלי gavage של 400 זחלי L3 משמש כדי לשמור על מחזור החיים בעכברי F1 (וכתוצאה מכך נטל תולעת בוגר שמוצג באיור 2), בעוד במינון של 200 זחלי L3 משמש בדרך כלל לניסויים בזנים טהורים הומוזיגוטים (למשל, C57BL / 6 או BALBc). עם זאת, מינון זה ייתכן שיהיה הצורך מופחת בהתאם לשיתוף גורמים סביבתיים שעלולות להיות שונה בין מתקני בעלי חיים, כגון שינויים בפלורת מעיים. קבוצות של הס הוכיחו אפי לשעתקcacy במבחנים פונקציונליים ובהרכב חלבון; יתר על כן, כאשר supernatants מכל שבוע של התרבות רצוף נותח, עד לסך של 4 שבועות, פרופילי החלבון נמצאו דומה מאוד (איור 3). כאשר ריכוז הס נמדד על ידי assay ברדפורד (ראה 5.5), הכולל חלבון הוא בדרך כלל כ 1 / מ&quot;ג מיליליטר (איור 4). שיטה חלופית של ריכוז הס היא עם רכז צנטריפוגלי (למשל קרום חתוך 3-kDa Vivaspin), שבו דגימות הם הסתחררו במהירות של עד 4,000 גר &#39;בצנטריפוגה הרוטור את נדנדה, הסרת מלחי חיץ ורכיבי משקל מולקולריים נמוכים. ריכוז צנטריפוגלי הוא מתאים ביותר לנפחים קטנים עיבוד (1-10 מיליליטר) ומוגבלים לגורם ריכוז מרבי של כ 30x. בעת איסוף הס, הימנעות מזיהום היא קריטית. כדי למנוע זיהום עם מולקולות מארח, אנחנו זורקים את הס-המשךaining תקשורת ותרבות מ24 שעות הראשונות לאחר קציר תולעת בוגר מהמעי העכבר. אנחנו גם לכמת את רמת זיהום LPS בכל אצווה של הס עם assay Chromogenic LAL (ראה 5.7). 1 U של LPS משווה ל ~ 100 pg LPS והרמות מתחת זה נחשבות זניח 23. בידיים שלנו, רוב קבוצות של הס באופן משמעותי מתחת לגבול זה, הריכוז הממוצע של LPS בהס להיות 0.23 U / מיקרוגרם (איור 5). ההשפעות של LPS במודלי in vivo של פתולוגיה (למשל דיכוי תגובות אסתמה) דורשת לפחות 10 ng של LPS 23. מכאן בממשל vivo של 5 מיקרוגרם הס מיצווה עם 100 pg LPS / מיקרוגרם הס יכלול 500 pg LPS, הרבה מתחת לריכוז היעיל בי LPS הופך לבעיה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> איור 1: מכשירי Baer Baermannהתקנת מכשירי מאן לאוסף של H. הבוגר polygyrus (כפי שתואר בסעיף 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> איור 2: ממוצע נטל תולעת 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 תולעת L3 זחלי Mean מכביד 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 זחלי L3. נקודות הנתונים המוצגות הן מ -19 סיבובים נפרדים של זיהום של עכברי C57BL / 6xCBA. ממוצע ± SEM מוצג. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> איור 3: פרופילי חלבון של הס משבועות רצופים בפרופיל SDS-PAGE תרבות של חלבוני הס שנאספו בשבועות רצופים של התרבות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> איור 4: </s<html> trong&gt; כמות סופית של הס מ -500 מדיה תשואה של חלבון הס מ -11 קבוצות שונות הנגזרות מכ -500 מיליליטר של supernatant התרבות המכיל ES מיליליטר. ממוצע ± SEM מוצג. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> איור 5: LPS זיהום של רמות הס של זיהום LPS ב 41 קבוצות של הס שנמדדו על ידי assay ameobocyte Limulus. ריכוז LPS חציון = 86 U למ&quot;ג של הס. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> איור 6: אנימציה סכמטי של H. סיכום polygyrus מחזור החיים של שלבי מחזור החיים של מפתח מgavage הפה של זחלי L3, דרך התאוששות של תולעי זחלים ומבוגרים לבידודה של הס. -together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig7highres.jpg" /> איור 7: אנימציה סכמטי של הס ופונקציות ההשפעות החיסונית מפתח של מתווכים מסיסים וexosomes הכילו בתוך הס. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> גנוטיפ (ומתח ברקע) </td><td> הפנוטיפ זיהום העיקרי </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> זנים טהורים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> / J, CBA, C3H </td><td> מאוד רגיש </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 וC57BL / 10 </td><td> רגיש </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / ג, DBA / 2, 129 / J </td><td> ביניים </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> רגישות נמוכה </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס לציטוקינים או קולטני ציטוקינים </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> רגיש יותר </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> רגיש פחות (א); לא חל שינוי ברגישות אך גרנולומות המוגברת (ב) </td><td> (א) 33 </td></tr><tr><td> (ב) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ הטרנסגניים (C57BL / 6) </td><td> עמיד </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> פוריות גבוהה יותר </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 או BALB / ג) </td><td> מאוד רגיש </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c או C57BL / 6) </td><td> מאוד עמיד </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 טרנסגניים(FVB) </td><td> עמיד </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Th2 הלקוי, ירד gormation granuloma </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / ג) </td><td> רגיש יותר </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / ג) </td><td> אין שינוי ברגישות </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Th1 הגבוה רגישות מוגברת, </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס עבור סמני תא T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / ג) </td><td> פוריות שולית גבוהה יותר </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / ג) </td><td> פוריות גבוהה יותר </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / ג) </td><td> ופוריות גבוהה יותר160 #; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס ללוקוסי חיסון מולדים </td><td></td></tr><tr><td> קולט מסוג 1 אינטרפרון (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> פוריות גבוהה יותר, יותר גרנולומות </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> יותר גרנולומות עמידה יותר, </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / WV (WBB6) </td><td> רגיש יותר </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: זיהומים ראשוניים עם ח &#39; polygyrus בזנים שונים עכבר וגן-targetted גנטיים.

polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה &#39; מחזור החיים polygyrus.

טיפוח<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאסוף ולנתח מולקולות המופרשות על ידי טפילים מסוג helmuth ארוכי חיים, אשר מדכאות את התגובות החיסוניות של המארח ובכך מאפשרות את הישרדות הטפילים. דבר זה מושג תחילה על ידי גידול הטפילים בסביבתם הטבעית, במערכת העיכול של עכברים. השלב השני הוא בידוד הטפילים הבוגרים מהעכברים לאחר ביצוע הקטלה הומנית (euthanasia).בשלב הבא, טפיל ה-helmuth גודל בתרבית רקמה בתווך גידול למשך עד שלושה שבועות, במהלכם הם משחררים כמויות רבות של מולקולות הפרשה והפרשה (excretory, secretory או ES). השלב הסופי הוא השחזור והריכוז של המולקולות ששוחררו מתוך עלומות התרבית למנות של ES לצורך בדיקות ביולוגיות וביוכימיות. בסופו של דבר, ניתן לבדוק את העלומות המרוכזות ישירות על סוגי תאים ספציפיים in vitro כדי לחקור שינויים בתפקוד תאי מערכת החיסון, או להחדירן לעכברים כדי לבחון את יכולתן לדכא אלרגיה והפרעות אחרות.הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר שמנו לב שדיכוי חיסוני קשור לזיהום בטפילים חיים, מה שמעיד על שחרור פעיל ומתמשך של מולקולות מדכאות חיסון מטפילים חיים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי זיהומים טפיליים, המולקולות שגילינו כמדכאות חיסון עשויות להיות יעילות מאוד בטיפול במחלות מפתח בעולם המערבי, כגון אלרגיה, אוטואימוניות ומחלה דלקתית של המעי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן השלבים להשגתו ועיבודו של טפיל הhelmuth הם ייחודיים למדי ודורשים תשומת לב מיוחדת לטכניקות של תרבית אספטית.עכברי F1 בני שמונה שבועות יודבקו בלרואות של *H. polygyrus* באמצעות הזנה דרך הפה (oral gavage) לצורך ייצור מחזור החיים של *H. polygyrus*. הכין תמיסת לרואות L3 של *H. polygyrus* בריכוז של 2000 למיליליטר של מים מזוקקים כפי שמתואר בפרוטוקול המצורף. ניתן לכל עכבר 400 L3 בנפח של 200 µL לפני כל הדבקה.יש להומוגנ את תרחיף הלרוואות על ידי הפיכה של חמש פעמים באמצעות מזרק של 1 ml עם מחט גבג' (gavage) ייעודית בעלת קצה מעוגל; שאבו 200 µl מתוך תרחיף הלרוואות. לביצוע הגבג' האוראלי, יש לקבע את העכבר בעמדה זקופה על ידי תפיסת עורף הצוואר, ולהחדיר בעדינות את מחט הגבג' הקהה דרך הפה והסביבון (וושט) אל תוך הקיבה. תולעים בוגרות וביצי טפילים יופקו מהעכבר.14 ימים לאחר ההדבקה, 14 ימים לאחר ההדבקה. תולעי *H. polygyrus* בוגרות נאספות מהעכברים באמצעות מכשיר Bayamon שעבר התאמה, שהוכן כפי שמוצג כאן. כדי להתחיל בהליך זה, שטפו את בטנו של בעל החיים שהורדם (euthanized) באתנול 70%.חתכו את העור מעל הבטן ומשכו אותו לאחור כדי לחשוף את דופן הבטן הקדמית. בצעו חתך בקו האמצע כדי להיכנס לחלל הפריטונאום. הוציאו את כל המעי הדק והמעי הגס, מהדוודנום הפרוקסימלי ועד הרקטום הדיסטלי.הניחו זאת בצלחת פטרי יבשה. יישרו את המעי לאורך כל אורכו, וגזרו את קולון המכיל את הצואה, והניחו אותו בצלחת נפרדת כדי להוציא ממנו ביצים מאוחר יותר. לאחר מכן, זהו את 20 הסנטימטרים הפרוקסימליים של המעי הדק המכילים את התולעים הבוגרות.