שימוש בעכבת Cell-מצע והדמיה של תא חי כדי למדוד שינויים בזמן אמת בסלולרית הידבקות ודה-הידבקות הנגרמים על ידי מטריקס שינוי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת שינויים מהירים בהיצמדות תאים למטריצה בתאי אנדותל החשופים לחומרי שינוי מטריצה בזמן אמת, תוך שימוש בעכבה (impedance) של תאי המצע ודימות תאים חיים. בניסוי זה, אנזים ההם myelo peroxidase משמש כחומר לשינוי מטריצה בעל רלוונטיות פתופיזיולוגית. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי משטחים בפיברונקטין כדי לספק מצע מטריצה דביק.

לאחר מכן מאפשרים למיו-פרוקסידאז (MPO) להיקשר לפיברונקטין. בשלב הבא, תאים אנדותליאליים תלויי-מרחף מיושבים על פני השטח ומודגמים כדי להשיג היצמדות תאית מקסימלית והתפרסות על הפיברונקטין. לאחר מכן, התאים נחשפים למימן פראוקסיד כדי להניע חמצון של הפיברונקטין בתיווך MPO.

השינויים המהירים העוקבים בהיצמדות התאים למטריצה נמדדים לאחר מכן בזמן אמת באמצעות עכבת תא-תשתית (cell substrate impedance) ואנליזה של דימוי תאים חיים. התוצאות מראות כי אובדן מהיר של היצמדות תאי אנדותל למטריצה, שמוגמר על ידי חמצון פיברונקטין המתווך על ידי NPO, ניתן לכימות בזמן אמת ברזולוציה זמנית גבוהה ובאופן שאינו דורש סימון, באמצעות עכבת תא-תשתית ודימוי תאים חיים. יתרונם של טכניקות אלו הוא היכולת לכמת שינויים בהיצמדות התאים למטריצה באופן רציף וברזולוציה זמנית גבוהה, ופירוש הדבר הוא שהן יכולות לספק תובנות חדשות וחשובות לגבי האופן שבו שינויים במטריצה מניעים שינויים המשכיים במורפולוגיית התא ובתהליכי איתות התלויים בהיצמדות.

לפרוטוקולים יש חשיבות רחבה יותר בכך שניתן להתאימם בקלות על ידי החלפת MPO בסוכנים אחרים למודולציה של המטריצה, כגון מטריקס גייטאר (matrix to gating), פרוטאזות, או על ידי שימוש בסוגי תאים נצמדים שאינם תאי אנדותל, כגון תאי אפיתל. לתחילה, הוסיפו 80 µL לבאר של פיברונקטין לציפוי מערכי מיקרו-אלקטרודות מזהב של 96 בארות למדידות עכבה של תשת תאיים, או הוסיפו 2 mL של פיברונקטין לכלי תרבית תאים בעלי תחתית זכוכית לניתוח דימות של תאים חיים. דגרו את המערכים ואת כלי התרבית בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים.

כדי לחסום את המשטחים, הוסיפו 0.2% BSA והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים נוספות. לאחר מכן, הוסיפו my peroxidase אנושי מופק ב-HBSS והדגירו למשך 30 דקות. לאחר מכן, השתמשו ב-HBSS כדי לשטוף את המשטחים פעמיים להסרת MPO שאינו קשור.

בשלב הבא, זרוע 250,000 תאים למילליטר של תאי אנדותל תלויים שהוכנו לפי הפרוטוקול הכתוב, על מערכי מיקרו-אלקטרודות למדידת עכבת תשתית תאים בעלי 96 בארות, עם משטחים מצופים בפיברונקטין טבעי או הנושא MPO. עבור צלוחיות תרבית תאים בעלות תחתית זכוכית של 35 מילימטר, הוסף שני מיליליטר של 500,000 תאים למילליטר. מיד לאחר זריעת התאים, הצמד את לוחות מערכי המיקרו-אלקטרודות ליציאת האינקובטור למדידת עכבת תשתית תאים ב-37 °C ו-5% carbon dioxide.

בצעו קריאות רקע כדי להתחיל רכישה רציפה של נתוני מדד התאים (cell index). העבירו את צלחות השקיעת התאים עם התחתית הזכוכית בגודל 35 מילימטר למדגרה בטמפרטורה של 35 °C ו-5% carbon dioxide. הדגירו למשך שעתיים כדי לאפשר היצמדות והתפשטות מקסימלית של התאים.

לאחר הדגירה, הפסיקו את קריאות מדד התאים (cell index) והוציאו לזמן קצר את פלטת מערך המיקרו-אלקטרודות או את צלחית הזכוכית מהמדגרה, שאבו את ה-snat והוסיפו HBSS מחומם כדי לבחון את השפעותיהם של מעכבים, מווסתים של MPO, תגובות זרזיות או מעכבי איתות תאי. הוסיפו אותם לתרביות. בנקודה זו, החזירו מיד את פלטת המערך לפתח המדגרה או את צלחית הזכוכית למדגרה והמתינו 30 דקות להגעה לשיווי משקל של התאים.

