שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת שינויים מהירים בהידבקות מטריצת התא בתאי אנדותל שנחשפו לחומרים משני מטריצה בזמן אמת באמצעות עכבת מצע התא והדמיית תאים חיים. בניסוי זה, האנזים heme myelo peroxidase משמש כחומר משנה מטריצה רלוונטי מבחינה פתופיזיולוגית. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של משטחים עם פיברונקטין כדי לספק מצע מטריצת דבק.

לאחר מכן מותר למיו פרוקסידאז או MPO להיקשר לפיברונקטין. לאחר מכן, תאי אנדותל תלויים יושבים על המשטחים ומודגרים כדי להשיג חיבור תאים מקסימלי ולהתפשט על הפיברונקטין. לאחר מכן התאים נחשפים למי חמצן על מנת ליזום חמצון פיברונקטין בתיווך NPO.

השינויים המהירים הבאים בהידבקות מטריצת התא מכומתים לאחר מכן בזמן אמת באמצעות עכבת מצע התא וניתוח הדמיית תאים חיים. התוצאות מראות כי ניתן לכמת הפסדים מהירים בהידבקות מטריצת תאי האנדותל המופעלים על ידי חמצון פיברונקטין בתיווך NPO, בזמן אמת ברזולוציה זמנית גבוהה ובאופן נטול תווית על ידי עכבת מצע התא והדמיית תאים חיים. ובכן, היתרון של טכניקות אלה הוא שהן יכולות לכמת שינויים בהידבקות מטריצת התא באופן רציף ברזולוציה זמנית גבוהה, וזה אומר שהן יכולות לספק תובנות חדשות וחשובות לגבי האופן שבו שינויים במטריצות מניעים שינויים במורד הזרם במורפולוגיה של התאים ובתהליכי איתות תלויי הידבקות.

לפרוטוקולים יש משמעות רחבה יותר בכך שניתן להתאים אותם בקלות על ידי החלפת MPO בחומרים אחרים לשינוי מטריצות, כגון מטריצה לשער, פרוטאזות, או על ידי שימוש בסוגי תאים דבקים שאינם תאי אנדותל כגון תאי אפיתל. כדי להתחיל, הוסף 80 מיקרוליטר לבאר פיברונקטין לציפוי מערכי מיקרו אלקטרודות זהב 96 בארות למדידות עכבת מצע התא, או הוסף שני מיליליטר של פיברונקטין לצלחות תרבית תאים תחתונות זכוכית לניתוח הדמיית תאים חיים. דגרו את המערכים ו/או את כלי התרבות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר מכן כדי לחסום את המשטחים, הוסיפו 0.2% BSA ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות. לאחר מכן, הוסף את הפרוקסידאז האנושי המטוהר שלי ב-HBSS ודגירה למשך 30 דקות. לאחר מכן השתמש ב-HBSS כדי לשטוף את המשטחים פעמיים כדי להסיר כל MPO לא קשור.

לאחר מכן, ראה 250,000 תאים למיליליטר של תאי אנדותל תלויים שהוכנו על פי פרוטוקול הטקסט על 96 תאי באר מערכי מיקרו אלקטרודות עכבת מצע עם משטחים מצופים פיברונקטין מקורי או MPO. לכלי תרבית תאים עם תחתית זכוכית 35 מילימטר, הוסיפו שני מיליליטר של 500,000 תאים למיליליטר. מיד לאחר הזריעה התאים הרכיבו את לוחות מערך המיקרו אלקטרודות על יציאת חממת העכבה של מצע התא ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

וקח קריאות ריקות כדי ליזום רכישה מתמשכת של נתוני אינדקס תאים. העבירו את כלי תרבית התאים התחתונים מזכוכית בגודל 35 מילימטר לחממת פחמן דו חמצני של 35 מעלות צלזיוס 5%. דגירה במשך שעתיים כדי לאפשר חיבור והתפשטות מקסימליים של התאים.

לאחר הדגירה, השהה את קריאות אינדקס התאים והסר לזמן קצר את לוחית מערך המיקרואלקטרודות או הסר את צלחת הזכוכית התחתונה מהחממה, שאב את ה-SNAT והוסף HBSS מחומם כדי לבחון את ההשפעות של מעכבים, מודולטורים של MPO, תגובות מזורזות או מעכבי איתות תאים. הוסף אותם לתרבויות. בשלב זה, הנח מיד את לוחית המערך בחזרה ליציאת החממה או את צלחת הזכוכית התחתונה לתוך החממה ואפשר לתאים להתייצב למשך 30 דקות.