הוא מאופיין בדופן עבה יחסית של התריסריון ולרוב בעל מראה אדום בשל התולעים שנמצאות בתוך הלומן. גזרו חלק זה מהמעי הדק והניחו אותו בתוך צלחת פטרי עם 5 mL של תמיסת Hank. חממו ל-37 °C באמצעות מספריים בעלי קצה עגול.פתחו לאורכה את חלק המעי הפרוקסימלי המלא בתולעים וגרדו את הדופן הפנימית של רירית המעי באמצעות שתי זכוכיות כיסוי. כדי להוציא את התולעים, השליכו את דופן המעי הנקייה. מלאו את המשפך בתמיסת Hank's.סגרו שקית מוסלין קטנה באמצעות סיכות, והעבירו אליה את התולעים משתי צלחות פטרי. הצמידו שתי שקיות מוסלין לכל משפך זכוכית וקבעו את השקיות באמצעות מהדקי נייר סביב שולי המשפך. הניחו את המערכת באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה עד שעתיים.במחצית זמן האינקובציה, נער את המכשיר בעדינות כדי לשחרר שיירי רקמה מההכנה של המעי שעלולים לסתום את מסנן המוזלין. יש להיזהר לא לשפוך שיירי רקמה מחוץ לשקית המוזלין, שכן הדבר יגרום לזיהום בהכנת ה-HES הסופית. בסיום האינקובציה, נתק בזהירות את מבחנת האיסוף מצינור הגומי המחבר מעל כיור באמצעות פיפטה פלסטית, העבר את התולעים למבחנה של 50 milliliter ואפשר להן לשקוע בכוח הכבידה.הסיר את המצע באמצעות פיפטת פסטור (stripette). הוסף 40 milliliters של תמיסת Hank's והמתן עד שהתולעים ישקעו. חזור על הפעולה חמש פעמים, לסך הכל שישה שטיפות. הימנעות מזיהום של תרבית הערפל (haze culture) היא קריטית להצלחת פרוטוקול זה.יש לשמור על תרבית התולעים סטרילית מהשלב הזה ואילך. העבירו למנדף זרימה למינרית ושטפו את תרבית התולעים שש פעמים נוספות בתמיסת Hank's סטרילית, המועשרת באנטיביוטיקה, באמצעות פיפטה, ואספו שתי דגימות של 20 µL לצורך ספירת התולעים הבוגרות שהוחזרו. ביום ה-14 לזיהום, צפוי כי כ-50% מכמות ה larvae שהוחדרו יאספו ביצים, לצורך גירוד הצואה מהמעי הגס שהוצא קודם לכן באמצעות פינצטה.בשלב הבא, ערבב את הצואה עם פחם גרנולרי ביחס של לפחות אחד לאחד. כדי להגיע לעקביות שמאפשרת הצמדה למסמך נייר, יש להוסיף כמות מספקת של פחם. מרח שכבה דקה במרכז דף נייר סינון לח בתוך צלחת פטרי, והנח זאת בתוך קופסה לחה וחסינת אור כדי לשמור על חשיכה למשך 12 עד 14 ימים.החל מהיום השביעי, התחילו באיסוף זחלים משלב L3. צרו טבעת מסביב לקצה נייר הסינון. הרימו את נייר הסינון מתוך צלחת הפטרי והשתמשו בפיפטה, ב-5 milliliters של מים סטריליים לכל צלחת, כדי לשטוף את הזחלים שנותרו על הצלחת.העבירו את הזחלים למבחנה של 50 מיליליטר. החזירו את נייר הסינון לצלח והניחו אותו שוב בחושך; חזרו על איסוף הזחלים על בסיס שבועי למשך עד חודש אחד. לאחר מכן, שטפו את הזחלים שנאספו כפי שמתואר בטקסט הפרוטוקול ואחסנו אותם בטמפרטורה של 4°C במים מזוקקים.כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השרו את התולעים בכ-10 milliliters של תמיסות Hank, בתוספת 10% gentamicin למשך 20 דקות, כאשר המבחנה מונחת בזווית כדי להבטיח שהתולעים יהיו מכוסות במלואן לאחר 20 דקות. שטפו את התולעים שש פעמים עם תמיסות Hank בתוספת אנטיביוטיקה, והעבירו את התולעים לבקבוקי T 25 מאווררים. הניחו את הבקבוקים במצב זקוף באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שלושה שבועות, להכנת תוצרי הפרשה והפרשה (excretory secretory products) או HES מהתולעים.