כדי להתחיל את החיסון של הפיברונקטין התלוי בחומצה היפוכלורית המזורזת על ידי NPO לצורך מחקרי עכבה תאית, הוצא את לוח מערך המיקרו-אלקטרודות מהאינקובטור והשהה את מדידות מדד התאים (cell index). הוסף מי פחמן (hydrogen peroxide) ל-HBSS וערבב בעדינות על ידי פיפטינג חוזר; מיד לאחר מכן, החזר את מערך המיקרו-אלקטרודות לפתח האינקובטור והחדש את קריאות מדד התאים למחקרי דימוי תאים חיים באמצעות צלחות עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר. לאחר הוצאת הצלחת מהאינקובטור, מקם אותה על במה מחוממת ל-37 °C של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, המצויד בעדשת אובייקטיב 63x עם טבילה במים.

ובאופטיקה של DIC להקלטת סרטים של תאים חיים, התמקדו בתאים ואופטימיזציה של אופטיקת ה-DIC בהתאם להנחיות המוזכרות כאן. התניחו את הקלטת ה-DIC והקליטו קריאות בסיס של תאים לא מטופלים למשך דקה אחת, לאחר מכן הוסיפו מימון פחמימנית (hydrogen peroxide) וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג חוזר, התמקדו מחדש במיקרוסקופ והמשיכו בהקלטת סרטי DIC של התאים המטופלים למשך פרק הזמן הנדרש. כדי לנתח נתוני עכבה (impedance) של תשתית התאים, התחילו בייצוא הנתונים אל גיליון אלקטרוני עבור הדבקות תאים.

מחקרים מנרמלים את הנתונים על ידי הגדרת הערכים שנרשמו מיד לפני תחילת חמצון הפיברונקטין המתווך על ידי MPO כערך אחד, ומציגים את הנתונים כגרפים של מדד תאים (cell index) מנורמל לעומת זמן כדי לנתח נתוני דימות של תאים חיים. פתחו סרטוני דימות של תאים חיים בשיטת DIC שהוקלטו מיד לפני ואחרי תחילת חמצון הפיברונקטין המתווך על ידי MPO בתוכנה לניתוח תמונות כגון Image J; בלפחות שני סרטוני DIC נפרדים, בחרו תאים מרובים באופן אקראי ומדדו את השטח המוקרן שלהם בפריים-ים עוקבים על ידי שרטוט ידני של קצה הממברנה וכימות מספר הפיקסלים הכלואים. לבסוף, הציגו את הנתונים כגרף של שטח תא מנורמל לעומת זמן. השקעת תרחיפי תאי אנדותל על פיברונקטין או על פיברונקטין הנושא MPO מובילה להיצמדות והתפשטות מקסימלית של התאים בתוך שעתיים, כפי שניתן להסיק מהגעה למישור (plateau) בערכי מדד התאים על תשתית התא.

מדידות עכבה (Impedance), לאחר שהושגה היצמדות תאית מקסימלית על פיברונקטין טבעי או כזה הנושא NPO, מראות כי חמצון ממוקד של פיברונקטין, המתווך על ידי חומצה היפוכלורית המזורזת על ידי NPO ומופעל על ידי הוספת מימן פרוקסיד כסובסטרט של NPOs, גורם לירידה מהירה בשטח הפנים של מגע התא עם המטריצה, כפי שנמדד בעכבה בין התא לסובסטרט ובדימוי תאים חיים. כפי שמוצג כאן, התנתקות תאית מהירה הנראית בתאי אנדותל הקשורים לפיברונקטין הנושא NPO בתגובה לטיפול במימן פרוקסיד, אינה קיימת בתאים שטופלו במימן פרוקסיד לבדו. עיכוב של תפקוד מנוע myosin two באמצעות BLEs statin מעכב את קצב התנתקות תאי האנדותל, כפי שנמדד בעכבה בין התא לסובסטרט ובדימוי תאים חיים, מה שמעיד כי התנתקות תאית והתכווצות בתגובה לחמצון סוב-סלולרי של המטריצה המזורז על ידי MPO מונעות על ידי כוחות מתיחה של ACTO myosin. מכיוון ששיטות אלו יכולות למדוד במדויק שינויים מהירים מאוד בהיצמדות התאים, הן יכולות לספק תובנה קריטית לגבי הקשרים הסיבתיים בין שינויים בהיצמדות לשינויים במורד בתהליכי איתות תלויי-היצמדות, כגון פוספורילציה של SARK או איתות של היצמדות מוקדית (focal adhesion signaling), שניתן למדוד בקלות בניסויים מקבילים לאורך זמן באמצעות Western blotting.