כדי ליזום חמצון פיברונקטין תלוי חומצה היפוכלורית והידבקות של NPO למחקרי עכבת תאים, הסר את לוחית מערך המיקרואלקטרודות מהחממה והשהה את מדידות אינדקס התא. הוסף מי חמצן ל-HBSS וערבב בעדינות על ידי פיפטינג חוזר, הרכיב מיד מחדש למערך המיקרו-אלקטרודות בחזרה ליציאת החממה והפעל מחדש את קריאות אינדקס התאים למחקרי הדמיית תאים חיים באמצעות צלחות עם תחתית זכוכית 35 מילימטר. לאחר הוצאת המנה מהחממה, היא מותקנת על במה מחוממת של 37 מעלות צלזיוס של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, המצוידת בעדשת אובייקט מים פי 63.

ואופטיקה DIC להקלטת סרטי תאים חיים, התמקד בתאים ובצע אופטיקה של DIC בהתאם להנחיות המוזכרות כאן. התחל סרט DIC והקלט קריאות בסיס של תאים לא מטופלים למשך דקה אחת, ולאחר מכן הוסף מי חמצן וערבב בעדינות על ידי פיפטינג חוזר, מקד מחדש את המיקרוסקופ והמשך להקליט סרטי DIC של התאים המטופלים לפרק הזמן הנדרש. כדי לנתח נתוני עכבת מצע תא, התחל בייצוא הנתונים לגיליון אלקטרוני להדבקה של תאים.

מחקרים מנרמלים נתונים על ידי הגדרת ערכים שנרשמו מיד לפני התחלת חמצון פיברונקטין בתיווך NPO לנתונים נוכחים כעלילות של אינדקס תאים מנורמל לעומת זמן לניתוח נתוני הדמיה של תאים חיים. סרטי הדמיית תאים חיים של DIC שהוקלטו מיד לפני ואחרי התחלת חמצון פיברונקטין בתיווך MPO בתוכנית ניתוח תמונה כגון תמונה J בשני סרטי DIC נפרדים לפחות, בחר באופן אקראי תאים מרובים ומדוד את השטח המוקרן שלהם במסגרות עוקבות על ידי מעקב ידני אחר קצה הממברנה שלהם וכימות מספר הפיקסלים הסגורים. לבסוף, הציגו את הנתונים כעלילה של שטח תא מנורמל לעומת זמן, הישיבה של תרחיפי תאי אנדותל על פיברונקטין או MPO הנושא פיברונקטין מביאה להתקשרות תאים מקסימלית והתפשטות תוך שעתיים כפי שנשפט על ידי מישור ערכי אינדקס התא במצע התא.

מדידות עכבה, ברגע שנוצרת הידבקות תאים מקסימלית על פיברונקטין מקורי או נושא NPO, חמצון פיברונקטין ממוקד בתיווך חומצה היפוכלורית מזורזת של NPO ומופעל על ידי הוספת NPOs cos substrate מי חמצן גורם לירידה מהירה בשטח הפנים של מגע מטריצת התא הנמדדת על ידי עכבת מצע התא ועל ידי הדמיית תאים חיים כפי שמוצג כאן, ההידבקות התאית המהירה הנראית בתאי האנדותל הקשורים לפיברונקטין הנושא NPO בתגובה לטיפול במי חמצן נעדרת בתאים שטופלו במי חמצן בלבד. עיכוב של תפקוד מוטורי דו-מוטורי של מיוזין עם סטטינים של BLEs מעכב את קצב ההידבקות של תאי האנדותל הנמדד על ידי עכבת מצע התא, ועל ידי הדמיית תאים חיים המזהה כי הידבקות והתכווצות תאית בתגובה ל-MPO מזרז חמצון מטריצה תת-תאית מונע על ידי כוחות מתיחה של מיוזין ACTO. מכיוון ששיטות אלו יכולות למדוד במדויק שינויים מהירים מאוד בהידבקות התאים, הן יכולות לתת תובנה קריטית לגבי הקשרים הסיבתיים בין שינויי הידבקות ושינויים במורד הזרם בתהליכי איתות תלויי הידבקות כגון זרחון SARK או איתות הידבקות מוקדי, שניתן למדוד בקלות בניסויים מקבילים לאורך זמן באמצעות Western Blotting.