תרבית המכילה HES. המדיה נאספת מהתרביות במרווחים של לא יותר מפעם אחת בשבוע, ומוחלפת בנפח שווה של h polyus Media בכל פעם. יש לשמור כל דגימה בנפרד ולסמן אותה בבירור עם התאריך ומספר האצווה, בשל פוטנציאל גבוה יותר לזיהום ב-LPS ובחלבוני המאכסן.יש להפריש את האיסוף הראשון לאחר 24 שעות של תרבית ולעבד אותו בנפרד או להשליכו. יש לצנטריפוג את המדיום המכיל HES ב-400 ×g למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאיב את המדיום באמצעות מזרק של 50 milliliter והעבר אותו דרך מסנן בעל קישור חלבוני נמוך של 0.2 micron אל מבחנות של 50 milliliter. לאחר מכן, יש לרכז את ה-HES Supena המאוחד באמצעות מסנן עם סף חיתוך של 3000 molecular weight במכשיר אולטרה-פילטרציה תחת לחץ חנקן; כדי להכין את מכשיר הסינון, יש לשטוף תחילה את ממברנת ה-3 kilo Dalton, כאשר הצד המבריק פונה כלפי מטה, בביקר של one liter עם מים מזוקקים תוך כדי ערבוב.הרכיבו את התקן לאולטרה-פילטרציה בהתאם להוראות היצרן, כאשר הצד המבריק של ממבנה הסינון פונה כלפי מעלה. הניחו את ההתקן במקרר בטמפרטורה של 4°C והעבירו דרכו 50 milliliters של מים מזוקקים לפני תחילת ריכוז ה-HES שנמזג. הקפידו מאוד לא להניח לממברנה להתייבש במהלך הסינון. הוסיפו כל מבחנה של HES להתקן הסינון לפי הצורך, עד שנפח הדגימה ירוכז ל-2 עד 5 milliliters, וזאת כדי להסיר חומצות אמינו ומרכיבים אחרים של מצע תרבית הרקמה.מתוך תכשיר ה-HES, יש להוסיף 50 milliliters של PBS נקי מפירוגנים למכשיר הסינון ולאחר מכן לרכז עד לנפח של כ-two milliliters. חזור על שלב זה פעמיים. באמצעות כמות כוללת של 150 milliliters של PBS, העבר את ה-ES למזרק ובצע סטריליזציה באמצעות סינון עם מסנן של 0.2 micron.לאחר מדידת ריכוז החלבון, יש לסמן את המנת המדידה במספר האצווה ובתאריך, ולהקפיא בטמפרטורה של 80°C- . גavage אוראלי של 400 L משלוש לרוות משמש לשמירה על מחזור החיים של H poly gyus בעכברי F1. עומסי התולעים הבוגרות שהתקבלו מוצגים כאן.מנות של HES הוכיחו יעילות הדירה במבחנים תפקודיים ובהרכב החלבונים. יתרה מכך, כאשר נותחו תלתים מכל שבוע עוקב של תרבית, נמצא כי פרופילי החלבון דומים מאוד למשך תקופה של עד ארבעה שבועות בסך הכל. כאשר ריכוז TS נמדד באמצעות בדיקת Bradford, כמות החלבון הכוללת היא בדרך כלל כ-1 mg/mL.מוצגת תנובת חלבון HES מ-11 מנות שונות שהופקו מכ-500 milliliter של עלי-נוזל תרבית. מניעת זיהום היא קריטית בעת איסוף HES, כאשר רמות זיהום LPS ב-41 מנות של HES נמדדו באמצעות בדיקת limbus AAMI CYTE. נמצא כי רוב מנות ה-HES היו נמוכות באופן משמעותי מסף הזיהום המומלץ.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על טכניקה סטרילית קפדנית בהקמת התרביות. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי בהתאם להליך זה. ניתן לבצע שיטות נוספות כגון פרוטאומיקה, הפרדת חלבונים (protein fractionation) וניתוח של גליקנים, ליפידים ו-microRNAs כדי להבין באופן מלא את מגוון המוצרים המולקולריים המופרשים מטפילים אלו.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להרבית את poly limus. Moid הוא polyus, ויש לאסוף מוצרי DS מהתולעים הבוגרות שגודלו לצורך בדיקת השפעותיהם על מערכת החיסון. אף שטפיל זה אינו מזיק לבני אדם, חשוב להקפיד על אמצעי בטיחות ולפעול בהתאם לפרוטוקול המפורט כדי להבטיח הדירות בין סבבי ה-Hess.

cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

זיהום Trichuris muris הוא מודל מעיים של חסינות Th2 שבו עכברים עמיד ליצור תגובת Th2 מגן עכברים רגישים ליצור תגובה פתולוגית Th1.

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

המטרה של מצגת זו היא להוכיח in vivo ובטכניקות מבחנה לגידול של נמטודות entomopathogenic. בvivo שיטות לשקול הגידול של נמטודות אלה עם מארח חרק, ואילו השיטות במבחנה לנצל מדיה אגר עשירה.

In vivo ו במבחנה גידול של Entomopathogenic נמטודות (Steinernematidae וHeterorhabditidae)

נמטודות Caenorhabditis פראי קשורים חיידקים רבים, לעתים קרובות לומן המעיים או להדביק את המעי. פרוטוקול זה מפרט שיטה להעשרת חיידקים בלתי ניתנים לחישוב המתיישבים במעי, תוך ניצול ההתנגדות של עור דאואר.

ניקוי סלקטיבי של נמטודות קנורהבדיטיס פראיות להעשרה לחיידקי מיקרוביום מעיים

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

נמטודות אנטומופתוגניות חיות בסימביוזה עם חיידקים ויחד הן מדביקות בהצלחה חרקים על ידי ערעור מערכת החיסון המולדת שלהן. כדי לקדם את המחקר על הבסיס הגנטי של זיהום נמטודות, מתוארות שיטות לשמירה ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות.

תרבות ומניפולציה גנטית של נמטודות אנטומופתוגניות

תאי T ו-ILC2 המבטאים IL-9 מושרים במהלך זיהום ב-N. brasiliensis , אך האפיון שלהם התעלם במידה רבה במעי הנגוע בשל התדירות הנמוכה והקינטיקה הדיפרנציאלית שלהם. פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאים אלה מאיברי מטרה שונים ואישור זהותם באמצעות ציטומטריית זרימה בשלבי זיהום שונים.

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

סטרונגילואידס ראטי היא נמטודה טפילית הגורמת לזיהומים חולפים בעכברי מעבדה, ומציגה שלבי נדידת רקמות וחיי מעיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשמירה על מחזור הטפילים בחולדות והדבקה ניסיונית בעכברים, כולל כימות טפילים בראש, בריאות ובמעי.

זיהום ניסיוני של עכברים בנמטודה הטפילית Strongyloides ratti

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

אנו מציגים שתי שיטות לחקלאים להתרבות המונית של נמטודות אנטומופתוגניות כקוטלי חרקים ביולוגיים. השיטה הראשונה משתמשת בג'ל פוליאקרילאמיד כמצע גידול הנמטודות, בעוד שהשנייה משתמשת בצמר גפן מצופה פולימר כמצע הגידול. שתי השיטות מתבססות על התרבות נמטודות בתוך גופות חרקים.

רבייה מבוססת גידול בחיים של נמטודות אנטומופתוגניות

למדו כיצד לטפח את הנמטודה Heligmosomoides polygyrus בעכברים ולבודד מולקולות מופרשות בעלות תכונות מדכאות חיסון. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני דיכוי חיסוני ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

טיפוח

גלה סרטונים נוספים